Name: エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶ光遺伝学的手法による齧歯類急性脳切片における特定シナプスの電気生理学的特性評価と可塑性解析のプロトコル。長距離経路の選択的活性化とシナプス生理の詳細な理解に有用です。

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この作業は、Wellcome grant 206401/Z/17/Zによってサポートされています。Zafar Bashir 氏の専門家による指導と、技術支援と原稿へのコメントを提供してくれた Clair Booth 博士に感謝します。

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著者は開示するものは何もありません。

ここで紹介するプロトコルは、光遺伝学的構築物をコードするAAVを送達する定位固定手術と急性脳スライスにおける電気生理学の組み合わせを使用して、高度に特異的な長距離シナプス投影を探索する方法を説明しています(図1)。これらの技術を組み合わせることで、従来の非特異的な電気刺激ではアクセスできなかった長距離および解剖学的に拡散した経路において、脳回路の生理学と可塑性を高精度で特徴付けるツールが提供されます。細胞特異的分子マーカーとの組み合わせは、ある脳領域から別の領域23における異なる規定された細胞集団への投影の特徴付けを可能にする。
この手法の高精度性を最大限に活かすためには、経路特異性の検証が不可欠です。これはいくつかのステップで行われます。記録中に、調査中のシナプスがモノシナプスであることを確認します(ステップ3.3.5)。これに続いて、注射部位を組織学的に調べて、ウイルスが目的のシナプス前領域に限定されていることを確認し、バイオシチン染色されたシナプス後細胞の位置と形態を評...

シナプスの生理機能や可塑性変化を理解することは、健康な脳1で脳ネットワークがどのように機能し、脳障害でどのように機能不全になるかを理解するための基本です。急性 ex vivo 脳スライスの使用は、全細胞パッチクランプ記録を使用して、高い信号対雑音比で単一ニューロンからのシナプスの電気的活動の記録を可能にする。膜電位の制御と簡単な薬理学的操作により、受容体サブタイプの単離が可能になります。これらの記録は、層流および亜領域位置2、細胞形態3、分子マーカーの存在4、その求心性突起5、または最近活動的であった場合でも、シナプス後ニューロンを識別するための絶妙な特異性で行うことができます6。
しかし、シナプス前入力の特異性を達成することは、やや困難です。従来の方法では、刺激電極を使用して、特定の椎弓板を走る軸索を励起していました。この例は海馬で、放射状層の局所刺激がCA3からCA1サブフィールド7に投射するシナプスを活性化します。この場合、シナプス前特異性は、CA3入力がCA1錐体細胞8に突出する放射状層内に位置する唯一の興奮性入力を表すため、達成される。しかし、CA3-CA1軸索の従来の電気的シナプス前活性化で達成可能なこの高度な入力特異性は、このシナプスが受けてきた熱心な研究に反映されている例外です。他の脳領域では、複数の求心性経路からの軸索が同じ椎弓板、たとえば新皮質9の層1に共存しているため、従来の刺激電極では入力特異的なシナプス前刺激が不可能になります。異なるシナプス入力が異なる生理学的特性を有する可能性があるため、これは問題である。したがって、それらの共刺激はシナプス生理学の誤った特徴付けにつながる可能性があります。
チャネルロドプシン-2(ChR2)などの感光性膜タンパク質(オプシン)の遺伝的コードであるオプトジェネティクスの出現により、脳領域間の孤立したシナプス投影を研究する可能性が大幅に拡大しました10,11。ここでは、長距離シナプス生理学と可塑性を研究するための一般化可能で低コストのソリューションについて説明します。光遺伝学的構築物は、ウイルスベクターを使用して非常に特異的な方法で送達され、目的のシナプス前領域の非常に正確な制御を可能にします。遠心性突起は、ターゲット領域でこれらの繊維の活性化を可能にする光活性化チャネルを表現します。したがって、従来の非特異的な電気刺激では独立して活性化できない長距離の解剖学的に拡散した経路を研究することができます。
我々は、経路の例として、興奮性陽イオンチャネルオプシンをコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)による内側前頭前野(mPFC)の形質導入について説明する。次に、外側嗅内皮質(LEC)からの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびグルタミン酸作動性mPFC-LEC突起の光誘発活性化について説明します(図1)。また、シナプス前関心領域の位置を確認するための注射部位の組織学的評価とシナプス後細胞の形態の同定についても説明します。

<table><tbody><tr><td>0.2 mLチューブ</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro;Lピペット</td><td>ギルソン</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>3ウェイルアーバルブ</td><td>コールパーマー</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-ジアミノベンジジン(DAB)基質</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>40倍対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-アミノピリジン</td><td>Hello Bio</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>4倍対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>ウイルス力価: 3.3x1013 GC/ml</td></tr><tr><td>アクロマティックレンズ</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>49363</td><td>視覚スペクトルと近赤外</td></tr><tr><td>卓上型微量遠心機</td><td>ベンチマーク・サイエンティフィック</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス キャピラリー</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Burr</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>カメラ - Qimaging Retiga Electro</td><td>Photometrics</td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Carbachol</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>クロルヘキシジン外科用スクラブ</td><td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>Clippers</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC スーパー 2 速 取り外し可能なブレード クリッパー</td></tr><tr><td>コリメーション コンデンサー レンズ</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>データ収集デバイス</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー 500 nm ロングパス</td><td>Edmund Optics</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー 600 nm ロングパス</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラーキューブ</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ミルポア</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>サイドポート付き電極ホルダー</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルター</td><td>Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>励起フィルター</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>アイジェル</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>ファインペイントブラシ</td><td>科学研究所用品</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr><td>ギロチン</td><td>ワールド精密機器</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>イソペンタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-グルコン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>キネマティック蛍光フィルターキューブ</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>LEDドライバー</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン軟膏</td><td>Teva</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>マイクロドリル</td><td>ハーバード装置</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ電極プーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシリンジニードル</td><td>ハミルトン</td><td>7803-05</td><td>カスタム仕様:ゲージ33、長さ15mm、ポイントスタイル4 - 12&deg;</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシリンジポンプ</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>取り付け 青色LED</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>取り付け 緑色LED</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td></td> <td>SFH4550スライスの屈折IRイメージングに使用され、微分干渉コントラスト(DIC)光学系は、別の一般的に使用される方法です</td></tr><tr><td>OCT媒体</td><td>VWRインターナショナル</td><td>RAYLLAMB / OCT</td><td>最適切断温度媒体</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプ増幅器</td><td>分子デバイス</td><td>700A</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>World Precision Instruments</td><td>Ministar</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>Recording chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade</td><td>Swann Morton</td><td>#24</td><td></td></tr><tr><td>Slice anchor</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26-GH/15</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置フレーム</td><td>Kopf</td><td>Model 902</td><td></td></tr><tr><td>マイクロドリル用脳定位固定装置ホルダー</td><td>ハーバード大学装置</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>OPMI 1 FR プロ</td><td></td></tr><tr><td>縫合</td>糸 <td>エチコン</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>細胞内記録用シリンジフィルター溶液</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸テトロドトキシン</td><td>Hello Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>正立蛍光顕微鏡</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD DAPI付き退色防止封入剤</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>ベクタステイン ABC-HRPキット</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr>ビ<td>ブラート</td><td>カムデンインスツルメンツ</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td></td> <td>https://www.winltp.com/ バージョン2.32</td><td>データ収集ソフトウェア</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショ糖切断液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞内?</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

脳内の特定のシナプスの生理学的特性と、それらがどのように可塑性変化を受けるかを研究することは、現代の神経科学における重要な課題です。従来の in vitro 電気生理学的手法は、電気刺激を使用してシナプス伝達を誘発します。この方法の主な欠点は、その非特異的な性質です。刺激電極の領域内のすべての軸索が活性化され、効果を特定の求心性結合に帰することを困難にする。この問題は、電気刺激を光遺伝学ベースの刺激に置き換えることで克服できます。オプトジェネティクスと in vitro パッチクランプ記録を組み合わせる方法について説明します。これは、解剖学的に定義された正確なシナプス接続の基礎シナプス伝達とシナプス可塑性の両方を研究するための強力なツールであり、脳内のほぼすべての経路に適用できます。ここでは、げっ歯類脳の目的のシナプス前領域(内側前頭前野)への外科的注射のためのチャネルロドプシンタンパク質をコードするウイルスベクターの調製と取り扱い、および下流の標的領域(外側嗅内皮質)の急性スライスの作成について説明します。パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、短期および長期のシナプス可塑性を研究するための詳細な手順も提示されます。光遺伝学とCre依存性細胞標識を組み合わせることで経路特異性や細胞特異性を実現する実験例について議論する。最後に、目的のシナプス前領域の組織学的確認は、シナプス後細胞のビオシチン標識と共に記載され、正確な位置および細胞型のさらなる同定を可能にする。

このプロトコルでは、光遺伝学的構築物のウイルス送達を使用して、長距離シナプス生理学と可塑性を研究する方法について説明します。このプロトコルは、脳内のほぼすべての長距離接続の研究に非常に簡単に適応できます。一例として、ラットmPFCへのオプシンをコードするAAVの注入、LECからの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびLECにおけるmPFC末端の光誘発活性化について説明します(図1)。
健康な錐体細胞が位置し、パッチを当てた(例えば、図3A)。本mPFCからLECの例では、シナプス後細胞は標識されていなかった。シナプス後細胞の同定が必要な場合は、蛍光マーカーを発現する細胞を広視野光学系を用いて局在化させる必要があります(例:図3B)。細胞の健康状態は、実験の前に赤外線光学系によって評価する必要があります。LECのmPFC軸索を活性化するために、顕微鏡対物レン...

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

ウイルス的に送達された光遺伝学的構築物は、急性脳スライスにおける特定のシナプスの生理学および可塑性の詳細な電気生理学的特性評価を可能にする。シナプスを光遺伝学的に活性化する主な利点は、長距離経路を研究する能力と、解剖学的に分離されていない軸索の選択的刺激です。手順を実演するのは、私たちの研究室の研究員であるリサ・キナバネ博士です。まず、ハミルトンシリンジを、定位固定装置フレームに取り付けられた可動アームに取り付けられたマイクロインジェクションシリンジポンプにロードします。次に、5マイクロリットルのウイルスアリコートをマイクロ遠心分離機に入れます。チューブを数秒間回転させ、2マイクロリットルのウイルス製剤をチューブの蓋にピペットで入れます。シリンジにウイルス製剤を充填するには、手術用顕微鏡で針先を表示します。次に、ウイルスのボーラスを針の先端に手動で配置し、ポンプコントロールを使用してシリンジプランジャーを引き出します。ポンプの噴射量を300ナノリットル、流量を毎分100ナノリットルに設定します。ポンプを作動させ、針先のウイルスの飛沫を観察して適切な流れを確認します。綿棒でウイルスを吸収し、70%エタノールで針をきれいにします。次に、脳定位固定装置フレームのアジャスターネジを使用して、針先をブレグマに移動し、フレームの3つのバーニアスケールで観察された定位固定装置測定値をメモします。これらの距離をブレグマ座標から加算または減算します。脳定位固定装置アームに取り付けられたマイクロドリルを使用して、頭蓋骨表面にバリ穴を開けます。所定の背腹座標で脳に針を挿入し、所定量のウイルス製剤を注入する。注入後、ボーラスの拡散を可能にするために針をその場で10分間放置します。.次に、針を取り外し、ポンプを作動させて、針が詰まっていないことを確認します。ウイルス注射の2週間後、ラットを安楽死させ、脳全体を急速に解剖し、それをスクロース切断溶液に移す。金属製のティースプーンを使用して、脳を拾い上げ、余分な溶液を捨てて、ろ紙の上に置きます。メスを使用して小脳を取り除き、冠状平面の大脳をその長さのほぼ半分まで切断します。後半分はLEC組織ブロックです。組織ブロックと残りの脳をスクロース切断溶液に戻します。次に、シアノアクリレート接着剤を一滴ビブラトームステージに置き、それを薄層に広げます。次に、小さじ1杯を使用して、LECティッシュブロックを選び、前冠状カットが付着するように接着剤パッチに移します。ステージをビブラトーム組織チャンバーに取り付け、組織を沈めるのに十分なスクロース切断溶液を素早く注ぎます。組織ブロックの腹面をブレードに向けた後、ゆっくりとしたブレードの進行速度を使用して、腹側から背側までの厚さ350マイクロメートルのスライスを切ります。通常、半球ごとに7つのスライスを取得できます。スライスをスライス収集チャンバーに移します。次に、収集チャンバーを摂氏34度の水浴に1時間入れてから、室温に戻します。脳の残りの部分をパラホルムアルデヒドに48時間入れます。標的細胞を同定するには、スライスを記録チャンバーに入れ、スライスアンカーを使用して固定化します。低倍率で、赤外線照明を使用して、LECレイヤー5に移動します。次に、高倍率の水浸対物レンズに変更し、錐体ニューロンを特定します。モニター上のセルの位置をテープでマークします。次に、全細胞パッチクランプを形成し、ホウケイ酸ガラスマイクロピペットを作製し、細胞内記録液を充填した。充填したマイクロピペットを電極ホルダーに入れ、電極ホルダーのサイドポートに接続されたマウスピースに強く吹き付けて陽圧を加えます。メニスカスが形成されるように顕微鏡の対物レンズを持ち上げ、顕微鏡で見ることができるまで電極をメニスカスに挿入します。シールテストウィンドウを開き、ピペット抵抗が3〜5メガオームかどうかを確認します。次に、識別した細胞をピペットチップで触れ、細胞膜にくぼみが生じます。次に、マウスピースで吸引して負圧を加え、ピペット抵抗を増加させます。細胞膜が破裂するまで徐々に負圧をかけ続け、細胞全体の静電容量過渡現象が発生します。現在のクランプ構成に入るには、フィルターキューブと適切な光学系を備えた顕微鏡の光路に向けられたLEDを使用し、40倍の対物レンズを介してスライスに光パルスを印加します。シナプス前放出特性を調べるために、5ヘルツ、10ヘルツ、および20ヘルツで複数の光パルスの列を送達します。バイオシチンがニューロンを満たすことを可能にするために、細胞全体の構成に入った後少なくとも15分間待つ。電圧クランプでは、膜の容量と入力抵抗を監視します。次に、細胞の体細胞から離れたアプローチ角度に沿ってピペットをゆっくりと引き出し、静電容量トランジェントと膜電流のゆっくりとした消失を観察し、細胞膜の再シールとピペットチップでのアウトサイドアウトパッチの形成を示します。スライスを24ウェルプレートのパラホルムアルデヒドに入れ、一晩インキュベートします。OCT培地を用いて、組織ブロックをクライオスタット標本ディスクに貼り付ける。組織を凍結するには、イソペンタンを適切な容器に入れ、標本ディスクを沈め、組織がイソペンタンのレベルより上にあることを確認します。次に、イソペンタンの容器を液体窒素に下げ、組織を凍結させます。組織が完全に凍結したら、組織ブロックをマイナス20°Cのクライオスタットチャンバーに30分間放置して、ブロックの温度を平衡化させます。平衡化後、クライオスタットで厚さ40マイクロメートルの切片を切り取り、細かい絵筆を使用して切片を刃から導きます。これらの凍結切片を室温のポリL−リジン被覆ガラス顕微鏡スライドに付着させ、該切片にスライドを接触させる。各スライドに150マイクロリットルの封入剤を加えた後、カバースリップを適用し、カバースリップを軽く押して気泡を取り除きます。光退色から保護するためにスライドを覆い、12時間風乾させます。次に蛍光顕微鏡を用いて、ウイルス注入部位の位置を調べる。バイオサイトチン染色では、スライスをPBS中の3%過酸化水素中で30分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。次に、酸素の泡が見えなくなるまで、脳スライスをPBSで洗います。次に、0.1%Triton X-100を含むPBS中の1%アビジンビオチン化HRP複合体溶液中でスライスを3時間インキュベートします。6回のPBS洗浄後、ニューロン構造のバイオシチン染色が見えるようになるまで、各スライスをDAB溶液中でインキュベートします。スライスを冷たいPBSに移して反応を停止します。次に、ブラシを使用してスライスをガラス顕微鏡スライドに取り付けます。余分なPBSを除去した後、封入剤を追加します。カバースリップを使用してスライスを覆い、前に示したように風乾させます。健康な錐体細胞が見つかり、パッチが適用されました。シナプス後細胞の同定が必要な場合は、蛍光マーカーを発現する細胞を広視野光学系を用いて局在化させる必要があります。2ミリ秒の単一光パルスは、単純な波形光遺伝学的興奮性シナプス後電位をもたらした。シナプスの短期間の可塑性は、5、10、および20ヘルツの光刺激を適用することによって調べられます。長期可塑性を調べながら、コリン作動性アゴニストカルバコールを循環aCSFに10分間添加すると、リガンドを除去してから40分後にも明らかな長期のうつ病を引き起こしました。注射部位の長さを組織学的に調べた。蛍光レポーターmCherryは、辺縁前皮質および下皮質のより深い層に局在していた。さらに、ビオシチン充填細胞を染色すると、その位置と形態が確認されました。このプロトコルの重要なステップは、求心性脳領域の正確な形質導入であり、これは事後検証可能であり、急性スライスを準備する際の脳の迅速な解剖である。この手順は、特定の介在ニューロンサブクラスなどの個々の細胞型の蛍光標識と容易に組み合わせることができます。これを行うには、その特定の細胞型でリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物を使用します。ウイルス的に送達された光遺伝学的構築物は、システムおよび回路神経科学の分野で急速な進歩を可能にしました。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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マウスデフォルトモードネットワークの縦方向多モーダル電気生理学記録を可能にする大型再封閉可能な頭蓋窓の手術プロトコル

学ぶ光遺伝学的手法による齧歯類急性脳切片における特定シナプスの電気生理学的特性評価と可塑性解析のプロトコル。長距離経路の選択的活性化とシナプス生理の詳細な理解に有用です。

エクスビボ内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

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