Summary
Een techniek wordt gepresenteerd voor de in-vivo collectie van interstitiële vloeistof monsters van weefsel relevante sites (hier, experimenteel ontstoken huid) voor het meten van biochemische bemiddelen pijn en ontsteking.
Abstract
Deze in-vivo menselijke bioassay kan worden gebruikt om menselijke vrijwilligers en patiënten te bestuderen. Monsters worden verzameld van relevante sites, zoals weefsel van de huid via aseptisch ingebracht microdialyse katheters (Dermal Dialyse, Erlangen, Duitsland). Geïllustreerd in dit voorbeeld is het verzamelen van interstitiële vocht uit experimenteel ontstoken huid in menselijke vrijwilligers. Monsterneming kan gecombineerd worden met andere experimentele tests. Bijvoorbeeld, de gelijktijdige beoordeling van lokaal vrijgegeven biochemicaliën en subjectieve gevoeligheid voor pijnprikkels in experimenteel ontstoken huid biedt de kritische biochemische-gedragsmatige link naar biomarkers van pijn en ontsteking te identificeren. Gepresenteerd assay in de levende menselijke organisme zorgt voor mechanistisch inzicht in de weefsel-specifieke processen die ten grondslag liggen pijn en / of ontsteking. De methode is ook zeer geschikt om de effectiviteit van bestaande of nieuwe interventies te onderzoeken - zoals de nieuwe kandidaat-geneesmiddelen - gericht op de behandeling van pijnlijke en / of ontstekingen. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van het gebruik van microdialyse technieken voor het verzamelen van interstitiële vloeistof uit experimenteel ontstoken huid laesie van de menselijke proefpersonen. Interstitiële vloeistof monsters worden meestal verwerkt met behulp van multiplex bead array-immunoassays waardoor het testen van maximaal 100 analyten in monsters zo klein in volume als 50 microliter.
Protocol
Inductie van experimentele ontsteking:
- Een van de eerste graad zonnebrand is veroorzaakt in niet-gebruinde huid van een dij met behulp van een gekalibreerd, ultraviolet B bron (Saalmann multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Duitsland). De verbranding door de zon wordt veroorzaakt 24 uur vóór het begin van een microdialyse experiment door het toepassen van drie maal het bedrag van de UVB-licht nodig is om volledige roodheid van de blootgestelde huid, of drie keer de minimale erytheemdosis (MED) veroorzaken. De MED wordt bepaald in elk vak voor de aanvang van de studie. Accurate levering van energie is verzekerd met een UV-meter (RM 12, Dr Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Duitsland).
Katheter en sample collectie:
- Bereid een staging omgeving met steriele handschoenen, een steriele naald de houder, 1cc luer tip injectiespuit met een 23 gauge (G) naald, 1cc spuit met een 30G naald, 1% lidocaïne, in alcohol gedrenkte doekjes, 2x2 steriele gaasjes, microdialyse katheters bevestigd aan een einde aan een 4cm 23G naald (Dermal Dialyse, Erlangen, Duitsland), en 1,5 ml Microcent collectie tubes (E & K Scientific, Santa Clara, CA.) met 4μl proteaseremmer oplossing per 100μl monster op droog ijs. proteaseremmer oplossing wordt gemaakt per instructie fabrikant en met gebruikmaking proteaseremmer cocktail tabletten (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Duitsland).
- Bereid een 1% humaan albumine oplossing in Ringerlactaat en trek het in de 1cc luer tip spuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen die nog in de spuit.
- Plaats de spuit met de 1% humaan albumine-verrijkte lactaat Ringer's in de houder (microdialyse multi-spuit rack, Harvard Apparatuur, Zuid-Natick, MA) gemonteerd op een hoge precisie infusiepomp (Pump 22, Harvard Apparatuur, Zuid-Natick, MA ). Zorg ervoor dat de bar van de infusiepomp het besturen van de spuit volledig in contact komt met de zuiger van de spuit. Stel de pomp tarief na bevestiging dat de injectiespuit diameter correct is ingevoerd in de pomp. Veelgebruikte infusiesnelheden variëren tussen 2 tot en met 4μl/min.
- Definieer het gebied dat u van plan om je monster te verzamelen. Bij de bemonstering van een kunstmatig gecreëerde ontstoken gebied, zoals de zonnebrand hierboven beschreven, een plan op het inbrengen van de katheter aan de rand van de zonnebrand.
- Schoon een klein gebied op tegenovergestelde randen van de laesie, of de site u van plan bent om je monster te verzamelen, met alcohol. Deze gereinigd gebieden zullen de beoogde inbrengen en exit punten voor de katheter worden. Injecteer net genoeg lidocaïne intra-cutaan (bewezen door bleking van de huid op de injectie) op deze sites een zeer kleine blaar (maximaal 2mm) te maken. Injectie van een dergelijke beperkte hoeveelheid van de intra-cutane lidocaïne bij de in-en uitgangen van de microdialyse catheter mag geen invloed op de resultaten van de bioassay maar het inbrengen van de katheter aanzienlijk minder pijnlijk voor proefpersonen te maken.
- Met behulp van aseptische technieken, plaatst u de microdialyse katheters met behulp van bijgevoegde 23G naald over de lengte van de verkend huid. De diepte van inbrengen is op het snijvlak van cutis en subcutis. Invoegen op een adequaat diepte kan optisch worden gecontroleerd. Als de naald en de bijgevoegde katheter naar voren verplaatst de naald moet leiden tot een beetje up-vouwen van de huid evenals enkele bleking van de huid. Geen bloeden te voorkomen. Als bloeden optreden doet dit geeft aan dat de naald is dieper dan de bedoeling is gelegen en de diepte van het inbrengen moet worden aangepast. Zodra de naald werd geduwd door de uitgang van de huid, spoel de katheters met 1% albumine verrijkt lactaat Ringer's tot je druppels langs de lengte van de katheter. Dit wordt gedaan door het zorgvuldig inbrengen van de naald einde van een spuit (23G naald) in het distale uiteinde van de microdialyse catheter, en langzaam injecteren oplossing.
- Na het spoelen van de katheter voorzichtig aan de naald om de bijgevoegde catheter voeden via de huid. Voorzichtige behandeling is nodig omdat de katheters zijn kleine diameter, en dus kwetsbaar. Trek de katheter totdat deze volledig schroefdraad door de huid, dat wil zeggen, de basis van de grotere plastic buis inbedding van het distale uiteinde van de katheter raakt de huid op de ingang. Zoals hierboven vermeld, weinig tot geen bloeden aan het einde van de procedure bevestigt optimale catheter plaatsing.
- Bevestig het distale uiteinde van de katheter aan de top van de 23G naald van de spuit rusten in het rek van de infuuspomp. Zorg is nodig om te voorkomen dat aanprikken van de naald door de wand van de katheter, die zou leiden tot potentiële lekken.
- Snijd de naald uit de proximale uiteinde van de katheter.
- Met behulp van ¼ inch roze tape, sluit u de 1,5 ml bereid Microcent collectie tube op de huid dicht bij de afrit site van de katheter. Plaats de tip van de katheter in de collectie buis voor het verzamelen van microdialysate mogelijk te maken. Start de perfusie pomp op vooraf bepaalde rat en met tussenpozen controleren dat de geleverde en verzameld volume match-up. In het geval dat de volumes niet met elkaar overeenkomen, lekkage van de huid entry site moet worden uitgesloten (kan soms worden opgelost door te trekken het gedeelte van de katheter dat is ingesloten door de plastic buis meer stevig op de huid entry site). Als alternatief kan een katheter moet worden vervangen als geleverd en verzamelde volumes niet met elkaar overeenkomen.
- Zodra bemonstering is voltooid, worden de monsters die op droog ijs tot opslag bij -80 º C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gecombineerde gebruik van microdialyse technieken en multiplex immunoassay technologie is een waardevolle real-time, in-vivo menselijke bioassay inzicht te geven in biochemische gebeurtenissen in weefsel van belang. Gecombineerd met gedragstesten, zoals pijn tests, de methode maakt het mogelijk het bestuderen van de complexe interacties van biochemicaliën bemiddelen pijn en ontsteking. De methode is veelbelovend voor 1) het identificeren van weefsel-specifieke biomarkers bemiddelen pijn en ontsteking, 2) het verstrekken van mechanistisch inzicht in de pathologie van de ontstekings-en chronische pijn voorwaarden met perifere weefsel pathologie, en 3) het verkennen van pijnstillende / anti-hyperalgesisch en anti-inflammatoire werking van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen en interventionele therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis catheter | Tool | Dermal Dialysis | NA | |
| Pump 22 | Tool | Harvard Apparatus | 552219 | |
| Saalmann Multitester SBB LT 400 | Tool | Saalmann GmbH | NA | |
| RM-12 IP-65 Radiometer | Tool | Dr. Grobel UV Elektronik GmbH | 82120000/81112100 | |
| Complete Proteinase Inhibitor | Reagent | Roche Group | 11836145001 | |
| Microcent tube | Tool | E&K Scientific | 380150-X | |
| Albumin 5% | Reagent | ZLB Behring | NA | |
| Lactated Ringer | Reagent | Hospira Inc. | NA | |
| Xylocaine-MPF | Other | AstraZeneca | NA | |
| Syringe 1mL | Tool | BD Biosciences | 309602 |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study. Pain. 139, 15-27 (2008).
