Summary
Nós descrevemos um processo que utiliza laser de captura de microdissecção para isolar e extrair RNA de uma população de células homogêneas, neurônios piramidais, na camada III do giro temporal superior em cérebros post-mortem humano. Nós posteriormente linearmente amplificar (T7-based) mRNA, e hibridizar a amostra para o ser humano Affymetrix X3P microarray.
Abstract
Propusemos a investigar a redução da substância cinzenta no giro temporal superior visto em pacientes com esquizofrenia, interrogando perfis de expressão gênica de neurônios piramidais da camada III. É sabido que o córtex cerebral é uma estrutura extremamente heterogênea compreendendo diversas regiões, camadas e tipos de células, cada qual é caracterizado por composições distintas celular e molecular e perfis de expressão, portanto, diferencial de genes. Para contornar os efeitos de confusão de heterogeneidade de tecidos, foi utilizado laser de captura de microdissecção (LCM), a fim de isolar os nossos neurônios específicos de células do tipo ie piramidal.
Cerca de 500 neurônios piramidais corados com a solução de coloração Histogene foram capturados usando o Arcturus XT sistema LCM. RNA foi então isolado a partir de células capturado e passou por duas rodadas de T7 baseado em amplificação linear usando Arcturus / kits Molecular Devices. O LabChip Experion (Bio-Rad) e gel electrofograma indicados de boa qualidade uma RNA (m), com um comprimento estendendo transcrição 600nt passado necessários para microarrays. A quantidade de mRNA obtido média de 51μg, com a pureza da amostra aceitável dizer como indicado pela relação A260/280, de 2,5. Expressão gênica foi retratado usando o Human X3P série sonda GeneChip da Affymetrix.
Protocol
1) o corte do tecido:
Obtivemos o tecido necessário (controle n = 9, esquizofrenia n = 9) a partir do Centro de Recursos Harvard tecido cerebral, pareados por idade, sexo e postmortem intervalo (PMI) (Tabela 1). Blocos de vapor de nitrogênio líquido foi de aproximadamente 3mm de espessura foram retiradas de área de Brodmann 42 (giro temporal superior).
Antes de iniciar a coloração de neurônios piramidais, as condições devem ser otimizados a fim de obter melhor tecido "levantar" e qualidade de RNA de alta. "Levantar" o tecido descreve o processo durante a laser de captura de microdissecção, onde os neurônios marcados para a captura de aderir a tampa e estão separados enquanto o tecido remanescente é deixado para trás.
Otimização:
- A fim de reduzir a atividade RNase, o que compromete a qualidade RNA, tratar todas as superfícies, incluindo a área de trabalho, corte de lâmina e slides com uma solução de descontaminação RNase, como RNase Zap, além de limpar-se com 100% de etanol.
- Seção do tecido com o criostato fixado em -17 ° C. Isso reduz o gradiente de temperatura entre a temperatura ambiente (slides), o criostato, e que o gelo seco (ver todo o processo a seguir). Se a temperatura estiver abaixo de -20 ° C, os cortes de tecidos tendem a fragmentar, tornando-os inutilizáveis. Superior, e os aumentos gradiente de temperatura, o que pode comprometer a integridade do RNA.
- As seções devem ser 8μm de espessura, como as seções mais espessas acabará por comprometer a "levantar" o tecido. Esta espessura também permite a identificação correta de neurônios piramidais para captura.
- Use lâminas de vidro liso sem carga (por exemplo, slides Histogene LCM) como estes não interferem com "levantar" o tecido durante o processo de captura a laser. Slides de membrana também pode ser usado, mas estes são mais adequados para isolar estruturas de tecido de grande porte, como a membrana tende a levantar um pouco durante o processo de captura a laser, aumentando assim o infravermelho (IR) o tamanho do ponto laser e diminuindo a especificidade celular.
- Montar duas seções por lâmina de vidro, como mais de duas seções por slide poderia comprometer a qualidade do RNA, devido à constante variação de temperatura durante o processo de corte.
- Após a secção, coloque imediatamente as lâminas em uma caixa de lâminas micro em gelo seco, a fim de preservar a integridade do RNA. Caixas de slide contendo as seções do cérebro são posteriormente armazenadas a -80 ° C até ser transformado.
Nós já determinou que para os neurônios piramidais, de 500 células por caso são adequados a fim de adquirir RNA suficiente para hibridização microarray. Aproximadamente quatro seções são necessárias para cada caso, principalmente devido ao corte e coloração artefatos.
2) A coloração de neurônios piramidais:
Identificação de neurônios piramidais é obtida com a solução de coloração Histogene rápida e kit, pois nos permite visualizar estes neurônios, sem a exposição prolongada a soluções aquosas, preservando assim RNA.
- Prepare-se para o procedimento de coloração adicionando inibidor da RNase 1μl por 100μl de solução de coloração (por exemplo, Promega) a fim de limitar a atividade RNase. Quatro seções (2 slides), exigem 4μl de RNase inibidor adicionado 400μl da solução de coloração Histogene em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (conservado em gelo). Para cada seção, usamos 97μl desta solução, o que nos dá uma mancha adequada para identificar neurônios piramidais.
- Prepare série desidratação e xileno: 25ml alíquota do etanóis apropriado na tinas de coloração fornecido com o kit Histogene, ou seja, 2x75%, 95%, 100% e 2 frascos de RNase água. Coloque todos os jars em um balde de gelo, com exceção de um frasco de 75%, que colocam você no freezer -20 ° C. Sob uma coifa, adicione peneiras moleculares no frasco Xileno para remover o excesso de água, o que poderia comprometer "levantar" o tecido.
- Ligar o banho-maria (ou bloco de aquecimento) com a temperatura a 42 ° C e colocar um tubo de Falcon 50ml apoiado por um rack em banho-maria.
- Remova os dois slides de -80 ° C e descongelar-los em um KimWipe por aproximadamente 30 segundos, ou apenas até os cantos dos slides começam a descongelar.
- Brevemente corrigir os slides no etanol 75% por 30 segundos no congelador -20 C °. Transferir as lâminas entre tinas de coloração usando RNase-zapped fórceps para reduzir a contaminação.
- Depois de uma lavagem de 30 segundo em água livre de nuclease, as seções podem ser contornadas com uma caneta barreira PAP, a fim de concentrar a solução da seção, porém com a lâmina de vidro comum não é absolutamente necessário.
- Manchar a quatro seções com a solução de coloração Histogene por 20 segundos, com 97μl do inibidor de mancha / RNase por seção. Posteriormente, desidratar as seções na etanóis previamente preparado com gelo, por 30 segundos por passo. A etapa final, o etanol 100% deve ser estendido a três minutos, A fim de alcançar a desidratação suficiente para adequada do tecido "levantar" e captura para as tampas de LCM.
- Mergulhe as lâminas em Xilol por 5 minutos e ar seco em uma capela-por mais 5 minutos antes da captura.
Os passos de coloração deve ser feita apenas se a laser capturar imediatamente a seguir. Todas as soluções devem ser trocadas a cada 4-6 slides, a fim de evitar a contaminação e garantir a desidratação adequada.
3) Única célula microdissecção a laser de captura de:
Após a coloração, neurônios piramidais da camada III são removidas usando laser de captura de microdissecção, com o sistema XT Arcturus e software. Resumidamente, o sistema funciona por pulsos de laser ajustável força IR através de um filme termoplástico localizada na base de uma tampa, resultando na extensão / distensão do filme diretamente sobre as células de interesse. Quando a tampa é levantada a partir do tecido, as células permanecem capturados / cativo na tampa. Um resumo pictórico é dada na Figura 1.
Antes de iniciar este procedimento, é importante distinguir entre os dois tipos de tampas disponíveis com este sistema. Enquanto o limite CapSure Macro é geralmente utilizado para a captura de estruturas maiores tecidos, as tampas CapSure HS são projetados para capturar um pequeno número de células individuais e, portanto, estes limites tem uma menor área de superfície designada para a captura. As tampas HS também têm trilhos que impedem a tampa de estar em contato direto com a secção de tecido, enquanto a tampa da Macro não. Esses trilhos de reduzir o efeito de dobradura de tecidos que podem afetar ou induzir variabilidade de tamanho do ponto (do pulso de laser) como a tampa da Macro fica diretamente sobre o tecido dobrado, desigual. Para o nosso procedimento, foram utilizados os tampões HS para tirar proveito de sua capacidade de reduzir o efeito de dobradura de tecido, mas manteve as configurações cap macro no software, a fim de maximizar a área capturada como estamos capturando um grande número de células.
- Carregar os slides e bonés para o aparelho XT Arcturus. Use as tampas CapSure HS, mas mantenha a configuração do programa em Macro. Clique na caixa "Carregar com visão global" para obter uma foto panorâmica de cada slide.
- Ajustar o brilho / foco na ampliação de 2x, a fim de determinar qual seção seria ótimo para o laser de captura. Evitar cortes de tecido dobrável com excessiva, mas sim escolher as seções que estão intactos, suave e bem corados, especialmente perto da região de interesse ou seja, camada III.
- Em seguida, coloque uma tampa sobre a área geral onde estaremos captando, certificando-se de incluir layer III. Ainda na ampliação 2x, certifique-se que os trilhos cap não repousam sobre qualquer dobras, pois isso irá inclinar a tampa.
- Em seguida, confirmar a localização do ponto do laser IR manualmente na ampliação de 40x. Se o ponto (vermelho feixe) não se correlaciona com a cruz azul, isso pode ser ajustado pelo botão direito do mouse no local e selecionando "spot localizado IR".
- Em 40x, podemos começar a identificar neurônios piramidais de acordo com os seguintes critérios (1) as células que estão em forma piramidal e (2) a porção proximal dos dendritos apicais e / ou basal são identificáveis (Fig. 1A).
Vamos agora ajustar a potência ea duração do pulso de laser, a fim de capturar os neurônios piramidais. Isto é particularmente importante, pois determina a especificidade da célula capturados, além do número de células capturado. Se o pulso está muito fraco nem todos os neurônios identificados serão capturados, enquanto que se o pulso for muito forte pode captar que envolve as células dos tecidos / que não seja o neurônio sozinho. Geralmente, com as especificações de tecidos e células empregada aqui, a força laser (70mW) ea duração resultado (16msec) em um tamanho de ponto de 25μm, aproximadamente em linha com o tamanho dos neurônios piramidais (Figura 1B). No entanto, essas configurações são ajustadas para cada seção, a fim de obter aproximadamente o tamanho mesmo local por caso. Se o "lift" é comprometida, pode-se sempre aumentar o número de células capturados, a fim de manter a quantidade de RNA obtido a partir de cada caso comparáveis. No entanto, não se esqueça de manter o seu tempo de captura, incluindo a coloração em 1,5 horas, como mais do que isso pode comprometer a qualidade do RNA.
- Primeiro salvar a posição da tampa, clicando no sinal de mais na função de posição. Dessa forma, se por qualquer motivo, devemos remover a tampa e depois precisa colocá-lo de volta no mesmo local, a tampa vai sempre voltar ao local precisamente o mesmo que você ajuste o tamanho do ponto para.
- Digite esses valores na caixa de controle: 70 em energia e 16 em duração. Desmarque o "auto move palco" opção, e certifique-se que o símbolo tamanho certo correlaciona-se com o símbolo no painel à direita.
- Selecione a opção círculo (parte inferior direita) para selecionar um neurônio que você gostaria de testar a captura, e depois ativar o laser, clicando emem "spot test IR".
- O local feita pelo laser deve em primeiro lugar tem um anel crisp escuro ao redor do objeto capturado. Se este anel é muito clara, a célula não foi capturado. Se houver uma mancha escura no meio do anel escuro, então a força laser / duração é muito grande, e pode ter um efeito negativo sobre o presente RNA na célula capturada. Certifique-se que o anel é grande o suficiente para abranger a célula, mas pequeno o suficiente para que ele não inclui o tecido não desejado ou outras células.
- Repita o processo em diferentes partes do tecido dentro da camada que você deseja capturar, para verificar se o tamanho do ponto não difere, dependendo da localização. Ajustar em conformidade.
- Uma vez que o ponto do laser foi ajustado, continuar a identificar neurônios piramidais para captura. Nós identificamos cerca de 500 células por amostra, o que resulta em aproximadamente 500PG de RNA total por amostra. Nós também costumam usar apenas uma seção, a fim de reduzir a quantidade de tempo de captura, como a tampa tem que ser reajustado para cada seção. Depois de ter identificado todas as células que você precisa, pressione o botão de laser captura e todas as suas células serão automaticamente capturados na tampa (Fig. 1C).
- Uma vez que todas as células têm sido capturado, mova a tampa para uma parte diferente do slide que não contém uma seção. Volte para onde as células foram capturados e certifique-se que pelo menos 90% dos neurônios foram removidas. Se não, não tente recuperar as mesmas células, mas localizar a área onde a maioria das células foram capturados, e capturar mais células na mesma área. Mova a tampa para a estação de QC.
- Coloque a tampa no tubo de microcentrífuga de 0,5 ml da Applied Biosystems (cat. # N8010611) contendo 50ml de tampão de extração (PicoPure RNA Isolation kit). A tampa foi projetada para se encaixar perfeitamente neste tubo específicas para prevenir buffer de vazamento.
- Vire o conjunto de cabeça para baixo, certificando-se que o tampão de extração cobre a tampa inteira, e colocá-lo no fundo do tubo Falcon de 50ml já presentes no conjunto de banho-maria a 42 ° C. Os neurônios são incubados por 30 minutos, a fim de remover o tecido da tampa.
- Depois disso, centrifugar o tubo e conjunto da tampa por 2 minutos a 800 g. Retire a tampa e guardar o extracto de células restantes a -80 ° C até a extração de RNA. Como precaução extra, você pode re-examinar a tampa na estação QC sobre o aparelho de laser de captura para garantir que todos os neurônios foram removidos a tampa em si.
4) A obtenção de RNA a partir de populações neuronais específicas:
Pode-se ir diretamente da captura para o isolamento, ou descongelar a amostra armazenada no freezer -80 C °. Em nosso experimento, primeiro coletadas todas as amostras necessárias e guardou a -80 ° C antes de prosseguir para RNA isolamento.
Isolamento do RNA é realizada utilizando o Kit de isolamento PicoPure, que é projetado para isolar um pequeno número de células de amostras de LCM e para manter baixa abundância de mRNA. Geralmente, seguimos o protocolo que está incluído com o kit. Abaixo, damos uma descrição básica do processo.
- Após o descongelamento, adicionar etanol 70% (fornecido com o kit) e centrifugar em uma coluna de purificação de pré-condicionado, a fim de vincular o RNA para o filtro de coluna.
- Depois de lavar, tratar o RNA com DNase, a fim de assegurar a remoção completa de DNA para eliminar o risco de interferência de DNA. Esta etapa é particularmente importante em aplicações a jusante, como em tempo real qRT-PCR.
- Após a digestão do DNA, há uma outra etapa de lavagem. Verifique se não tampão de lavagem permanece na coluna antes de transferir para outro tubo de microcentrífuga, como qualquer presença do tampão na sua amostra final vai resultar em menos de partida para a amplificação de RNA. Para garantir isso, centrifugar a etapa de lavagem final para 2,5 minutos em vez de dois minutos, conforme sugerido no protocolo fornecido.
- Finalmente, tampão de eluição ea placa é incubada no filtro na coluna por 1 minuto seguido por centrifugação, a fim de eluir o RNA total.
- Pipeta 1.3ul de cada uma das amostras em tubos de 0,5 ml em separado para executar um Experion HighSens LabChip. Congele o restante da amostra a -80 ° C.
Controle de qualidade é muito importante quando se isolar RNA, especialmente quando a quantidade for pequena ea quantidade necessária, como para experiências microarray (15μg), é grande. O RNA extraído, portanto, devem ser submetidos a controle de qualidade em vários pontos do tempo em todo o processo. A primeira ocorre após a extração. Nós estabelecemos a integridade RNA total por meio de exame macroscópico dos picos 18S/28S do eletroferogramas e gel virtual gerado por Experion HighSens LabChip. Este método é rápido e fornece dois meios de medições para verificar RNA com qualidade de um electroferograma e um gel virtual (Fig. 2). Se a qualidade do RNA total é relativamente bom (Fig. 2A, B vs C, D), que prossiga com linearmente amplificar o mRNA, que responde por cerca de 2% do RNA total.
5) amplificação linear:
Amplificação do RNA extraído de laser-capturada tecidos é necessária para produzir uma quantidade adequada de RNA para a hibridização microarray subseqüentes e qRT-PCR experimentos. A fim de minimizar a possibilidade de confunde potencial registou com T7 baseado em amplificação linear, minimizamos o número de rounds de amplificação necessário, maximizando o valor da partida laser-capturada materiais tecido.
Nossos dados preliminares (não apresentados) sugerem que duas rodadas de amplificação linear (RiboAmp HS PLUS kit) de RNA total extraído de tecidos que contêm cerca de 500 células que produzem cerca de 50μg de Arna - suficiente para o desempenho de ambos microarray e qRT-PCR experimentos. Se possível, evitar a transferência desnecessária de amostra entre 0,2 ml e 0,5 ml usando tubos de 0,5 ml em bloco do termociclador e os tubos de 0,5 ml fornecidas no kit.
Novamente, o protocolo seguido é o fornecido com o kit. Uma versão abreviada é descrito aqui.
- Adicionar 1μl do primer fornecido para a amostra de RNA total (aprox. 11μl) e incubar a 65 ° C por 5 minutos, seguido de refrigeração a 4 ° C por 1 minuto.
- Adicionar componentes primeira vertente cDNA juntamente com SuperScript transcriptase reversa III e incubar a 42 ° C por 1 hora.
- Após a síntese de cDNA segunda vertente, purificar o cDNA resultante através de uma coluna de purificação fornecido. Aqui recomendamos que, ao transferir a amostra mais tampão de ligação à coluna de purificação, para centrifugar os tubos de amostra duas vezes - uma vez após a transferência da amostra para a coluna, como até 1μl da amostra permanece nas laterais dos tubos após a transferência.
- Lave o cDNA com os amortecedores desde lavar e eluir o cDNA purificado com o tampão de eluição.
- Adicione o em componentes de transcrição in vitro e incubar por 6 horas a 42 ° C.
- Depois de uma etapa DNase, purificar a ARNA resultante com o buffers fornecidos, eventualmente eluição em um total de 12μl de tampão de eluição.
O RNA passa por mais uma rodada de amplificação linear (com primers separadas - veja kit protocol), após o que mais etapas de controle de qualidade são empregados. Um ul da amostra é diluída para aproximadamente 250ng/ul para determinar o comprimento mRNA transcrito e concentração com o LabChip StdSens (Experion). Tradicionais Affymetrix microarray tecnologia exige que o mRNA de ser pelo menos 600 nucleotídeos de comprimento, a fim de ser detectado. O gel e electrofograma obtidos a partir do LabChip deve, portanto, retratam este comprimento mínimo de mRNA transcrito (Fig. 3).
Um controle de qualidade adicionais é determinado através de uma análise espectrofotômetro NanoDrop, onde uma relação composta de duas densidades ópticas, ou seja, A260 e A280, determina a pureza do RNA. Amostras com uma densidade óptica cerca de 2,1 devem ser rotulados para a análise de expressão gênica, embora índices de até 2,7 foram mostrados para ter qualidade de hibridação comparável. A concentração também deve ser entre 800ng/μl-1μg/μl, como menor do que isso levou a RNA degradação durante o armazenamento (até mesmo em temperaturas abaixo de -80 ° C) e também levou a resultados microarray pobres.
6) amostras de Biotina-rotulagem mRNA para Affymetrix análise microarray:
O kit rotulagem TURBO Biotina (fim-rotulagem) de dispositivos moleculares é usado para rotular a ARNA obtidos de amostras amplificadas. A versão abreviada do protocolo é dado aqui.
- Ajustar o volume de 20 mg de cada amostra ARNA ao total de 13μl, adicionando água livre de nuclease, ou concentrando-se a amostra em uma centrífuga a vácuo, dependendo da concentração inicial. Mesmo que somente 15μg é necessário para o chip utilizado Affymetrix, acrescentamos 20μg para a reação inicial, como alguns RNA é perdida durante a incubação e centrifugação.
- Incubar a reação biotina a 85 ° C por 30 minutos, e depois relaxar a 4 ° C.
- Remova a etiqueta biotina excesso via centrifugação com a coluna especializada fornecido com o kit. Em alguns casos, especialmente com mRNA degradadas, como as obtidas a partir de FFPE (fixadas em formalina, incluído em parafina) amostras, pode ser o caso de que nem todos o mRNA é eluída na etapa de centrifugação única. Em seguida, recomendamos a adição de entre 1-5μl extras de água livre de nuclease para a coluna com uma etapa de centrifugação posterior extra de um minuto. Isso garante que a maioria da amostra é eluída rotulados.
- O volume final é 20μl, com uma concentração de 1μg/μl. Se extras de água livre de nuclease foi adicionado, concentrar as amostras para ovolume correto com uma centrífuga a vácuo. Recomendamos manter a concentração de armazenamento antes de começar a hibridização mais 800ng/μl, como temos verificado que menos do que isso levará a degradação durante a armazenagem e / ou hibridização, resultando em resultados microarray pobres.
ARNA foi, então, cruzados e expressão gênica perfilado, usando o conjunto Humanos X3P sonda GeneChip da Affymetrix. Como esse chip foi projetado para mais ARNA degradadas, ele foi usado como medida de precaução, como muitos fatores que não podemos controlar pode afetar a qualidade do tecido post-mortem. Como o nosso laboratório não tinha equipamentos adequados para a hibridização, o processo foi realizado nas instalações Núcleo Partners Genomic.
Resultados representativos:
Um tecido +2 +3) de corte, coloração de neurônios piramidais e laser de captura de microdissecção:
O protocolo descrito acima deve resultar em duas lâminas com quatro seções por slide. Cada seção deve ser suave com o mínimo de lacrimejamento, rachaduras e dobrável. Com coloração correta, a mancha irá identificar com uma coloração escura neurônios piramidais em torno de 20 - 25μm de tamanho com uma forma piramidal e visível dendrites apical. Com as tampas de CapSure HS em ajustes macro e ajuste correto da potência do laser e força para cada seção, você deve obter em torno de 500-700 células por seção / case resultando em pelo menos 500PG de RNA total. Cerca de 85 - 100% dos neurônios vão aderir ao PAC (Fig. 1).
4) A obtenção de RNA a partir de populações neuronais específicas:
Como descrito, após o isolamento do RNA total, vamos verificar a qualidade RNA por meio de um gel e electrofograma virtual através do Experion Bio-Rad. No electroferograma, você deve ver dois picos distintos correspondentes ao 18S e 28S ribossomal RNA unidades. Com o tecido pós-morte, no entanto, isso nem sempre é o caso, pois o tecido pode ser degradada devido a fatores antes do corte. Normalmente você vai ver uma grande degradação bump indicando, com um grande pico em torno de 18S, 28S e um menor pico (Fig. 2A, B). Enquanto os perfis electrofograma são comparáveis entre amostras, encontramos essa diretriz para resultar em qualidade de mRNA bom o suficiente para realizar dois estudos RT-PCR e microarray (Imbeaud et al., 2005).
Se houver degradação muito - como indicado por uma grande área sob a curva da electroferograma, ou se os picos não são visíveis (Fig. 2C, D) - as células devem ser capturados novamente a partir do tecido. Gostaríamos também recomendo fazer um teste de raspar o tecido, onde o RNA é extraído a partir de fragmentos toda a seção (não apenas células), antes de recapturar as células para determinar se o bloco de tecido em si é degradada.
5) amplificação linear:
Para testar a qualidade do mRNA após duas rodadas de amplificação linear, fizemos uso de ambas Bio-Rad Experion StdSens LabChip eo espectrofotômetro NanoDrop. Tradicionais Affymetrix microarray tecnologia exige que o mRNA de ser pelo menos 600 nucleotídeos de comprimento, a fim de ser detectado, o que foi obtido com este protocolo. Na verdade, comprimentos mRNA foram detectados na faixa de 1000-nucleotídeos. O electroferograma também reflete isso com grandes picos descendo lentamente em função do tempo (Fig. 3A, B).
As leituras indicaram uma média NanoDrop A260/A280 relação de 2,5 entre as amostras, indicando mRNA viáveis (Tabela 2).
Nossos resultados indicam que com este protocolo, a quantidade ea qualidade do RNA obtido é bom o suficiente para interrogar as diferenças de expressão gênica via o ser humano Affymetrix X3P GeneChip.
6) amostras de Biotina-rotulagem mRNA para Affymetrix análise microarray:
Depois de hibridização para o ser humano Affymetrix X3P GeneChip, conseguimos chamadas por cento de uma média de 26,6% (Tabela 2), indicando hibridização adequada e intensidades sonda.
Tabela 1: resumo Cohort
| Amostras | Grupo | Sexo | Idade | PMI |
| C1 | CONTROLE | F | 79 | 15,00 |
| C2 | CONTROLE | M | 22 | 21,47 |
| C4 | CONTROLE | M | 75 | 20,25 |
| C5 | CONTROLE | M | 80 | 15,50 |
| C6 | CONTROLE | F | 58 | 21,08 |
| C8 | CONTROLE | M | 61 | 17,00 |
| C10 | CONTROLE | F | 71 | 20,50 |
| C11 | CONTROLE | F | 12,66 | |
| C12 | CONTROLE | F | 86 | 6,92 |
| MÉDIA | 4M/5F | 69,11 | 16,71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | F | 93 | 6,92 |
| S2 | SCHIZOPH. | M | 55 | 21,40 |
| S3 | SCHIZOPH. | F | 67 | 21,80 |
| S4 | SCHIZOPH. | F | 55 | 22,00 |
| S5 | SCHIZOPH. | M | 36 | 17,97 |
| S6 | SCHIZOPH. | M | 62 | 10,75 |
| S8 | SCHIZOPH. | F | 92 | 17,80 |
| S11 | SCHIZOPH. | M | 56 | 21,83 |
| S12 | SCHIZOPH. | F | 88 | 13,33 |
| MÉDIA | 4M/5F | 68,11 | 16,90 |
Abreviaturas: F - feminino, M - PMI, Male - postmortem intervalo, schizoph. - Esquizofrenia.
Tabela 2: Resumo dos resultados que descrevem a concentração de RNA, qualidade e eficiência de hibridização
| Amostras | [RNAm] ng / ul | A260/A280 | Intensidade da sonda | Chamada por cento |
| C1 | 1.318,01 | 2,67 | 63 | 19,5 |
| C2 | 2.312,93 | 2,37 | 147 | 30,6 |
| C4 | 1.811,92 | 2,44 | 69 | 26,6 |
| C5 | 1.316,26 | 2,51 | 78 | 34,7 |
| C6 | 1.663,24 | 2,39 | 66 | 33,8 |
| C8 | 633,05 | 2,54 | 101 | 15,2 |
| C10 | 1326,4 | 2,47 | 92 | 32,5 |
| C11 | 994,24 | 2,75 | 76 | 22,4 |
| C12 | 817,23 | 2,7 | 56 | 15,2 |
| S1 | 2.560,88 | 2,47 | 78 | 25,0 |
| S2 | 2.169,61 | 2,43 | 76 | 26,5 |
| S3 | 2.067,32 | 2,52 | 87 | 22,1 |
| S4 | 1.563,89 | 2,75 | 82 | 28,1 |
| S5 | 2.071,44 | 2,44 | 88 | 28,2 |
| S6 | 2.532,59 | 2,34 | 72 | 30,7 |
| S8 | 2.189,22 | 2,5 | 62 | 31,8 |
| S11 | 1.669,89 | 2,47 | 41 | 27,3 |
| S12 | 1.739,35 | 2,47 | 42 | 28,0 |
| MÉDIA | 1.708,75 | 2,51 | 76,44 | 26,57 |
Figura 1:. Resumo do processo de microdissecção a laser de captura-A) neurônios piramidais são identificados morfologicamente. B) Após o laser tem pulsado através do filme termoplástico, as células aderem ao PAC e, portanto, já não no slide, deixando para trás tecido circundante. C) Fotomicrografia de uma população celular homogênea aderir sobre a Cap CapSure após a captura a laser.
Figura 2:. Controle de qualidade total RNA A + B) Representa RNA de boa qualidade total após o isolamento, enquanto o C + D) ilustra o RNA total não deve olhar como após o isolamento. A) Um electrofograma com claras picos 18/28S correspondente com o virtual em gel (B). C) Uma electrofograma mostrando uma grande área sob a curva e sem picos 18S/28S indicando degradação do RNA. Este também é mostrado no gel virtual (D).
Figura 3:. Controlo de qualidade mRNA A + B) eletroferograma (A) e virtuais gel (B), indicando o mRNA transcrito lengº (spread) necessário para os estudos de microarray, ou seja, estendendo últimos 600 nucleotídeos (nt). C + D) eletroferograma (C) e virtuais gel (D) mostrando o que espalhou um mRNA insuficiente ficaria assim, como o comprimento mRNA transcrito não se estende 200nt passado.
Discussion
Aqui, tentamos personalizar um protocolo para extrair populações de células homogêneas a partir de tecido cerebral post-mortem heterogêneos usando o Arcturus XT sistema e kits de extração de RNA relacionados. Conforme descrito acima, fizemos algumas modificações para os protocolos originais fornecidos pela empresa, a fim de maximizar a integridade do RNA. A captura de sucesso de uma única célula depende apenas otimizar os passos antes da captura, a fim de atingir células máxima com RNA bom. Essas etapas incluem os vários parâmetros associados com tecido de corte e coloração. Em suma, no que diz respeito à preparação de tecidos que incluem: 1) diminuição do gradiente de temperatura ao fazer cortes, 2) apenas colocando dois pontos por slide, 3) realizar todas as etapas de desidratação no gelo, 4) a adição de inibidor de RNase para a mancha, 5) o aumento a duração de desidratação de etanol no final de 100% a 3 minutos.
Com relação à captura, nós sentimos que a combinação de CapSure HS caps, com o software de configuração Macro, deve assegurar os melhores resultados. Um ambiente com controle de umidade é fundamental para capturar células individuais, como alta umidade reduz drasticamente "levantar" o tecido. As altas temperaturas também pode ter um efeito negativo na qualidade do RNA.
Durante o protocolo de isolamento de RNA com o kit PicoPure, há duas etapas de lavagem. É importante verificar que todos tampão de lavagem é removido antes de transferir para outro tubo de microcentrífuga para a eluição RNA, como qualquer presença do tampão na sua amostra final vai resultar em menos RNA de partida para a amplificação. Para garantir isso, centrifugar a etapa de lavagem final para 2,5 minutos em vez de dois minutos, conforme sugerido no protocolo fornecido.
Para a maior parte, o protocolo de amplificação linear foi de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, dois pontos cruciais devem ser tidos em conta quando se utiliza este protocolo: 1) tentar limitar a perda de RNA via transferência de excesso de amostras entre os tubos, usando apenas os tubos de 0,5 ml fornecida em conjunto com um bloco de 0,5 ml no termociclador e 2) ao transferir a amostra para a coluna de purificação para a purificação do cDNA, certifique-se de girar os tubos de amostra após a primeira transferência. Isso resultará em um adicional de 1-2ul de exemplo para adicionar à coluna de purificação e, portanto, pode aumentar a recuperação de cDNA.
Ao fazer uso do kit final rotulagem TURBO para biotina rotulagem de suas amostras ARNA limitada, sugerimos acrescentar um extra alguns mL de água antes da etapa de centrifugação, para aumentar o rendimento de RNA marcado extraído da coluna. Um minuto extra de centrifugação também vai ajudar nesse sentido, especialmente se você estiver trabalhando com tecido degradadas, como o tecido FFPE.
Estamos confiantes que este protocolo vai permitir que o usuário isolar pequenas estruturas homogêneas, como populações de células individuais, dentro do tecido heterogêneo pós-morte cerebral. Isto reduz os efeitos de diluição das estruturas vizinhas e outros tipos de células localizadas nas várias camadas dentro do cérebro, levando a resultados orientados para os tipos de células específicas sob investigação. Como a qualidade do RNA resultante é bom o suficiente para estudos de microarray, podemos começar a identificar assinaturas moleculares específicas de populações de células específicas afetadas na doença de estados.
Disclosures
A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela Life Technologies.
Acknowledgments
Agradecemos dispositivos moleculares tecnologias Analítica / Arcturus por sua generosa doação de reagentes utilizados para o estudo. Agradecemos também à Harvard Centro de Recursos para a prestação de tecido tecido cerebral humano postmortem Financiamento:. RO1MH76060 e P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
