Summary
В этой статье мы опишем методику измерения коэффициентов диффузии использованием многофотонной флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания. Мы начнем, совместив лазерной вдоль оптического пути к образцу и определения надлежащих параметров эксперимента, а затем продолжить создание и, наконец, установка флуоресценции кривые восстановления.
Abstract
Multi-флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания является микроскопия техника, используемая для измерения коэффициента диффузии (или аналогичные параметры транспорта) макромолекул, и может быть применен к обоим
Protocol
1. Выровнять по оптике.
Основное оборудование для MP-FRAP эксперимент включают в себя: синхронизацией мод лазерного источника, ячейки Поккельса (для модуляции пучка), импульсный генератор, дихроичных, объектив, флуоресценция выбросов фильтр, закрытый ФЭУ, а также систему записи данных (счетчик фотонов и многоканальных масштабирования).
2. Определите безопасные полномочия монитора.
- Ослаблять лазера низкой, но разумной, мощность генерации флуоресценции в образце.
- Фокус в образце.
- Установить счетчик фотонов интегрировать по шкале времени гораздо дольше, чем ожидалось, восстановление флуоресценции. С фокальном объеме проведены стационарные внутри образца (на наш микроскоп программного обеспечения это достигается точка сканирование), запись разумное число фотонов данные счета.
- Увеличение мощности и сделать еще один ряд данных фотона в счет. Повторяйте, пока увеличение фотоотсчетов представляется значительно сократиться по отношению к власти возрастают.
- Участок журнал (фотоотсчетов) в зависимости от журнала (мощности). Отклонение от склона двух указывает отбеливания в течение монитора. Выберем в качестве монитора власти силы, которая ниже этого отрезаны, но которая позволяет в течение разумного отношения сигнал-шум.
3. Определение входных параметров генератора импульсов и многоканальные масштабирования.
- Определите, назад--конвертов оценки коэффициента диффузии и время восстановления на основе литературы и / или Стокса-Эйнштейна уравнение и уравнение диффузии.
- Установить необходимые значения параметров генератора импульсов и масштабирования.
- На генератор импульсов, набор заранее отбеливателя и отбеливатель раз. Хороший набор эмпирических правил является то, что предварительно отбеливатель должен составлять 1-2 раз больше, чем ожидаемое время восстановления половине, и отбеливатель время должно быть одной десятой ожидаемое время восстановления половины.
- На масштабирования, установите бен шириной примерно половина отбеливателя продолжительность, и установить число контейнеров в соответствии с записью, что продукт вашего выбранной толщины бункера и бункеров на запись больше или примерно равна вашей ожидать полного восстановления плюс предварительно -отбеливатель и отбеливатель раз.
- Вернуться на импульсный генератор и установить частоту pre-bleach/bleach/monitor последовательности равна значению просто меньше, чем обратная продукт бен ширина раза число контейнеров на запись. *
- Наконец, установите количество записей / сканирование на масштабирования основана на интенсивности сигнала на выбранном питания монитора.
* Очень важно, что время для полной последовательности pre-bleach/bleach/monitor (1/frequency), выставленный на генератор импульсов больше времени сбора данных (бен ширина х бункеров / запись), выставленный на масштабирования. Если этот критерий не выполняется, несколько триггеров отбеливатель может появиться в одной записи на масштабирования.
- Установить питания монитора до приемлемого уровня, определяемого ранее. Установить отбеливателя мощности до 200 мВт или около того выше отбеливания отсечки определяется во время отбеливания монитор тест. Эти полномочия и установить в качестве различных напряжениях на ПК кристалла.
- Печать микроскоп, выключите свет, включите PMT, начинают точки сканирования на микроскопе программного обеспечения, а затем начать генератор импульсов и масштабирования.
- Анализ в результате восстановления кривую, кривую и маркировка три важных момента: 1) предварительно отбеливателя флуоресценции, 2) флуоресценции сразу после отбеливания, и 3) флуоресценции в конце набора данных. Использование флуоресценции значений до и сразу после отбеливания, чтобы лучше оценить половину времени на восстановление.
- С этой оценкой полувосстановления временем, следует использовать эмпирические правила, изложенные ранее, чтобы определить новые значения для предварительного отбеливатели, дезинфицирующие средства, и длительности бен ширину. Кроме того, использование предварительно отбеливателя флуоресценции и флуоресценции в конце набора данных, чтобы лучше оценить время, необходимое для достижения полного выздоровления. Как правило, данные должны быть собраны за период времени, который позволяет для полного восстановления подлежащая представлению в отношении второй половины данных.
- Настройка параметров генератора импульсов и масштабирования, принять новую кривую, и продолжить настройку параметров, пока ваша кривая экспонатов сильный отбеливатель и гладкой восстановления. Имейте в виду, что отбеливатель продолжительность может и должна быть меньше правило, если это возможно. Отбеливатель власти также могут быть скорректированы, если слишком мелко или слишком глубоко, отбеливатель достигнута.
4. Тест для возбуждения насыщения.
- Использование соответствующий монитор и отбеливатель полномочий, определяется ранее, принять ряд MP-FRAP кривых. Анализ каждого восстановления, нормированная на заранее отбеливателя флуоресценции, используя соответствующую математическую форму и нелинейных наименьших квадратов алгоритма (см. "Анализ данных" ниже). Запись установлены значения отбеливателя параметр глубины.
- Продолжайте прием и анализ последовательных серии MP-FRAP кривых при увеличении значения отбеливателя власти.
- Участок журнал (параметр отбеливателя глубины) в зависимости от журнала (мощности). Любое отклонение от склона две указывает возбуждения насыщения. Выберите отбеливателя сила, которая дает сильный отбеливатель, но не вызывает насыщения.
5. Продолжать принимать MP-FRAP кривых.
- Продолжать принимать кривые, как и выше, будет все параметры правильно установить.
6. Анализ данных.
- Удалите предварительно отбеливателя и отбеливатель данные флуоресценции набор данных и настроить время данные, такие, что т = 0 соответствует значению флуоресценции сразу же после отбеливателя.
- Нормализация в результате флуоресценции восстановления по отношению к средней заранее отбеливателя флуоресценции.
- Установить нормированный кривой с использованием соответствующей математической модели и нелинейные, метод наименьших квадратов алгоритм подбора, такие как lsqcurvefit функции в MATLAB. Модель, представленная здесь приходится флуоресценции восстановление влияние как диффузии и конвективного потока:
где F о является заранее отбеливателя среднем флуоресценции, β является отбеливатель параметр глубины, τ D является характерной диффузионной время восстановления, R представляет собой отношение квадрата осевой (Ш) для радиальной (ш г) ширина двухфотонного фокального объема, τ VX = и R / V х, τ иу = и R / V у, τ уг = Ш / в г и V 2 = V х 2 + V 2 + у V Z 2 является скорость конвективного потока. Для потока ограничивается изображениями плоскости, τ VZ → ∞ и 1 / τ VX + 1 / τ иу можно заменить 1 / τ VR. В отсутствие конвективных потоков, как экспонент в числителе к 1, и выражение значительно снижается, только два подгоночных параметров, β и τ D. Коэффициент диффузии легко вычисляется как D = W R 2 / 8τ D.
7. Представитель результаты.
Рисунок 1. Представителю отбеливателя и кривой восстановления для FITC-БСА. Хорошая кривая восстановления экспонатов сильный отбеливатель и гладкой восстановления, с флуоресценции на полное восстановление сообщается на вторую половину данных.
Рисунок 2. Нормализованной кривой восстановления для FITC-BSA (красный) и связанных наименьших квадратов (черный). Это соответствует доходности коэффициент диффузии 52,9 мкм2 / с, что согласуется с литературой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сила многофотонной флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания заключается в его способности, чтобы исследовать толстых образцов с 3D-разрешение. С момента своего развития в 1990-х годов, MP-FRAP была использована для определения коэффициента диффузии (или аналогичные параметры транспорта) в клеточных тел, экс естественных ломтики толщиной ткани, и в естественных условиях ткани и интерстиции. В этой статье мы представили оборудование, необходимое для запуска MP-FRAP эксперимента, а также надлежащей процедуры для выравнивания пути луча, настройка параметров эксперимента, с данными, а также анализ кривых восстановления.
Выбор соответствующих длин волн возбуждения и эмиссии фильтра следует руководствоваться двухфотонного сечений и спектров излучения. Эта информация часто входит в состав технических данных для различных красителей. Кроме того, в процессе согласования лазерного луча, важно, что надлежащее переполнения обратно линзу цели будут достигнуты. Это часто достигается путем добавления расширитель пучка в оптической системе. Правильное переполнение может быть проверена путем сканирования под разрешением фиксированной люминесцентные бусины в обоих осевых и радиальных направлениях, а затем построение и монтаж флуоресценции профилей Гаусса, чтобы найти 1 / е 2 ширины для сравнения с литературными данными.
Это также важно выбрать соответствующий мониторинг и отбеливания полномочий. Власть используется для мониторинга флуоресценции до и после отбеливания должна быть достаточно низкой, чтобы не вызвать заметного обесцвечивания, но достаточно высоко, чтобы обеспечить хорошее отношение сигнал-шум. Отбеливание власти должны избегать возбуждения насыщения. В MP-FRAP эксперимента есть верхний предел скорости возбуждения флуоресценции, которая пропорциональна квадрату мощности падающего на образец. Этот предел знаменует собой начало режим насыщения возбуждения. Флуоресценция кривые восстановления производится с использованием отбеливателя полномочия, работающих в режиме насыщения возбуждения даст ошибочно низкими коэффициентами диффузии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась министерством обороны эру надежды премии ученого (№ W81XWH-05-0396) и ученый Пью в премии медико-биологических наук Эдуарду Б. Браун III.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:sapphire laser | Newport Corp. | Mai Tai | |
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | |
| Laser Scanning Microscope | Olympus Corporation | Fluoview | |
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 670 DCSX-2P | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | |
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | |
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | |
| FITC-BSA | Invitrogen | -- |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
