Подготовка политенных хромосом Drosophila Кабачки для антител маркировки

Summary

Это видео показывает протокол сквош техника, используемая в Йохансен лаборатории для подготовки

Abstract

Дрозофилы уже давно любимые модельной системой для изучения взаимосвязи между структурой хроматина и регуляции генов в связи с цитологическим преимущества, которые дает гигантский слюнной железы политенных хромосом личинок третьего возраста. В этой ткани хромосом пройти много раундов репликации в отсутствие деления клеток что приводит к приблизительно 1000 экземпляров. ДНК остается выровнен после каждого цикла репликации в результате чего значительно увеличен хромосом, которые предоставляют уникальную возможность соотнести хроматина морфологии с локализацией специфических белков. Следовательно, наблюдается высокий уровень заинтересованности в определении эпигенетические модификации присутствует на различных генов и на разных этапах процесса транскрипции. Важным инструментом для таких исследований является маркировка политенных хромосом с антителами к фермента, фактора транскрипции, или модификации гистонов интересов. Это видео показывает протокол сквош техника, используемая в Йохансен лаборатории для подготовки политенных хромосом дрозофилы на антитела маркировки.

Protocol

Следующие протокол для подготовки сквош политенных хромосом адаптировано из процедуры, описанной в Йохансен и соавт. (2009).

1. Культура третьего возраста личинок дрозофилы

Для того чтобы получить оптимальную политенных хромосом для высокого качества подготовки сквош, непереполненные условий культивирования необходимы (например, место около 20 откладывающих яйца самок мух в стандартный 4 "бутылку летать и изменения в новой бутылке каждый день). Выберите жирный лиц от первого урожая восхождения третьего возраста личинок, пока они еще блуждающие, но незадолго до окукливания. Мы регулярно культуры при 21 ° С, но 18 ° C даст толще хромосом, что может быть более подходящим для некоторых целей, таких как, например, когда группа / межзонных регионах должны быть визуализированы с высоким разрешением.

2. Политенных материалов сквош

• Драммонд рассечение щипцы (2)
• Чашки Петри (60 х 15 мм)
• Матовый предметные стекла (Fisher номер 12-544-3) (поли-лизин-покрытием)
• 22 х 22 мм № 15 Покровные стекла (Fisher № 12-520B) (покрытый Sigmacote; Sigma # SL2)
• 22 х 40 мм № 15 Покровные стекла (Fisher № 12-530B)
• Ким-салфетки
• Фазы контрастного микроскопа с 20-кратным цель
• Малый Дьюара (например, термос или термос)
• Длинные щипцы
• Лезвия для бритвы
• Коплин Jar
• Резино-дева или Tupperware лоток (или эквивалент герметичные лоток)
• Парафильмом (разрезать на квадраты 22 мм)
• 175 г веса

3. Фиксаторы и решения

1. 5X фондовом формальдегида. Подготовка свежего раствора на 0,74 g. параформальдегида в 4,0 мл дН ₂ O и 28 мкл 1 N КОН. Нагреть до 65 ° С для растворения параформальдегида и затем хранить на льду.
2. Fixative 1. Подготовка свежий раствор по 0,5 мл 10 раз PBS, 50 мкл Тритон Х-100, 3,45 мл дН ₂ O и 1,0 мл с 5-кратным фондовом формальдегида. Теплый разогнать Тритон Х-100 и использовать в течение 1 часа.
3. Fixative 2. Подготовка свежий раствор 1,5 мл дН ₂ O, 2,5 мл ледяной уксусной кислоты и 1,0 мл с 5-кратным фондовом формальдегида и использовать в течение 1 часа.
4. Lactoacetic кислотный раствор. Приготовьте раствор по 1 мл молочной кислоты, 2 мл дН ₂ O, и 3 мл уксусной кислоты.

4. Политенных хромосом сквош подготовки:

1. Промыть личинок с водой и трансфер в PBS в блюдо культуры тканей для вскрытия.
2. Возьмитесь за кончик рта крючки с одной парой щипцов, удерживая тело на 2 / 3 пути вниз с другой парой, и тянут в рот крючки так слюнные железы подвергаются. Отдельные слюнных желез из мозга и глаз усиков диски, и рассекать от жира и любых других связанных с ними тканей железы.
3. Добавьте 200 мкл Fixative 1 до первой скважины из двух хорошо слайд депрессии и 200-300 мкл Fixative 2 до и два. Передача одной пары слюнных желез в период до 1 Fixative в хорошо одно и инкубировать в течение времени, необходимого для целевой эпитопа, обычно около 1-2 минут. (Примечание: некоторые эпитопы, например, для большинства модификаций гистонов, может потребоваться 5 минут или дольше фиксации.)
4. Использование щипцов передачи слюнных желез Fixative 2 в а 2 и инкубировать в течение двух минут.
5. Передача железы до 10-30 мкл Lactoacetic раствора кислоты на чистую Sigmacoted покровное. Осторожно опустите полилизином покрытие на стекло микроскопа покровное и без применения вертикального давления, забрать покровное так железы между горкой и покровное. Сразу способствовать лизису клеток и хромосомных распространения тщательно схватив покровное щипцами на одном краю и аккуратно перемещая его слегка назад и вперед, стараясь минимизировать любые вертикальные давление на ткани. Также можно использовать ластик стороне карандашом или даже пальцев, чтобы аккуратно двигаться покровное туда и обратно. Обратите внимание, что любая задержка в движении покровного вперед и назад, скорее всего, уменьшит распространение хромосомных оружия, так как они имеют тенденцию становиться более жесткой при воздействии Lactoacetic кислотный раствор. Помутнение раствора часто является хорошим показателем ячейки разделения. Осторожно нажав покровное наклонно (чтобы избежать вертикального давления) с резинкой стороне карандашом несколько раз, может также помочь в хромосомном распространения.
6. Сразу изучить ткани под микроскопом фазового контраста с 20 или 40Х целью определить, является ли хромосомы хорошо распространяться.
7. При хромосомных распространения достаточно, установить слайд с покровным стороной вниз на стопку чистой Ким-салфетки. Место второго Ким-протрите сверху и придавить хромосом, помещая большой палец над местом, где покровное позиционируется и нажав твердо, избегая любого горизонтального перемещения покровного стекла, что бы сдвигахромосом.
8. Изучить слайд снова под микроскопом, чтобы определить, если препарат подходит для намеченной цели. Если хромосом значительно продвинулись на выжимании, использовать меньше объема Lactoacetic раствора кислоты в последующих препаратов. Повторите шаги 4.1-4.8, пока достаточное количество подходящих слайды были получены. Место 175 г веса на покровное из слайдов.
9. Заполните небольшой сосуд Дьюара (например, термос) с жидким азотом. Используя длинный пинцет, окуните в жидкость слайд № ₂ до остановки кипения, удалить слайд, и немедленно использовать краю чистым лезвием в одном углу, чтобы перевернуть с покровным. Если слайд будет использоваться сразу, место в банке Коплин с PBS при 4 ° C. В противном случае собирать слайд в банку Коплин заполнены 95% этанола. Изучить покровное раз мороз сублимированной прочь, чтобы подтвердить, что ткани придерживался слайд-шоу и не остался с покровным. Повторите с оставшейся слайды, пока все слайды хранятся либо в PBS (для использования в течение нескольких часов) или этанола (на более длительный срок хранения).

Представитель Результаты

Первым важным шагом для получения высокого качества политенных сквош препарата расти жирных личинок с большими ядрами слюнных желез. Второй хорошей техникой с распространением процедура, которая может потребоваться некоторая практика. Один совет для улучшения распространения успеха заключается в нахождении минимального объема lactoacetic раствора кислоты во время давя шаг. Это будет способствовать достаточное распространение хромосом, не создавая чрезмерной потокового силы, которые можно мыть хромосомы оружие прочь. Стоит также отметить, что любая задержка в движении покровного туда и обратно позволит снизить распространение хромосомных оружия, поскольку они становятся более жесткими при воздействии Lactoacetic кислотный раствор.

Если все пойдет хорошо, не должно быть много и очень распространенная политенных хромосом. На рисунке 1 показан пример такой подготовки, дважды помечены маркером межзонных регионов в зеленом и с краситель, который окрашивает диапазонов регионов в синий цвет. Если недостаточное распространение получается, хромосом будет выглядеть как маленькие шарики, как показано на рисунке 2. С другой стороны, если слишком много распространение произошло, chomosomes будет слишком тонким и расширенные или в некоторых случаях раздроблена на мелкие кусочки, как показано на рисунке 3.

Рисунок 1. Политенных сквош подготовке двойного меченные антитела к JIL-1 гистонов H3S10 киназы (в красном) и Hoechst (синий).

Рисунок 2. Политенных сквош с недостаточным распространением.

Рисунок 3. Политенных сквоша со слишком большим распространением.

Discussion

Включение уксусная и молочная кислоты в обычных протоколов фиксации сквош облегчает как разрешение межзонных и хромосомные руку распространения, но к сожалению, некоторые эпитопы не выживают этого лечения. Примером такого эпитопа является H3S10ph (Cai и соавт., 2008). После кислотной обработки также имеет тот недостаток, что он утоляет присущие флуоресценции GFP с метками белков, DiMario и соавт. (2006) недавно разработала формальдегида основе "бескислотной сквош техники", которые позволяют для прямой визуализации GFP-синтез белков на политенных хромосомах без GFP-антитело, маркировки, а также для выявления антител чувствительных к кислоте эпитопов. Модификации для этой процедуры еще более подробно описано в Йохансен и соавт. (2009). Представитель кислоты фиксированной политенных подготовки сквош двойной помечены с антителами к JIL-1 гистонов H3S10 киназы и Hoechst показано на рис. 1.