德罗索菲拉 神经肌肉结 （NMJ） 定量：评估突触形态和功能的方法

Overview

嗜睡神经肌肉结 （NMJ） 用作研究突触的形态和功能的模型。此视频描述了研究人员量化为 NMJ 特征的重要特征。示例协议演示了能够自动执行量化的软件。

Protocol

本协议摘自卡斯特尔斯-诺鲍等人，两种算法的高通量和多参数定量的德罗索菲拉N欧元肌肉交界形态学，J.维斯Exp。(2017).

1. 图像处理前的要求

1. 执行第三星游荡幼虫 （L3） 的德 罗索菲拉 开放书准备， 如前所述。
2. 使用两个标记组合的共免疫波罗拉贝尔德 罗索菲拉 NMJ 终端：Dlg-1 或 Hrp 与 Brp 一起使用"德洛索菲拉 NMJ 形态测量仪"进行分析，Syt 或 Csp 与 Brp 一起使用"德洛索菲拉 NMJ Bouton 形态测量仪"进行分析。
   注： 来自同一物种的抗体可以通过预贴标签与抗体结合套件（如 Zenon Alexa 标签套件）相结合。
3. 使用首选显微镜（ 如 荧光（有或没有 ApoTome）或共聚焦显微镜的图像 NMJ 终端。
   1. 获取 NMJ 终端的双通道图像堆栈。
      1. 调整显微镜设置的方式，通道 1 获得 NMJ 终端免疫带与 Dlg-1 （或 Hrp， Syt， Csp） 和通道 2 NMJ 终端免疫带与 Brp.
      2. 可选地，用宏分析单通道图像（用单一抗体免疫的突触）。图像 Nmjs 免疫带独特的与 Dlg - 1 或 Hrp 分析与 "德罗索菲拉 Nmj 莫福测量"， 或 Syt 或 Csp 为 "德罗索菲拉 Nmj 布顿莫福测量" 。
         注： 不可能分析只有抗 Brp 的免疫突触。
   2. 将获得的图像导出为单个.tiff文件。如果未按指示获取，则在运行宏之前倒置通道顺序。

2. 软件要求和安装

1. 下载宏：从以下网站"德罗索菲拉NMJ形态学"和"德罗索菲拉NMJ布顿莫福测量仪"从以下网站：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1。
2. 将光标移动到文件夹"宏更新1"，然后单击显示选项"查看"。将显示带有此文件夹内容的列表。文件夹包含宏"德罗索菲拉 NMJ形态学"和"德罗索菲拉 NMJ布顿形态测量仪"。
   注： 两个宏都与斐济版本 1.4 兼容，该版本也在同一文件夹中提供。宏可能不运行在最近版本。请使用所提供的版本1.4。启动此版本是没有问题的，即使在具有较新的斐济版本的计算机上也是如此。
3. 单击"全部下载"。文件夹内容将作为.zip文件下载到计算机。解压已下载的文件。
4. 将德 罗索菲拉_NMJ_Morphometrics.ijm 和 德罗索菲拉_NMJ_Bouton莫福米茨. ijm 文件复制到 Fiji.app/plugins/ 目录。重新启动程序时，宏将显示在插件下拉菜单的底部。

3. 运行子宏"转换为堆栈"以创建 NMJ 图像的 Z 投影和超堆栈

1. 通过在工具栏中选择插件开始图形界面，并在下拉菜单中选择"Drosophila NMJ 莫福测量仪"。
2. 在宏的图形界面中定义"唯一的文件字符串"设置。
   注： 显微镜软件在将堆栈存储为单个".tiff文件"时，使用识别签名来组织平面和通道。输入的唯一文件字符串设置需要指定软件分配给第一个通道第一平面的签名（重要：需要指示最低平面和通道编号）。
3. 仅选择子宏"转换为堆栈"，然后单击"确定"，然后选择图像所在的文件夹。如果选择具有多个子文件夹的主目录，则将处理主目录内的所有单独的".tiff文件，以及匹配唯一文件串标准的子文件夹。
   1. 如果 z 堆栈仅包含一个通道，请选择"仅选择通道 1"框。
4. 请注意，每个 NMJ 图像将出现两个新文件，默认称为"stack_image_name"和"flatstack_image_name"。仅存储这些堆栈和平板，以供进一步分析。此时可以删除.tiff文件系列，最大限度地减少所需的存储容量并避免潜在的错误源。

4. 运行子宏"定义投资回报率"，以定义 NMJ 感兴趣的终端

1. 启动"德罗索菲拉 NMJ形态学"的图形界面。
2. 仅选择复选框"定义投资回报率"并按"确定"，并选择存储标题为flatstack_name的图像的主目录并按"选择"。子宏"定义投资回报率"自动搜索所选主目录内的所有子折叠。
3. 当第一个投影打开时，在工具栏中选择"徒手选择"工具。
4. 使用鼠标绘制一个仅包含完整的 NMJ 感兴趣终端的精选，然后单击窗口"定义终端"中的"OK"。宏将进行下一个预测。
5. 定义下一个投资回报率并重复，直到定义所有投资回报率。名为"roi_image_name"的投资回报率图像文件将存储在以前生成的堆栈和每个处理图像的投影图像相同的目录中。此子宏的输出是黑色背景上白色投资回报率的二进制图像。

5. 运行子宏"分析"以量化 NMJ 终端功能

1. 转到工具栏，选择"插件"并使用：
   在分析用抗 Syt 或反 Csp （通道 1） 与抗 Brp （通道 2） 一起接种突触免疫带时， 或在分析用反 Syt 或反 Csp （通道 1） 与 Brp （通道 2） 一起接种突触免疫带时， "_NMJ_Bouton_Morphometrics_NMJ_Morphometrics"。
   1. 当要分析一个通道图像堆栈（结构通道 Dlg-1 或 HRP 表示 "Drosophila_NMJ_Morphometrics"，或 Syt 或 Csp 用于"_NMJ__Bouton_Morphometrics"时），请选择"仅限通道 1"的框。
2. 调整与要分析的图像对应的尺度。
   1. 如果图像中的一个像素对应于 2.5 μm，则表示比例像素 = 1，量表距离表示 μm = 2.5。如果两个设置都留在 0，NMJ 区域、周长、长度和最长的分支长度将以像素数表示。
3. 如有必要，调整宏的默认分析设置。仅在子宏"分析"之前运行时效果不尽如人意时执行调整（请参阅本节末尾，以及第 6 节有关如何优化设置的说明）。
4. 选择复选框"分析"和"等待"，然后按"确定"。
   1. 在运行 2 个通道图像上的子宏"分析"时，选择"等待"复选框。否则，由于计算机容量有限，活动区计数可能会出现错误。
5. 当新窗口"选择目录"打开时，选择图像所在的目录并按"选择"。宏将分析存储在主目录中的所有图像，如果适用，还会分析后续文件夹（使用执行前三个子宏的三个文件：stack_image_name、flatstack_image_name和roi_image_name）。宏分别和连续地处理每个图像。这可能需要几分钟每个图像堆栈（取决于计算机容量）。
6. 运行宏后，请注意，在父文件夹中将创建一个名为"res_image_name"的新图像文件，用于存储的每个分析突触。定量测量将存储为"结果.txt"文件。
7. 检查所有结果图像，以检测和排除带有分割错误的图片。 表 1中描述了可能的分割错误，以及如何调整设置以规避这些错误的建议。具有此类分割错误的结果图像在 图 1中作为示例提供。
   注： 使用用户界面中观察到的默认设置运行宏时，将宏评估与手动评估进行比较时的准确度约为 95%。

6. 将宏设置调整为图像

1. 当超过 5% 的图像显示分割错误时，请探索不同的算法来定义/选择最适合图像的宏设置。
2. 调整滚球半径值
   注： 滚球半径功能减去图像的背景。当处理荧光显微镜上获得的图像和/或图像具有高背景噪声时，此功能至关重要。背景的减法将有助于宏的自动阈值步骤，以产生足够的细分NMJ终端。
   1. 选择三个 NMJ stack_image_name由子宏"转换为堆栈"生成的图像。选择代表图像数据集的图像。
   2. 在工具栏中，选择图像|颜色|拆分通道。将创建两个图像堆栈，一个分别表示通道 1 和另一个通道 2 并保存它们。
   3. 打开属于通道 1 的图像堆栈，对应于 Dlg-1、Hrp、Syt 或 Csp 免疫带。
   4. 通过在工具栏中选择"过程"然后选择"减去后台"来运行筛选器"减去背景"。。。"在下拉菜单中。
   5. 单击弹出窗口中的预览复选框，并将滚动球半径调整到最适合图像的价值。"滚球半径"设置应调整为增加突触和背景之间的对比值（见 图 2A）。
      1. 请参阅 图 2 示例。在面板 A 中，突触的某些部分显示与背景相同的灰色水平，而在 图 2 面板 A 中，500 的"滚球半径"导致突触和背景之间的强烈对比。
   6. 通过在工具栏中选择图像|创建 z 投影堆栈|Z 投影，选择投影类型 = 最大强度并保存生成的图像。当定义滚动球半径的适当值时，在剩余具有相同滚动球半径值的代表性图像上运行"减去背景"算法。创建 Z 投影并保存它们（在任何目录中）。
      注： 8 位或 RGB 图像的滚动球半径值应至少与图像中不是背景一部分的最大对象的半径相同。对于 16 位和 32 位图像，半径应与像素值范围成反比。
3. 确定将使用的不同自动阈值
   1. 打开上一步（6.2.6）中保存的 Z 投影并选择图像|调整|自动保持|全部尝试。
   2. 由于二进制阈值结果映像将出现在所有不同的自动阈值算法中，因此确定最适合图像的算法。
      1. 稍后运行宏时，相应地更改宏设置中的阈值。
      2. 使用更严格的阈值（如"RenyiEntrophy"或"时刻"）作为 NMJ 轮廓阈值，以及更宽松的阈值（如"Li"）来确定 NMJ 骨架，以及"黄"来确定活动区域。当图像非常锋利，几乎没有背景，使用"黄"作为"NMJ轮廓阈值。否则，在图像分割后，突触的某些部分可能会丢失。
      3. 例如，请参阅 图 2B。 通过绿色框突出显示的自动阈值获得突触的适当细分。红色框突出显示了一些不合适的阈值示例（在高放大倍率下检查突触）。在后者中，突触的任何部分都缺失，或者包括背景部分。
4. 确定小颗粒的最大大小
   注： 此函数将从分析中排除 NMJ 轮廓阈值和骨架阈值检测到的所有小于"小颗粒设置"中定义值的粒子。此值以像素定义。此功能用作噪声过滤器，当获得的图像中存在高速率的非均匀背景（如晶体/灰尘）时，这种功能非常有用。
   1. 打开步骤 6.2.6 中保存的 Z 投影。并设置比例，通过分析|检测像素的数量设置比例。应用以下设置：像素距离 = 1，已知距离 = 1，像素纵横比 = 1，长度单位 = 像素，并按"确定"。单击工具栏中的"椭圆形选择"工具。
   2. 使用鼠标绘制一个选择紧密围绕单个粒子存在于免疫染色，但不属于NMJ。为 Windows 用户按 Ctrl+m，或为 Mac 用户按厘米+ m。结果窗口将打开，指示以像素数选择的粒子的区域。
   3. 重复前一步几次，图像中存在多个人工制品，以确定最大的污染物颗粒/人工制品区域。这将是稍后运行宏时设置在设置中的价值。运行宏时，将"小颗粒大小"设置为最小的颗粒大小，观察到的脓分差为 25%。
   4. 请参阅 图 2D 以示例。检测到的最大晶体的面积为 112 像素。"小颗粒大小"设置，当处理此图像与宏，应设置为125- 150。
5. 确定最小回合大小
   注： 此功能将排除 NMJ 轮廓阈值检测到的所有小于分析中定义值的回合。此值以像素定义。
   1. 按照第 6.4 节中描述的步骤操作，但在这种情况下，围绕 NMJ 终端中最小的回合进行选择。选择与测量的最小区域相对应的最小区域。这是稍后运行宏时设置在最小回合大小设置中的价值。
6. 定义"最大噪声公差"值
   1. 要定义宏的"查找最大噪声容差"值，请打开保存在 6.2.2 节中的通道 2 Z 堆栈。
   2. 转到弹出式菜单中的插件选项卡，选择"进程|最大值 （3D），当maximum_image_name出现时（可能需要几分钟），关闭原始图像堆栈。
   3. 选择Maximum..._image_name（新获得的图像堆栈），然后选择插件|流程|最小值 （3D），当新图像最小Maximum..._image_name接近最大值 _image_name时。。。
   4. 在工具栏中，选择进程|找到最大。。。一个新的窗口"查找最大。。。"将打开。单击复选框"预览点选择..."并用默认的宏设置 50 填充"噪声公差"框。最大点将在图像中指示为小十字架。
      1. 如果观察过多的注释活动区域（即不在不聚焦于选定的堆栈平面的活动区域之上的十字架）或在后台检测到的虚假活动区，则增加"噪声公差"值。
         1. 另一方面，如果观察未完全注释的活动区域，即焦点中的活动区未被识别，则会降低"Maxima 噪声耐受性"值。按照此程序继续尝试不同的值，直到十字架正确标记焦点中的活动区域。用这个值填充"查找最大噪声容差"。
         2. 请参阅 图 2C 示例。检测到的活动区域太多。在 图 2C 中 ，在增加"Maxima 噪声公差"值时，仅检测到焦点中的活动区域。
   5. 运行第 5.1 步中选择的代表性图像的子宏"分析"，并在之前的所有步骤中定义设置。
7. 调整低阈值和上阈值
   1. 请注意，根据称为"2_active_zone_stack_image_name"的第 6.6 步运行宏后，将出现新文件。在此图像堆栈中，"查找最大"功能检测到的活动区域由每个平面中的白点表示。
   2. 通过拖动并将其放入工具栏打开此文件，然后选择"图像|堆叠|Z 项目|投影类型=总和切片。将获得2_active_zone_stack_image_name预测。
   3. 选择图像|调整|门槛。将打开一个新的窗口"阈值"。滑动上栏以选择阈值值，其中所有所需的 foci/Brp 正点均以红色可视化。
      注： 如果阈值设置过低，将计算活动区域的超额值。如果设置过高，将错过活动区域的一小部分。
      1. 例如，请参阅 图 2E。 当阈值设置为 400 时，大多数活动区域（符号为 1 像素 foci）不包括在细分中，因为它们不以红色（图 2E）突出显示。当阈值设置为 50 值时，所有活动区域均以红色突出显示（图 2E）。
   4. 将此值定义为最低阈值。在最大值上留下"上双关语阈值"。
   5. 重新运行具有代表性的图像的子宏"分析"，并在此部分的所有前一步中定义的设置。批判性地评估生成的图像文件，并确保正确进行分割。如果不是这样，请根据分割错误的性质重新调整设置（图1，表1）。

Representative Results

图1：不适当的宏观细分结果示例。 运行"德罗索菲拉 NMJ形态测量仪"或"德罗索菲拉 NMJ布顿形态测量仪"后的结果图像。突触终端的某些部分不包括在黄色轮廓（A） 中。部分背景由黄色轮廓（B）包含在突触终端中。蓝色骨架线延伸到突触终端（C - D）之外。检测到的活动区域太多（E - E）。分析（G - G）仍未发现某些活动区域。在突触（F）之外检测到活动区域。不正确的布顿分割（仅适用于运行 德罗索菲拉 NMJ 布顿测距仪时），布顿被错过（H）或太多的布顿被分割检测到（I）。属于背景的晶体或灰尘等粒子包含在分割（J） 中。如何更改设置以避免这些错误的信息在 表 1中提供。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：宏观设置调整及其对图像细分的影响的例子。 （A） 减去 Dlg-1 免疫带突触的背景预览，在荧光显微镜上与 ApoTome 一起成像，当"滚球半径"设置为 20（A）或 500（A）时。（B） 运行图像后获得的输出图像|调整|自动阈值|尝试所有图像说明由 16 种不同的自动阈值算法获得的图像细分。（C） 设置"噪声公差"时，在 50（C）和 500（C'设置"噪声公差"时预览"细分检测到的活动区域由小十字标记。（D） 测量在突触免疫带图像背景中出现的"小颗粒"，该免疫带带有抗 Hrp，在共焦显微镜上成像。（E） 从2_active_zone_stack_ima-ge_name获得的"总和切片"投影。阈值设置为 400（E）和 50（E'）。 请单击此处查看此图的更大版本。

分割	观察到的错误	例	需要调整
NMJ 区域和周边 （以结果图像中的黄色轮廓表示）	突触终端的部分要么不包括在内 在黄色轮廓或背景部分 包含在黄色概述的突触终端中。	图 2A-B	调整"滚球半径"值。 请参阅第 6.1 节。	调整"NMJ大纲阈值"。 请参阅第 6.2 节。
NMJ 长度相关参数 （以结果图像中的蓝色骨架线表示）	蓝色骨架线要么延伸到或 整个突触终端上不存在。	图2C-D	调整"滚球半径"值。 请参阅第 6.1 节。	调整"NMJ大纲阈值"。 请参阅第 6.2 节。
布尔普阳性双关语 （以结果图像中的点表示）	检测到的活动区域太多。	图2E-E'	降低"查找最大噪声公差"值。 请参阅第 6.5 节。
布尔普阳性双关语 （以结果图像中的点表示）	分析会忽略活动区域。	图2G-G'	增加"查找最大噪声公差"值。 请参阅第 6.5 节。	降低"低阈值"。 请参阅第 6.6 节。
布尔普阳性双关语 （以结果图像中的点表示）	检测到活动区文物 突触终端外。	图2F	调整"活动区阈值"第 6.2 节。	提高"Brp-双关语较低阈值"。 请参阅第 6.6 节。
小颗粒	粒子，如晶体或灰尘的一部分 背景似乎包括在 细分。	图2J	选择"删除小颗粒"框。 请参阅第 6.3 节。	确定小颗粒最大尺寸。 请参阅第 6.3 节。
布顿细分	不正确的布顿分割 （仅适用于德罗索菲拉 NMJ 布顿形态测量仪; 不要使用德罗索菲拉NMJ形态测量仪进行布顿分割）。	图2H-I	调整"NMJ大纲阈值"。 请参阅第 6.1 节。	确定"最小回合大小"。 请参阅第 6.4 节。

表1：宏可以生成的图像分割中不同类型的错误的故障排除指南。 此表描述了宏产生的不同类型的图像分割错误。这些可以很容易地在结果图像中检测到。每个错误类型的示例都显示在 图 1 中。在表的"调整部分"中，突出显示需要调整的设置，并引用用户到第 6 节的关键子步骤，该子步骤描述了如何调整这些设置。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI