اختبار تفضيل الذوق: طريقة لقياس سلوك التغذية في دروسوفيلا

Overview

يصف هذا الفيديو تقييم تفضيل الطعم ، وهو أسلوب سلوكي يستخدم لقياس الجاذبية أو التجنب تجاه الحلول الملونة التي طعمها مختلف من خلال تقييم تلوين بطن الذبابة بعد ابتلاع المادة المفضلة. يوضح البروتوكول المميز الإجراء المستخدم لقياس تفضيل الذباب تجاه حلول تركيزات السكروز المختلفة.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من بانتل وتاسير، اختبار تفضيل الذوق للبالغين دروسوفيلا، J. Vis. Exp. (2016).

1. المجاعة

1. إعداد قوارير الجوع يطير عن طريق تشبع كرة القطن مع 18.2 MΩ المياه في الجزء السفلي من قارورة ذبابة القياسية. بدلا من ذلك، تشبع بالمثل شريط صغير من ورق التصفية مع 18.2 MΩ المياه ومكان في زاوية داخل القارورة.
2. جمع الذباب في مجموعات من الحيوانات ~ 100 على وسادة CO₂ ومن ثم إضافة الذباب إلى قارورة أعدت.
   ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج مع الحيوانات التي هي أقل من 5 أيام من العمر. ومع ذلك ، يمكن التحكم في العمر الدقيق للحيوانات كمتغير تجريبي لتحديد التغيرات في تفضيل الطعم بمرور الوقت.
3. استخدام كرة القطن أو سدادة رغوة لتأمين قوارير مغلقة. ضع قنينات على جانبها في حاضنة خاضعة للرقابة البيئية. الحفاظ على درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية، والرطوبة فوق 70٪. اترك القنينات دون أن يمسها أحد لمدة 24 ساعة.

2. طعم تفضيل المقايسة

1. قم بإعداد جميع الاختبارات للمقاايسة في نفس يوم الاختبار.
   ملاحظة: ستختلف السترات الدقيقة التي سيتم استخدامها اعتمادا على السؤال التجريبي الذي يتم طرحه. فيما يلي مثال على tastants المستخدمة في هذا البروتوكول. راجع القسم 4 للحصول على تحسينات.
   1. إعداد tastant التحكم (1 mM السكروز) من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من محلول السكروز 100 mM، 13 ميكرولتر من تلوين الطعام الأحمر، و 977 ميكروغرام من 18.2 MΩ المياه.
   2. إعداد tastant التجريبية (5 mM السكروز) عن طريق الجمع بين 50 ميكرولتر من محلول السكروز 100 mM، 10 ميكرولتر من تلوين الطعام الأزرق، و 940 ميكروغرام من 18.2 MΩ المياه.
2. جعل حجرات المقايسة باستخدام معيار 100 مم × 15 مم طبق بتري البلاستيك أعدت بالطريقة التالية:
   1. ضع ثلاث قطرات 10 ميكرولتر من تسانت التحكم أقرب حافة اللوحة في الساعة 12 و 3 قطرات أخرى في الساعة 6. تأكد من أن التباعد بين القطرات متشابه.
   2. ضع ثلاث قطرات 10 ميكرولتر من التيستانت التجريبي أقرب حافة اللوحة في الساعة 3 و 3 قطرات أخرى في الساعة 9. تأكد من أن التباعد بين القطرات متشابه.
   3. كرر الخطوتين 2.2.1 و 2.2.2 للعديد من النسخ المتماثلة كما هو مطلوب.
3. فارغة 1 قارورة من ~ 100 الذباب جوعا على وسادة CO₂ فقط لفترة كافية لتخدير جميع الحيوانات (ما يقرب من 10 ثانية). فرشاة الحيوانات في منتصف غرفة الفحص المعدة وتغطي مع غطاء الطبق.
   ملاحظة: وينبغي تجنب فترات أطول من_التعرض ثاني أكسيد الكربون لتحسين وقت التعافي والحد من التداخل مع سلوك التغذية. يمكن استخدام التعرض للجليد (~ 5 دقائق) لتخدير لتجنب الآثار السلوكية CO₂ التي قد تنشأ من التعرض المحدود حتى.
4. ضع غرفة المقايسة في صندوق من الورق المقوى معتم. تأكد من تسمية خارج منطقة الجزاء مع الشرط والنمط الجيني يجري اختبارها.
5. ضع الإعداد بأكمله (غرفة الفحص الموجودة داخل صندوق من الورق المقوى من الخطوة 2.4) في حاضنة 25 درجة مئوية مع رطوبة 70٪ على الأقل لمدة ساعتين.
6. كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.5 لكافة النسخ المتماثلة.
7. بعد ساعتين، ضع حجرات المقايسة، التي لا تزال موجودة داخل صناديق من الورق المقوى، مباشرة في ثلاجة -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للكم.

3. الذوق تفضيل المقايسة الكمي

1. السماح لغرفة مقايسة واحدة بالإحماء حتى درجة حرارة الغرفة (حوالي 5 دقائق).
2. تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام فرشاة أو زوج من ملقط، مجموعة الحيوانات على أساس لون البطن: الأحمر والأزرق والأرجواني أو واضحة (الشكل 1).
3. سجل عدد الحيوانات في كل تجمع. النظر في الحيوانات واضحة لم تشارك في المقايسة، وبالتالي لا تدرج لهم في أي حسابات.
4. حساب مؤشر التفضيل وفقا لإحدى المعادلات التالية:
   1. إذا تمت إضافة tastant التجريبية من الفائدة إلى الصبغة الحمراء، ثم استخدام (N_الأحمر + 0.5N_{الأرجواني})/(N_الأحمر + N_الأزرق + N_{الأرجواني}).
   2. إذا تمت إضافة tastant التجريبية إلى الصبغة الزرقاء، ثم ضبط المعادلة إلى (N_الأزرق + 0.5N_{الأرجواني}) / (N_الأزرق + N_الأحمر + N_{الأرجواني}).
5. كرر الحسابات لجميع الشروط التجريبية ويكرر.

4. التحسين من الذوق تفضيل المقايسة

1. حدد تجريبيا تركيز مؤشرات تلوين الطعام لاستخدامها حتى لا يؤثر تلوين الطعام على نتيجة فحص الطعم ، على النحو التالي:
   1. إعداد 4 tastants باستخدام نفس المركب الأساسي(على سبيل المثال 5 mM السكروز) كما هو مبين في الخطوة 2.1، ولكن حذف تلوين الطعام.
   2. إضافة 1.3٪ تلوين الطعام الأحمر إلى واحدة من التيستات. جعل المتبقية 3 التيستات مع تلوين الطعام الأزرق من تركيزات متفاوتة في كل أنبوب(على سبيل المثال 0.6٪، 1٪، و 1.3٪).
   3. خطوات البروتوكول الكامل من 2.2 إلى 3.4 لكل زوج من ال tastant: 1.3٪ أحمر مقابل 0.6٪ أزرق. 1.3٪ أحمر مقابل 1٪ أزرق و1.3٪ أحمر مقابل 1.3٪ أزرق.
   4. كرر الخطوة 4.1.1-4.1.3 مع نسب مختلفة من تلوين الطعام الأزرق حتى متوسط مؤشر الأفضلية قيمة 0(الشكل 2).
      ملاحظة: كنقطة انطلاق، 1.3٪ تلوين الطعام الأحمر إلى جانب 1٪ تلوين الطعام الأزرق عادة ما تسفر عن نتائج جيدة. إذا كان لا يمكن مطابقة تركيز مرضي من تلوين الطعام الأزرق إلى 1.3٪ صبغة، ثم الخطوة 4.1.1 إلى 4.1.3 يمكن أن تتكرر مع تركيزات متفاوتة من التلوين الأحمر وتركيز مستمر من تلوين الطعام الأزرق.
   5. تحليل جميع الشروط ليتم اختبارها مع نفس تركيزات تلوين الطعام الأمثل.

Representative Results

الشكل 1: نتائج فحص تفضيل الذوق. تظهر بعض الأمثلة في تباين تلوين البطن. أحمر داكن بلعها (A). أحمر فاتح بلعها (ب). الأزرق الداكن بلعها (C). الأزرق الفاتح بلعها (D). يتم النظر في البطن الأرجواني عندما يظهر اللون بأكمله الأرجواني (E)، أو عندما تظهر مناطق متميزة من البطن أجزاء من الأحمر (رأس السهم) وأجزاء منفصلة من الأزرق (السهم) (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: السيطرة على آثار تلوين الطعام. إضافة تلوين الطعام إلى التيستات لا ينبغي أن يكون لها أي تأثير على تفضيل طعم الحيوانات. اختلاف تركيز الصبغة الزرقاء مع الحفاظ على تركيز ثابت من الصبغة الحمراء كشفت عن مزيج الأمثل من 1.3٪ الأحمر إلى 1.0٪ الأزرق. ويشار إلى ذلك من خلال قيمة مؤشر تفضيل بالقرب من 0.5. القيم هي متوسط الانحراف المعياري ±. *p < 0.05, ***p < 0.001 من اختبار t للطالب ذو الوجهين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben)	McCormick	N/A
Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers	Fisher	03-395-455
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petri dish (100 mm x 15 mm)	BD Falcon	351029	Reuseable if thoroughly washed and dried
Quick-Snap Microtubes	Alkali Scientific Inc.	C3017
Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben)	McCormick	N/A
Sucrose	IBI Scientific	IB37160