Overview
Это видео описывает технику внутримышечной инъекции для доставки соединений в спинные мышцы взрослой зебры.
Protocol
1. Инъекция ДНК-вакцины и электропорации
- Для иммунизации в соответствии с этим протоколом, используйте здоровые, от 6 до 12 месяцев взрослых зебры. Держите рыбу в сквозной системе с 14/10 ч свет / темный цикл, с максимум семь рыб на 1 л воды.
- Приготовьте 0,02% 3-аминобензойной кислоты этилэстер (трикаин) раствор (рН 7) в резервуарной воде для обезболить рыбу. Используйте 10 см чашки Петри или что-то подобное.
- Подготовьте восстановительный бак, заполнив стакан 5 л 3 л чистой системной воды.
- Подготовьте прививое обивку, чтобы держать рыбу в фиксированном положении во время вакцинации. Возьмите 5 х 7 см2 кусок губки толщиной от 2 до 3 см. Вырезать паз в губку с лезвием скальпеля или острыми ножницами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один и тот же прививоющий обивка может быть использован в нескольких экспериментах. Дезинфицировать губку между экспериментами, замачивая его в 70% этилового спирта и дать высохнуть. - Тщательно замочите губку в системной воде и установите губку на чашку Петри.
- Быстрый рыбы 24 ч до вакцинации.
- Обезболить одну зебру, поместив ее на чашку Петри, содержащую 0,02% трикаина. Подождите, пока рыба не отреагирует на сенсорную стимуляцию и пока не будет движения жабры. Обезботь одну рыбу за один раз.
- Используя пластиковую ложку, перенесите обезболивающее зебру на влажную губку и установите винтраловую сторону рыбы вниз в паз. В правильном положении убедитесь, что голова и большая часть тела рыбы находятся внутри паза и спинной плавник и хвост выступают из паза.
- Под микроскопом, тщательно поместите иглу в примерно 45 "угол близко к спинной мышцы зебры, используя X- и y-оси тонкой настройки колес на микроманипуляторе.
- Найти небольшое пятно без чешуи перед спинным плавником, где нажатие иглы не требует силы. Если сопротивление ощущается, попробуйте соседнее место. Избегайте травм позвоночника, спинного плавника или чешуи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла изгибается при нажатии, укоротить иглу немного, разрезав ее. - Используйте переключатель стопы, чтобы постепенно вводить раствор вакцины в мышцу. Наблюдайте за инъекцией через микроскоп: фенол красный виден, как он входит в мышечную ткань. При необходимости отрегулируйте продолжительность пульса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, используйте кнопку инициатора импульса на передней панели пневматического насоса для инъекции. Тем не менее, использование удаленного переключателя ног позволяет использовать другую руку для регулировки длины импульса на 10-поворотное колесо циферблата. Избегайте введения раствора слишком быстро, так как это может привести к чрезмерному повреждению тканей. Убедитесь в том, чтобы не вводить воздух. - Электропорат рыбы сразу после инъекции. Убедитесь, что рыба все еще находится под наркозом. Держите рыбу на губке и установите рыбу между электродами типа пинцета, так что электроды расположены по обе стороны от места инъекции. Не нажимайте на электродный пинцет слишком туго, но держите оба электрода в контакте с рыбой.
- Нажмите кнопку запуска на электропораторе, чтобы дать шесть импульсов 40 V, 50 мс.
- Аккуратно перенесите рыбу в восстановительный резервуар.
- Очистите электроды после каждого электропорации, проводя их с 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следите за благополучием рыбы после вакцинации. Усыпание любой рыбы с признаками дискомфорта (медленное восстановление после анестезии, аномальное плавание, задыхаясь) в 0,04% tricaine. После выздоровления перенесите рыбу в блок потока и накормите ее нормально.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
Plastic spoon | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench |