Summary
פרוטוקול זה דן חי דיסקציה של
Abstract
הבהרת המנגנונים של תחבורה axonal הוכיח להיות חשוב מאוד בקביעת כיצד פגמים הובלה למרחקים ארוכים להשפיע על מחלות נוירולוגיות שונות. פגמים בתהליך זה חיוני יכול להיות השפעות מזיקות על ההתפתחות העצבית ואת תפקוד. פיתחנו פרוטוקול לנתיחה אשר נועד לחשוף את
Protocol
1. הכנה של ריאגנטים
- הכן את הכנת המאגר לנתיחה על ידי הוספת מרכיבים הבאים: 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 מ"מ MgCl 2, 2mm KCl, HEPES 5mm, סוכרוז ו 36 מ"מ 1000 PH, 7.2 מ"ל ל ולסנן לעקר.
2. הכנה Dissection
- קוביית Siligard: ג'ל הוא לחתוך סנטימטר בערך רחב, 1 אינץ ארוך על 1cm גבוהה. הקוביה הג'ל מושם על זכוכית שקופית במהלך לנתיחה. קוביות ניתן להשתמש יותר מפעם אחת.
- סיכות: סיכות המשמש לנתיחה צריך להיות תוספת קצרה. החלק התחתון של סיכות חדות minutien עובד הכי טוב לנתיחה.
- זקוק חד באביב מספריים microdissection.
- צריך שני מלקחיים היטה בסדר.
3. אוסף של הזחלים
- הנודד 3 rd הזחלים instar כי מביעים GFP חלבון מתויג שלפוחית נאספים על גבי צלחת פטרי.
- הזחלים נשטפים במים deionized להיפטר כל האוכל.
4. דיסקציה חיים של זחלים
- הזחל מועבר קוביית לנתיחה ג'ל על זכוכית שקופית. הזחל הוא שקוע בתוך חיץ לנתיחה.
- Larva היא שואפת את הקדמי ואת האחורי באמצעות שתי סיכות בסדר עם הצד הגבי למעלה.
- בעזרת מספריים microdissection, חתך קטן הוא עשה את קו האמצע לקראת סוף האחורי. מתוך חתך זה לחתוך נעשית דרך הקדמי. באמצעות שתי סיכות, להצמיד את לציפורן לחתוך בשולי לרוחב.
- הוסף ירידה של ביתור חיץ. הסר בזהירות את הבטן, המעיים וגופים שומן עם מלקחיים. רוב הרקמות הללו בדרך כלל לטפטף החוצה במהלך חיתוך הגבי.
- החלף את החיץ עם חיץ לנתח טריים. הזחל לא צריך להיות יבש כל הזמן צריך להיות ביתור חיץ.
- Incubations משתמש MitoTracker סמנים LysoTracker vivo או נעשים בשלב זה, על ידי דילול בסמן vivo במאגר לנתיחה. לאחר דגירה של בטוש vivo לשטוף את הזחל גזור כמה פעמים (5 שוטף ומהיר) באמצעות חיץ לנתח טריים.
- לאחר החלפת לשטוף האחרונה לדחוף את הסיכות לתוך syligard ומיד coverslip. הזחלים עכשיו הוא מוכן לצורך השגחה.
5. הדמיה חיה של הזחלים גזור
- מניחים את coverslip וג'ל לבמה מיקרוסקופ ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
- אנו משתמשים העדשה 100x אל שלפוחית תמונה מתויג בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. ביטוי של GFP בגופם של תא גנגליון הגחון מוערך הראשון לפני עצבים סגמנטלי הם צילמו. אם מכתים GFP חזקים הוא ציין את הגופות תא גנגליון הגחון, עצבים הם צילמו אז בשימוש לצורך הערכה.
- באמצעות מערכת תצוגה כפולה עם מסננים עבור CFP / או YFP RFP / YFP ולהציג תוכנה לפצל אנחנו יכולים בו זמנית two תמונה חלבון מתויג in vivo.
6. נציג תוצאות
איור 1:. תמונה מייצגת מראה שלפוחית axonal רבים על מסלולים רבים בתוך axonal עצב סגמנטלי הזחל הערה כתמים של ה-GFP, המייצג הצטברויות axonal.
איור 2: תמונת מראה נציג מסלול axonal יחיד עם שלפוחית axonal רבים בתוך עצב סגמנטלי הזחל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בתחום ההדמיה vivo התחבורה שלפוחית סינפטית בתוך העצבים תסיסנית הזחל סגמנטלי הוא כלי רב עוצמה ללימוד מנגנוני בתחבורה axonal. השתמשנו בעבר בפרוטוקול זה על מנת להעריך את הדינמיקה בתוך התחבורה עצבים הזחל להביע מורחבת חוזר polyQ להבהיר כיצד התפשטות חוזרת להשפיע על הדינמיקה של שלפוחית התחבורה 3. שימוש בפרוטוקול זה מהירות התנועה שלפוחית ניתן לקבוע על ידי המרת הזרמים וידאו רשם גלים. שימוש בגנטיקה, תחבורה GFP שלפוחית ניתן דמיינו בתוך האקסון בודד או בתוך כמה אקסונים באמצעות מנהל התקן ספציפי GAL4 לנהוג ביטוי של GFP. בנוסף הדינמיקה התחבורה יכול גם להיות שנצפתה הזחלים נושאת מוטציות של גנים ספציפיים. יתר על כן two שלפוחית מתוייגים עם גרסאות ה-GFP שונים (CFP או RFP) ניתן דמיינו בו זמנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
SG נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב באפלו ומ ג'ון ר Oishei קרן.
ח"כ נתמך על ידי פרס תלמיד מחקר על ידי CURCA ב UB.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).