Summary
Ce protocole décrit la procédure détaillée pour la cryoconservation de cellules iPS humaines dans un milieu de cryoconservation KnockOut SR et la récupération de ces cellules en complète KnockOut Feeder SR gratuit (KSR-FF) moyen ou le chargeur milieu à base de SR huitièmes de finale.
Abstract
La découverte en 2006 que les fibroblastes humains et de souris pouvaient être reprogrammées pour produire des cellules iPS 1-3 avec des qualités remarquablement similaires aux cellules souches embryonnaires a créé une nouvelle source précieuse de cellules pluripotentes pour la découverte de médicaments, la thérapie cellulaire, et la recherche fondamentale.
Les médias et les réactifs GIBCO ont été à la pointe de la recherche de cellules souches pluripotentes pendant des années. Knockout DMEM supplémenté avec remplacement Knockout sérum est le média de choix pour la croissance des cellules souches embryonnaires et maintenant la culture de cellules iPS 3-9. Cet or média standard du système peut maintenant être utilisé pour le chargeur sans la culture avec l'ajout de SR Knockout facteur de croissance cocktail.
Traditionnelle ES humaines et des méthodes de culture de cellules iPS nécessite l'utilisation de la souris ou humains couches nourricières de fibroblastes, ou le chargeur milieu conditionné. Ces méthodes de culture sont une main-d'œuvre, dur à l'échelle et il est difficile de maintenir les cellules indifférenciées hanches à cause des conditions indéfini. Invitrogen a développé SR Knockout facteur de croissance cocktail pour vous permettre de passer facilement de vos hanches et des cultures de cellules hES d'alimentation sans tout en conservant votre utilisation du SR Knockout.
Protocol
Remarque: Pour maintenir des conditions de culture stérile, toutes les procédures dans ce protocole sont réalisées en utilisant des pratiques de laboratoire stérile et réalisée sous hotte à flux laminaire.
Avant de commencer, s'assurer que tout média est équilibré à 37 ° C et de manière appropriée gazés.
Préparation des boîtes de culture Geltrex enduits
Note: voir l'annexe pour l'utilisation de boîtes de culture CELLstart couché.
- Dégeler un tube de Geltrex (1 ml) lentement à 2-8 ° C et diluer 1:100 c'est dans 99 ml de Knockout D-MEM/F-12. Mélanger délicatement la solution.
Remarque: Certaines des lignées de cellules iPS peuvent nécessiter une dilution différente Geltrex pour une croissance optimale. Voir l'annexe pour des dilutions alternatives. - Couvrir toute la surface de chaque boîte de culture avec la solution Geltrex (1 ml pour un plat de 35 mm, 1,5 ml pour un plat de 60 mm).
- Sceau chaque plat avec du Parafilm pour éviter le dessèchement et incuber les plats pendant 1 heure à 37 ° C.
Remarque: À ce stade, vous pouvez stocker les boîtes de culture Geltrex enduits à 4 ° C jusqu'à un mois. Sceau chaque plat avec du Parafilm pour empêcher la Geltrex de se dessécher. - Avant d'utiliser, de transférer les plats Geltrex enduits d'une hotte à flux laminaire et de leur permettre de s'équilibrer à température ambiante (environ 1 heure).
Préparation complète d'alimentation sans SR KnockOut Medium
- Pour préparer 1 mL de 10 ug / ml solution FGF basique, de façon aseptique mélanger les composants énumérés ci-dessous. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C jusqu'à 6 mois.
FGF basique 10 ug D-PBS 990μL 10% de BSA 10 uL
Remarque: BSA peut être substitué avec HSA ou SR Knockout à la même concentration. - Pour préparer 50 ml de solution 2 Dispase mg / mL, de façon aseptique mélanger les composants énumérés ci-dessous. Filtre stériliser la solution et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.
Dispase 100 mg D-PBS 50 ml - Pour préparer 100 ml de SR KnockOut complète Feeder-Free (KSR-FF) aseptiquement combiner les composants répertoriés dans le tableau ci-dessous.
Composante Concentration Stock Concentration finale Volume Knockout DMEM/F12 (Cat. no. 12660-012) - 1X 76,8 ml Glutamax-I (cat. n ° 35050-061) 200 mM 2 mM 1 ml KnockOut SR (Cat. no. 10828-028) - 20% 20 ml KnockOut SR-GFC (Cat. no. A10580-01) 50X 1X 2 ml bFGF (Cat. no. PHG0024). 10 ug / ml 20 ng / mL 200 uL
Vous pouvez ranger le support KSR-FF à 2-8 ° C jusqu'à une semaine. - Juste avant la pré-équilibration du milieu complet à la température et de gaz, ajouter aseptiquement le volume requis de 2 mercaptoéthanol (55 mM de concentration des stocks) pour une concentration de 0,1 mM final. Par exemple, pour préparer 100 ml de KSR-FMoyenne F ajoutez 182 uL de 55 mM de 2-mercaptoéthanol (1:550 dilution) Alternativement, le 2-mercaptoéthanol peuvent être ajoutés au milieu de 1X terminé et stocké à 2-8 ° C jusqu'à une semaine.
Préparation de congélation / Cryoconservation Medium
Le milieu de cryopréservation se compose de deux médias; milieu de congélation A et B. milieu de congélation Ils sont ajoutés aux cellules à différents moments et doivent rester séparés. Ils sont chacun 50% du volume total des moyennes Cryoconservation nécessaire. Le volume total des moyennes Cryoconservation nécessaire est de 1 mL pour chaque flacon d'être gelés. Un plat de 90% confluentes 60mm de CSEh peuvent être utilisés pour la banque 2 flacons de CSEh dans les médias cryoconservation.
Préparer une quantité suffisante de chaque milieu de congélation avec un supplément de 2 à 5 ml pour assurer excédent.
| Un milieu de congélation (50% du volume final): | 50% DMEM/F12 | KSR 50% |
| Milieu de congélation B (50% du volume final): | 80% DMEM/F12 | 20% de DMSO |
Exemple:
Si vous êtes de congélation 20 flacons de cellules, vous aurez besoin de 20 ml de Medium cryoconservation. Ajouter 4 ml d'excédent pour un total de cryoconservation moyen 24ml. Cela signifie que vous aurez besoin 12 mL de milieu de congélation A. (50% de 24ml) et 12 mL de milieu B de congélation (50% de 24ml)
| Un milieu de congélation (12 ml): | 6 ml DMEM/F12 | 6 ml KSR |
| Milieu de congélation B (12 ml): | 9,6 ml DMEM/F12 | 2,4 ml de DMSO |
La composition finale du milieu cryoconservation est de 65% DMEM/F12, KSR 25%, et 10% de DMSO.
Cryoconservation iPSCs
- Pré-chauffer le volume requis de Dispase dans un bain d'eau à 37 ° C. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis.
- Pré-équilibrer le volume requis de KSR-FF dans un bain à 37 ° C pendant 15 min de l'eau. Reportez-vous au tableau 1below pour des détails sur les volumes requis.
- Aspirer le milieu épuisé du récipient de culture à l'aide d'une pipette, et rincer les cellules deux fois avec du D-PBS.
- Ajouter délicatement solution de dispase préchauffée à la cuve de culture (par exemple, 1 ml de solution de dispase par boîte de culture de 60 mm). Agiter le récipient de culture pour enrober la surface des cellules entières.
- Incuber le récipient de culture à 37 ° C pendant 3 minutes.
- Retirez le récipient de l'incubateur, aspirer la solution Dispase, et laver délicatement les cellules avec du D-PBS.
- Gratter délicatement les cellules de la surface de la boîte de culture cellulaire à l'aide d'un grattoir, et le transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml stérile.
- Rincer la boîte de culture à deux reprises avec KSR-FF, doucement "pulvériser off" toutes les cellules qui n'ont pas détaché. Piscine de rinçage moyenne avec des cellules dans le tube de 15ml.
- Centrifuger le tube à 200 xg pendant 5 minutes à température ambiante pour un culot cellulaire.
- Aspirer délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire et le jeter.
- Préparer une quantité suffisante de cryotubes. Une fois que les cellules sont en contact avec le DMSO, ils devraient être aliquotés et congelés dans les 2-3 minutes.
- Tapotez doucement le tube, pour bien déloger le culot cellulaire du fond du tube et remettre en suspension les cellules dans un milieu de congélation A. [par un léger pipetage de haut en bas en utilisant un 5-mL pipette sérologique]. Suite à la suspension uniforme de touffes, ajouter un volume égal de milieu de congélation B à elle, d'une manière goutte à goutte, tout en douceur tourbillonnant la suspension cellulaire à se mélanger.
Remarque: À ce stade, les cellules sont en contact avec le DMSO, et les travaux doivent être effectués de manière efficace. Une fois que les cellules sont en contact avec le DMSO, ils devraient être aliquotés et congelés dans les 2-3 minutes. - Aliquote de 1 ml de la suspension cellulaire dans chaque cryovial.
- Placer rapidement les flacons dans un Mr. Frosty [rapidement geler] et de le transférer à -80 ° C la nuit.
- Après une nuit à -80 ° C, le transfert des cellules à un réservoir d'azote liquide pour le stockage à long terme.
dégel du flacon IPSC et la récupération des cellules
Remarque: KSR-FF peuvent être remplacés par KSR contenant MEF milieu conditionné ou moyennes KSR pour une utilisation avec les mangeoires. Voir l'annexe pour les instructions pour la préparation des supports.
Préchauffer 10mL de KSR-FF moyennes dans un tube de 50 ml.
- Equilibrer la quantité appropriée de Geltrex enduit de plats à la température ambiante et aspirer le liquide de la vaisselle juste avant plaquager cellules.
- Retirez délicatement la CSEh (ou COPSi) flacon de réservoir d'azote liquide de stockage.
- Rapidement dégel flacon congelé des cellules dans un bain à 37 ° C l'eau, jusqu'à ce que juste un petit morceau congelé reste dans le flacon.
- Vaporiser flacon avec 70% d'isopropanol de décontaminer et de le transférer à la hotte de culture de tissus stériles.
- Transférer de façon aseptique le contenu entier du flacon dans un tube de 15 ml conique à l'aide d'une pipette 5 ml.
- Rincer la fiole avec 1 ml de KSR-FF et ajoute à cela le tube de 15 ml centrifugeuse.
- Lentement, ajouter 4 ml de KSR-FF goutte à goutte à des cellules dans le tube de 15 ml conique. Tout en ajoutant le support, déplacez doucement le tube avant et en arrière de mélanger les cellules. (Ce qui réduit le choc osmotique dans les cellules).
- Centrifuger le tube 15 ml avec la suspension cellulaire à 1000rpm (200 x g) pendant 2 minutes à température ambiante.
- Soigneusement aspirer et jeter le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
- Re-suspendre le culot cellulaire dans la pré-chauffé KSR-FF (p.ex. plats mm 4mL/60) en utilisant une pipette 5 ml et doucement la pipette les cellules de haut en bas jusqu'à ce culot cellulaire est complètement dispersée. A la viabilité supérieure à 70% est attendue, cependant, si la viabilité est inférieure à 70%, il peut prendre plus de temps pour les cellules pour atteindre la confluence.
- En utilisant la même pipette, transférer la suspension cellulaire goutte à goutte à boîte de culture Geltrex enduits pré-équilibrée à la température ambiante.
- Placez la boîte de culture dans un incubateur à 37 ° C, avec une atmosphère humidifiée de 4 à 6% de CO 2 dans l'air. Navire dans un tourbillon soigneusement nord au sud, d'est en ouest, afin de répartir uniformément les cellules.
- Doucement fluides changer la boîte de culture de 24 heures après décongélation et quotidiennement par la suite pour éliminer les débris cellulaires et de fournir des nutriments frais jusqu'à ce que le plat est d'environ 70-80% de confluence. Pour la culture continue et repiquage de vos cellules iPS, reportez-vous à notre protocole intitulé «Feeder-Free Culture et repiquage des cellules iPS humaines utilisant remplacement complet KnockOut Sérum Feeder milieu exempt"
Résultats attendus
Les cellules doivent être à peu près 70-80% confluentes avant cryoconservation. Dispase résultats de digestion dans le curling et pliage des colonies le long des marges colonie. Après la récolte des cellules, ils sont gelés tant que petites touffes dans les médias cryoconservation. Une fois le flacon est décongelé, les cellules de récupérer et de joindre à l'antenne de pré-revêtu comme de petites touffes. Ils grandissent rapidement conduit à un plat confluentes en 5-6 jours.
Tableau 1 - Volumes recommandée
| Composante | Plat 35mm | Plat 60mm | Plat 100mm |
| Remplissez KnockOut SR moyennes | 2 ml | 4 ml | 10 ml |
| Solution Geltrex | 1 ml | 1,5 ml | 4-5 ml |
| Dispase | 0,5 ml | 1 ml | 3-4 ml |
| D-PBS pour le rinçage | 2 ml | 4 ml | 10 ml |
S'il vous plaît cliquez ici pour voir l'appendice .
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) | |
| KnockOut Serum Replacement | 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | 21985-023 | ||
| Dispase | 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | 14190-144 | ||
| DMSO, 500mL | JT Baker | JT9224-1 | |
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60 mm Tissue Culture treated dishes | |||
| Liquid nitrogen storage tank | |||
| Isopropanol freezing containers | |||
| 1.5 mL Cryovials |
References
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Maherali, N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Li, W. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Liao, J. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).
- Dimos, J. T. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Aasen, T. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).
- Park, I. H. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).
