Summary
We ontwikkelden een alternant achterbeen lossen model in muizen. Het belangrijkste voordeel van onze achterbeen lossen staart-ring methode over de conventionele Morey-Holton tail-tractie techniek is een simpele eenvoudige procedure dat stress vermindert op het dier.
Abstract
De Morey-Holton achterbeen lossen (HU) methode is een algemeen aanvaarde National Aeronautics and Space Administration (NASA) op de grond model voor het bestuderen van onbruik-atrofie bij knaagdieren 4-6. Onze studie evalueerde een alternant methode om de gouden standaard Morey-Holton HU tail-tractie techniek in muizen. Vierenvijftig vrouwelijke muizen (4-8 ma.) Waren HU voor 14 dagen (n = 34) of 28 dagen (n = 20). Herstel van HU werd vastgesteld na 3 dagen van het normale kooi ambulantie volgende HU (n = 22). Leeftijd afgestemd muizen (n = 76) diende als dragende controles.
Voorafgaand aan de HU een staart ring werd gevormd met een 2-0 steriel chirurgisch staaldraad die werd door de 5 e, 6 e of 7 e inter-vertebrale schijfruimte en gevormd tot een ring, waaruit de muizen werden opgeschort. Vertebrale locatie voor de staart-ring werd geselecteerd om lichaamsgewicht van de dieren de juiste balans zonder zich te bemoeien met de ontlasting.
We bepalen het succes van deze roman HU techniek door het beoordelen van het lichaamsgewicht voor en na de HU, de mate van soleus atrofie, en bijnier massa na HU. Lichaamsgewicht van de muizen voorafgaand aan de HU (24,3 ± 2.9g) had geen significante daling direct na 14 quinquies van HU (22,7 ± 1.9g), 28d van de HU (21,3 + 2,1 g) of na 3 dagen herstel (24,0 ± 1,8 g) . Soleus spiermassa aanzienlijk gedaald (-39,1%, en -46,6%) na de HU voor 14 dagen en 28 dagen respectievelijk (p <0,001). Na drie dagen van herstel soleus massa sterk toegenomen tot 74% van de controle waarden. Bijnier gewichten van HU muizen waren niet verschillend in vergelijking met controle muizen.
Het succes van onze nieuwe HU methode is aangetoond door het behoud van lichaamsgewicht van de dieren, te vergelijken bijnier gewichten, en soleus atrofie volgende HU, wat overeenkomt met de verwachte waarden van de literatuur 2, 7, 8. De belangrijkste voordelen van deze HU methode zijn: 1) het gemak van de staart examen tijdens de schorsing, 2) verminderde kans op cyanotisch, ontstoken, en / of necrotische staarten frequent waargenomen met staart-taping en HU, 3) geen mogelijkheid om van de muizen het kauwen van de tractie tape en coming out van de opschorting apparaat, en 4) een snel herstel en normale kooi-activiteit direct na de HU.
Protocol
Pre-Surgery Instrumenten / materialen
- Draadtang / tang
- Gaas 2 x 2 "pads
- Verwarming pad
- Zilvernitraat sticks
- Steriele chirurgische handschoenen
- Isofluraan inhalatie
- Chloorhexidinegluconaat 4% (Antiseptische chirurgische scrub)
- Steriele 2-0 chirurgisch staal hechtdraad
- 25 X 5 / 8 A gauge naald (geautoclaveerd)
- Hemostaat (geautoclaveerd)
- Chirurgisch staal hechtdraad
Chirurgie Procedure
- Maak een steriel veld. Volg steriele procedure.
- Verdoven muis met 2 - 3% isofluraan.
- Plaats muis op de verwarming pad.
- Scrub staart met Chloorhexidine oplossing.
- Zoek 5, 6 of 7 e de ruimte tussen de (tussen twee benige bulten op de staart, beginnen te tellen vanaf het einde van het lichaam van haar, aan de basis van de staart).
- Gebruik hemostaat en 25G naald om een gaatje te maken tussen twee wervels, in de intervertebrale ruimte.
- Gebruik de kniptang op de stalen hechting cut 10 cm lang.
- Verwijder de naald en steek stalen hechtdraad door het gat, 5 cm van de hechtdraad aan beide uiteinde van de staart.
- Elke kant van de staart moeten hebben + 5 cm van de hechtdraad.
- Plaats duim tip op staart.
- Gebruik je vrije hand en wind de stalen hechting op het topje van je duim en draai de uiteinden om een grote lus te vormen. De wond of ronde gedeelte moet worden + 3 mm lang.
- Verwijder uw duim.
- Klem een streng van hechtdraad met de hemostaat en buig het in een kleinere lus, aan het einde van die zo dicht mogelijk aan de draai op de originele grote lus.
- Knip overtollige draad, en buig de gedraaide draad terug.
- Als er een overschot bloeden, kunt u stoppen met de zilvernitraat sticks.
- Schakel de isofluraan en leg de muis in een enkel huis kooi om te herstellen voor 5-7 dagen voorafgaand aan de achterbeen lossen. De staart ringen verstrikt raken als er meer dan een muis is samen gehuisvest.
1. Achterbeen Lossen Procedure
Materialen
- Maat 10-24 X 4 machine schroeven, een per dier.
- Nylon moer maat 10 - 24, een per dier.
- Vleugelmoer maat 10 x 24, twee per dier.
- Washer size ¼ X 1, twee per dier.
- Vissen draaibare met karabijnhaak size # 6, 1-11/16 ", en een per dier.
- Metalen naaimachine spoel. Een per dier.
- Kleine paperclip voor de S-vormige haak, een per dier
- Tang.
- 2 x 2 "gaas.
- 2 "zwart papier bindmiddel klemmen.
- Duct tape / lab tape.
- 1-3/8 "Plated sleuven stalen staaf die zich iets verder dan de volledige lengte van de kooi
- 50cm x 40cm x 20cm kooi (rat kooi).
- Water Bottle met gebogen buis.
- Roestvrij staaldraad, U-vormige om water fles te ondersteunen.
Kooi Setup
- Leg de 1-38 "Plated sleuven stalen balk over de bovenkant van de kooi, en plak hem tijdelijk af met duct tape.
- Schroef een vleugelmoer om de machine te schroeven, plaatst u een wasmachine, en plaats de machine schroef via de sleuf stalen plaat ± 15 cm van de rand van de kooi.
- Voeg nog een ring en vleugelmoer. Draai beide vleugelmoeren, maar niet volledig vast, want het zal nodig zijn om later te doen aanpassingen.
- Steek de machine schroef door het middelste gat van de spoel.
- Om te voorkomen dat de spoel van vallen, schroef de nylon borgmoer aan het einde van de machine schroef. De spoel moet vrij kunnen draaien.
- Plaats de haak van de vissershaven draaien door het onderste deel van de spoel.
- Gebruik een tang om een S-vormige haak vorm van de paperclip. (Cut 2cm van de paperclip aan een haak vorm).
- Steek een uiteinde van de S-vormige haak door de opening van de visserij-zwenk-en knijp deze dicht met de tang.
- Plaats de U-vormige draad, parallel aan de machine schroef, aan de binnenkant van de kooi kant, en terug buig de uiteinden om een volledige fles water te ondersteunen.
- Plaats de fles water in de U-vormige draad, met de spicket naar beneden, maar niet contact met de bodem.
- Buig de twee "bindmiddel klem te openen, zodat ze niet dicht te sluiten. Net genoeg spanning voor 3 tot 4 stukken voedsel houden zonder te vallen. Dit is de kracht van de klem te voorkomen van het neerslaan van de voeding, of klemmen neer op de muis neus.
- Plaats 3 tot 4 objecten van knaagdieren voer in het bindmiddel klem.
Achterbeen Lossen van Muis
- Steek het open uiteinde van de S-vormige haak door de kleinste ring van de staart ring.
- Stel de muis hoogte vast door of het losmaken van de onderste vleugel moer op de machine vast. De onderste extremiteiten mag niet het gewicht dragen. Zodra de optimale hoogte is bereikt draait u de bovenste vleugel moer.
- Verplaats de waterfles, en U-vormige draad, zodat de muis niet kan op de spicket klim met zijn achterpoten. Zet de fles met water Duct tape aan de zijkant van de kooi.
- Plaats het bindmiddel klem met voedsel op de bodem van de kooi, zodat de muis niet kan klimmen op het; plak hem vast met duct tape.
- Herhaal dezelfde procedure als er meer dan een dier is achterbeen gelost aan de andere kant van de kooi. Huis twee dieren per kooi, de ruimte van de dieren, zodat ze kunnen elkaar bijna raken.
- Met de 2 X 2 gaas aan de staart van de muis losjes wrap op de vis swivel. Gebruik een klein stukje tape te wikkelen rond het gaas, het veiligstellen van de gaas aan de staart. Deze stap is belangrijk om de staart te voorkomen dat hangende naar beneden, wat leidt tot bloedophoping in het puntje van de staart en die staart het necrotisch wordt.
- Voeg een kleine hoeveelheid cob beddengoed naar de kooi. Voeg geen te veel strooisel anders wordt de muis van een heuvel van beddengoed en proberen achterpoten belasting van beddengoed.
2. Representatieve resultaten:
Om vast te stellen het succes van de staart-ring HU techniek die we gemeten lichaamsgewicht van de dieren voor de staart ring chirurgie, en voorafgaand aan en na HU en herstel; soleus spiermassa, en bijnier massa in alle groepen.
Lichaamsgewicht van de muizen gedurende het hele experiment zijn weergegeven in figuur 1. Lichaamsgewicht van de muizen voorafgaand aan de staart ring operatie (24,7 ± 3,5 g) waren niet significant verschillend na 5 dagen van herstel van de staart ring operatie (24,3 ± 2.9g) voorafgaand aan de HU. Evenmin heeft het lichaamsgewicht significant onmiddellijk dalen na 14 dagen van de HU (22,7 ± 1.9g), 28 dagen van HU (21,3 + 2,1 g) of na 3 dagen herstel van HU (24,0 ± 1,8 g). Hoewel de HU voor 14 en 28 dagen resulteerde in een kleine (-6,8% en 12%), maar niet-significant verlies in body-mass, de muizen volledig hersteld van hun pre-HU lichaamsgewicht na 3 dagen van herstel. Voedselconsumptie voor ambulante controle muizen en muizen HU is weergegeven in figuur 3. Gemiddelde dagelijkse inname van voedsel was niet anders in HU muizen meer dan 28 dagen in vergelijking met de controlegroep.
We zagen grote soleus spieratrofie volgende HU voor 14 en 28 dagen (-39,1%, en -46,6%), wat wijst op een effectieve HU procedure (figuur 2). Bovendien is deze mate van atrofie is in overeenstemming met de verwachte literatuur waarden voor 2-4 weken van de HU 2, 7, 8. Na drie dagen van herstel van de HU soleus massa sterk toegenomen tot 74% van de controle waarden. Soleus massa in het herstel groep was significant groter dan de beide HU groepen, maar nog steeds aanzienlijk minder dan de ambulante controle dieren.
Bijnier gewichten werden gemeten als een indicator van het dier stress; zowel de linker-en rechter bijnieren werden uitgesneden en gewogen. De gemiddelde gewichten waren vergelijkbaar voor de controle en HU muizen muizen in alle groepen (zie figuur 4).
Eerder bij ratten hebben we laten zien dat het slagingspercentage voor het aantal dieren aan het begin van de HU in vergelijking met het aantal dieren dat HU afgerond zonder coming out van de schorsing apparatuur (als gevolg van dieren kauwen door middel van de staart-tractie tape) was 10 van 12 het gebruik van de Morey-Holton techniek 1. Geen van de muizen (n = 54) in dit onderzoek ooit naar beneden kwam van schorsing voorafgaand aan de voltooiing van de HU periode. We hebben echter wel een muis die met een zwaar ontstoken staart ontwikkeld. Toen ontsteking duidelijk werd, hebben we verwijderd van de staart ring om het ontstoken gebied om te genezen, en vervolgens in een andere tail-ring om de duur van de HU te voltooien.
In het verleden, toen we de Morey-Holton methode van HU wordt gebruikt, hebben we meestal te elimineren 1-2 muizen / groep, omdat ze komen uit de opschorting apparaat. Met de trail-ring methode waren er geen afleveringen van muizen per ongeluk coming out van de HU apparaat tijdens de periode van de HU voor 14 of 28 dagen (n = 54 muizen).
Figuur 1. Veranderingen in het lichaamsgewicht (gemiddelde ± SD). Afkortingen: CON: dragende controle muizen (n = 76), Pre-HU: alle muizen voorafgaand aan de HU (n = 54); HU14: muizen achterbeen gelost voor 14 dagen (n = 34); HU28: muizen achterbeen gelost 28 dagen (n = 20), REC: achterbeen gelost muizen toegestaan om kooi te herstellen voor 3 dagen (n = 22). Er werden geen significante verschillen in lichaamsgewicht werden waargenomen tussen de groepen.
Figuur 2. Soleus spieratrofie (gemiddelde ± SD). Afkortingen: CON: dragende controle muizen (n = 76); HU14: muizen achterbeen gelost voor 14 dagen (n = 34); HU28: muizen achterbeen gelost gedurende 28 dagen (n = 20), en REC: achterbeen toegestaan gelost muizen te kooi te herstellen voor 3 dagen (n = 22). * Significant verschillend (p <0,001) dan dragende control (CON). δSignificantly verschillend (p <0,01) dan de beide HU groepen.
467fig3.jpg "alt =" Figuur 3 "/>
Figuur 3. Voedselconsumptiepeiling (gemiddelde ± SD). Gemiddelde dagelijkse inname van voedsel (g / dag) tijdens dragende achterbeen en lossen. Afkortingen: dragende controle muizen (n = 76), HU: muizen achterbeen unloaded14 - 28 dagen. Er werden geen significante verschillen tussen de CON en HU groepen waargenomen.
Figuur 4. Bijnier Massa (gemiddelde ± SD). Afkortingen: CON: dragende controle muizen (n = 76); HU14: muizen achterbeen gelost voor 14 dagen (n = 34); HU28: muizen achterbeen gelost gedurende 28 dagen (n = 20), en REC: achterbeen toegestaan gelost muizen te kooi te herstellen voor 3 dagen (n = 22). Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de groepen.
Discussion
Evalueerden we een alternatieve methode voor het achterbeen lossen muizen, die we vastbesloten om zijn zeer succesvol. De staart-ring methode zoals hier beschreven werd gebruikt voor de lange termijn achterbeen vering, en herstel na HU studeren. Onder elk van deze voorwaarden, er was geen bewijs van het niet aan te passen, zoals blijkt uit een stabiele voedselinname, lichaamsgewicht, en de bijnieren gewichten van de muizen. Deze staart-ring HU techniek is eenvoudig uit te voeren en kan gemakkelijk worden opgenomen met zeer weinig chirurgische praktijk.
Er zijn verschillende voordelen van de staart-ring methode in vergelijking met de traditionele Morey-Holton 5, 6 methode. Ten eerste, de huid en de ring implantatie op die staart altijd zichtbaar zijn, dus als er problemen ontstaan is het meteen duidelijk, niet alleen op het einde van de periode van opschorting. Ten tweede, dieren zijn niet in staat om eruit te komen van de suspensie apparaat op elk moment tijdens HU, het wegnemen van de noodzaak om te bepalen of een muis dan niet in de dataset te houden te maken. Bovendien hebben de muizen geen moeite de ring apparatuur en zodra ze zijn vrijgegeven van de HU voor herstel, dat doen ze niet knoeien met hun staart, waardoor een naadloze fase van herstel na HU. Tot slot, achterbeen gelost muizen met de staart-ring methode behouden van hun lichaamsgewicht beter dan muizen achterbeen gelost door de Morey-Holton tail-tractie techniek. In onze handen na 14 dagen van de HU zagen we een kleine (-6,8%), maar niet-significant verlies in body-mass. Overwegende dat de Ingalls et al.. Waargenomen een significante daling van -12% in lichaamsgewicht in muizen na 14 dagen van HU door de Morey-Holton methode 3. Hoewel Ingalls geen rapport bijnier gewichten, lijkt het erop dat onze staart-ring methode minder stress geeft de muis (bijnieren gewichten in onze HU muizen zijn niet anders dan controles) en beter onderhoud van het lichaamsgewicht de hele achterbeen lossen periode.
In het kort, was een staart ring methode achterbeen lossen ontwikkeld en getest op muizen HU voor 14 en 28 dagen, en op muizen terug naar kooi herstel voor 3 dagen na de HU. Op basis van de bijnier gewicht, body mass en voedselinname, muizen lijken te goed hebben aangepast aan de staart-ring apparaat. De staart-ring achterbeen lossen methode is een handig, eenvoudig alternatief voor de traditionele Morey-Holton achterbeen lossen techniek.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Andrew J Dunn, een uitstekende undergraduate research student in ons laboratorium, bedanken voor zijn technische bijstand en verzorging van de dieren. Het Nationaal Instituut voor Gezondheid verlenen HD058834 en de Universiteit van Missouri Life Sciences Fellowship gefinancierd dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wire cutters/pliers | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Heating pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Silver nitrate applicators | ARZOL | 0001-2 | |
| Isoflurane,USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Chlorhexidine Gluconate 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterile 2-0 surgical steel suture | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| 25 X 5/8 A gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/ needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Size 10-24 X 4 machine screws | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylon lock nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Wing nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Fender Washer size ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metal sewing machine bobbin. | Singer Instruments | 45785 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| 2” black paper binder clamps. | Office Depot | 308957 | |
| Scotch Multi-Use Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| 1-3/8” Plated slotted steel bar | Home Depot | 548932 | Extends slightly beyond the full length of the cage |
| 50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Water Bottle | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Stainless Steel wire | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | U-shaped wire to support water bottle |
References
- Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
- Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization. J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).
- Morey, E. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness. BioScience. 29, 168-172 (1979).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone. 22, 83-88 (1998).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).
- Thomason, D. B., Booth, F. W. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).
- Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery. J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).
