Summary
우리는 생쥐에서 모델을 하역 alternant hindlimb을 개발했습니다. 종래의 모리 - 홀턴 꼬리 - 견인 기술을 통해 우리 hindlimb 하역 테일 링 방식의 주요 장점은 동물에 스트레스를 최소화하는 간단한 간단한 절차입니다.
Abstract
모리 - 홀턴 hindlimb 하역 (HU) 메소드는 널리 인정 국립 항공 우주국 (NASA) 설치류 4-6으로 쓰지 않음 - 위축을 공부를위한 지상 기반의 모델입니다. 우리의 연구는 생쥐의 황금 표준 모리 - 홀턴 HU 꼬리 - 견인 기술로 alternant 방법을 평가했다. 피프티 개 여성 생쥐 (4-8 모.) 14 일 동안 HU (n은 = 34) 또는 28일 (n은 = 20)했다. HU에서 복구 HU (n은 = 22) 다음과 같은 일반적인 케이지 ambulation 3 일 후에 평가되었다. 세 일치하는 생쥐 (N = 76) 무게 - 베어링 컨트롤을 역임했습니다.
이전 HU에 꼬리 반지는 5 일, 6 일 또는 7 일 간 척추 디스크 공간 통과하고 생쥐가 일시 중지되었습니다하는 고리 모양으로되었다 2-0 살균 수술 강철 와이어로 형성되었다. 꼬리 링을위한 척추 위치를 적절하게 깨끗하게 함 방해하지 않고 동물의 체중의 균형을 위해 선택되었다.
우리는 HU, soleus 위축의 정도, 그리고 부신 대량 다음 HU 전후의 체중을 평가하여이 소설 HU 기술의 성공을 결정. 이전 HU (24.3 ± 2.9g)에 쥐의 체중은 크게 (24.0 ± 1.8g) HU의 14d (22.7 ± 1.9g), HU의 28d (21.3 + 2.1g) 후 3 일 복구 직후 감소하지 않았 . Soleus 근육 질량은 크게 각각 십사일 28 일 동안 HU (P는 <0.001) 다음 (-39.1 %, -46.6 및 %) 감소했다. 복구 soleus의 질량에 따라 3 일 크게 제어 값의 74 %로 증가했다. HU 마우스의 부신 체중 조절 마우스에 비해 다양한되지 않았습니다.
우리 소설 HU 방법의 성공은 기대 문학 값에 해당 HU, 2, 7, 8 다음 동물 체중, 비교 부신의 무게와 soleus 위축의 유지 보수에 의해 입증됩니다. 이 HU 방법의 주요 장점은 다음과 같습니다 서스펜션 동안 꼬리 시험 1) 용이성, 2) 자주 꼬리 - 찍어 HU와 관찰 청색증, 염증, 및 / 또는 괴사성 꼬리의 가능성을 감소, 3) 마우스의 가능성은 견인을 씹는 없습니다 테이프 및 정지 장치 나오는, 바로 HU 후 4) 신속한 복구 및 정상 케이지 활동.
Protocol
사전 외과 악기 / 재료
- 와이어 커터 / 플라이어
- 거즈 2 X 2 "패드에게
- 손난로
- 실버 질산 스틱
- 무균 수술 장갑
- Isoflurane 흡입 마취
- Chlorhexidine 글루 콘 산 4퍼센트 (살균 외과 스크럽)
- 무균 2-0 외과 강철 봉합
- 25 X 8분의 5 게이지 바늘 (Autoclaved)
- Hemostat (Autoclaved)
- 서지컬 스틸 봉합
수술 절차
- 멸균 필드를 만듭니다. 멸균 절차를 따르십시오.
- 2 마우스를 마취 - 3퍼센트 isoflurane.
- 가열 패드에서 마우스를 놓으십시오.
- Chlorhexidine 솔루션 꼬리 스크럽.
- 찾아 5, 6, 또는 7 일 척추 공간 (꼬리 두 뼈가 충돌 사이에, 꼬리의 기지에서 체모의 끝에서부터 시작).
- 척추 공간으로, Hemostat 두 번 척추 사이의 파일럿 구멍을 만들기 위해 25G 바늘을 사용합니다.
- 10cm 길이 철강 봉합사를 잘라 절단기를 사용하십시오.
- 바늘을 제거하고 꼬리 중 하나를 끝에 구멍, 봉합의 5cm를 통해 철강 치료를 삽입합니다.
- 꼬리의 각 측면 봉합의 + 5cm 있어야합니다.
- 꼬리에 플레이스 엄지 팁.
- 무료 손을 사용하여 철강 봉합을 바람이 네 손가락의 끝에와 큰 루프를 형성하기 위해 끝을 비틀어. 상처 또는 원형 부분은 길이 + 3mm해야합니다.
- 엄지를 제거합니다.
- hemostat과 봉합 한 가닥을 고정하고 작은 루프, 원래 큰 루프의 꼬임에 최대한 부착되는의 끝 부분에 반지를 다스릴.
- 초과 와이어 잘라, 그리고 트위스트 전선을 뒤로 구부 러.
- 초과 출혈이있다면, 당신은 은색 질산염 스틱으로 중지할 수 있습니다.
- 이전 hindlimb 하역하는 5~7일에 대한 복구 단일 집 케이지에서 isoflurane과 장소 마우스를 끕니다. 하나 이상의 마우스가 함께 보관되어있다면 꼬리 고리가 뒤엉키다.
1. Hindlimb 하역 절차
자료
- 사이즈 10-24은 X 4 기계 나사, 동물 하나씩.
- 나일론 잠금 너트 사이즈 10-24, 동물 하나씩.
- 윙 너트 사이즈 10 X 24, 동물마다 둘.
- 와셔의 크기 ¼ X 1, 동물마다 둘.
- 스냅 후크 크기 # 6, 1-11/16 "하나마다 동물과 함께 낚시 스위블.
- 보빈 금속 재봉틀. 하나마다 동물.
- S - 모양의 후크에 대한 작은 종이 클립, 동물 당 한
- 펜치.
- 2 X 2 "거즈.
- 2 "검은 종이 바인더 클램프.
- 덕트 테이프 / 실험실 테이프.
- 약간은 새장의 전체 길이 초과 1-3/8 "도금 홈 붙이 스틸 바
- 50cm X 40cm X 20cm 케이지 (쥐 케이지).
- bended 튜브와 물통.
- 스테인레스 스틸 와이어, 물통을 지원하는 U - 모양.
케이지 설치
- 덕트 테이프와 temporally 다운 1-38 "도금 홈 붙이 강철 새장의 맨 위에 바, 테이프를 놓는다.
- 기계 나사 1 꼴통을 나사, 와셔를 삽입하고, 기계 나사 트러프에게 홈 붙이 강판 ± 케이지의 가장자리에서 15cm를 삽입합니다.
- 다른 세탁기와 꼴통을 추가합니다. 날개 너트를 모두 조여지만, 나중에 조정을 할 필요하므로 완전히 조여하지 않습니다.
- 보빈의 중앙 구멍을 통해 기계의 나사를 삽입합니다.
- 떨어지에서 보빈을 방지하기 위해, 기계 나사의 끝 부분에 나일론 잠금 너트를 나사. 보빈 자유롭게 회전해야합니다.
- 보빈의 하단 부분을 통해 어업 회전에서 스냅 후크를 삽입합니다.
- 클립에서 S - 모양의 후크를 형성 펜치를 사용합니다. (후크를 형성하기 위해 종이 클립에서 2cm 잘라).
- 낚시 회전의 구멍을 통해 S - 모양의 후크의 한쪽 끝을 삽입하고 펜치로 종료 핀치.
- 케이지 측면의 내부에있는 기계 나사에 병렬 U - 모양의 와이어를, 장소, 전체 물통을 지원하기 위해 다시 끝을 구부.
- 스피켓가 다운 마주하지만 바닥을 건드리지 마와 U - 모양의 와이어에 물통을 넣습니다.
- 이것은 음식을 분쇄에서 클램프의 힘을 방지, 또는 아래로 클램핑되도록 그들이 가까이 차단할 수가 없어. 그 밖에 떨어지지 않고 거기에 음식을 3-4 조각을 보유하는 정도죠 긴장., 2 "바인더 클램프 오픈 벤드 마우스 코.
- 바인더 클램프에 설치류 차우의 4 조각 장소 3.
마우스 Hindlimb 내리기
- 꼬리 반지의 작은 링을 통해 S - 모양의 후크의 열린 끝을 넣습니다.
- 기계 나사의 낮은 날개 너트를 강화하거나 느슨해진하여 마우스의 높이를 조정합니다. 하반신은 체중 베어링해서는 안됩니다. 일단 최적의 높이는 상부 날개 너트를 조여 이루어진다.
- 마우스는 hindlimbs와 스피켓에 올라갈 수 있도록 물통 및 U - 모양의 와이어를 재지정. 덕트 테이프와 함께 새장 측면에 물통을 고정합니다.
- 마우스가에 올라갈 수 있도록 새장 바닥에 음식과 함께 바인더 클램프 위치를, 테이프로 테이프를 내려.
- 하나 이상의 동물이 hindlimb 새장 반대편에 언로 드하는 경우 동일한 절차를 반복합니다. 하우스 케이지마다 짐승 같은 두, 공간이 동물들은 거의 서로를 만질 수 있도록.
- 느슨하게 물고기 회전에 마우스의 꼬리를 정리하고 2 X 2 거즈를 사용합니다. 꼬리에 거즈를 확보, 거즈 주위에 포장 테이프의 작은 조각을 사용합니다. 이 단계는 꼬리의 끝부분과 괴사되고 그 꼬리에 풀링 혈액에 이르는, 아래 쳐지고에서 꼬리를 방지하는 것이 중요합니다.
- 케이지에 코브 침구의 작은 금액을 추가합니다. 마우스 침구와 침구에 hindlimbs를로드 시도의 마운드에서합니다 그렇지 않으면 너무 많은 침구를 추가하지 마십시오.
2. 대표 결과 :
꼬리 링 HU 기술의 성공을 구축하기 위해 우리는 꼬리 링 수술 전에 사전과 HU 및 복구 다음과 같은 동물의 체중을 측정, 모든 그룹과 부신 대량, soleus 근육 질량.
실험을 통해 생쥐의 바디 무게는 그림 1에 표시됩니다. 전에 꼬리 링 수술 (24.7 ± 3.5g)에 마우스 바디 가중치가 꼬리 링 수술 (24.3 ± 2.9g) HU하기 전에 회복 5 일 후에 크게 다르지 않아. 또한 체중이 크게 HU 28 일 (21.3 + 2.1g)는 (22.7 ± 1.9g) HU 14 일 후에 즉시 감소 않았거나 HU (24.0 ± 1.8g)부터 3 일 복구 후. 14 28 일 동안 HU 시체 - 대량의 작은 (-6.8 %와 12 %)하지만, 이외의 상당한 손실이 발생하지만, 생쥐가 완전히 복구 3 일 후에 그들의 사전 HU 바디 무게로 회복. 외래 제어 마우스 및 HU 마우스에 대한 식품 소비는 그림 3에 표시됩니다. 평균 일일 식품 섭취량 컨트롤에 비해 28일 이상 HU 마우스에서 다른되지 않았습니다.
우리는 효과적인 HU 절차 (그림 2)을 나타내는 14과 28 일 (-39.1 %, -46.6 %와)에 대한 다음과 같은 중요한 HU soleus 근육 위축을 관찰했다. 또한 위축이 정도 HU 2, 7, 8 2~4주에 대한 예상 문헌 값과 일치합니다. HU soleus 대량의 회복에 따라 3 일 크게 제어 값의 74 %로 증가했다. 복구 그룹에 Soleus 질량은 HU 그룹 모두보다 훨씬 큰했지만, 외래 제어 동물보다 여전히 훨씬 적은.
부신 중량은 동물의 스트레스의 지표로 측정되었다, 왼쪽과 오른쪽 부신 선들은 excised와 무게했다 둘 다. 평균 무게는 제어 및 모든 그룹에서 HU 마우스 마우스 (그림 4)에 대한 비교했다.
이전 쥐에서 우리가 HU의 시작 부분에 동물의 숫자에 대한 성공률은 서스펜션 장치에서 나오는없이 HU를 완료한 동물의 번호 (꼬리 - 견인 테이프를 통해 씹는 동물에 의한)에 비해 것으로 나타났습니다 것만 10 살 12 모리 - 홀턴 기술 1을 사용합니다. 이 연구에서 생쥐들의 없음 (N = 54)도 전에 HU 기간의 완료로 정지에서 내려 온 없습니다. 우리는 그러나 심한 염증이 꼬리를 개발한 쥐 한마리가 있었나요. 염증이 명백한되었을 때, 우리는 염증 지역 치유 수 있도록 꼬리 링을 제거하고, 이후 HU 기간을 완료하는 또 다른 꼬리 - 링을 배치.
그들이 정지 장치 나올 때문에 과거에는 우리가 HU의 모리 - 홀턴 방법을 사용하는 경우, 우리는 일반적으로 1-2 쥐를 / 그룹을 제거합니다. 트레일 - 링 방법을 부주의하게 14 28일 (n은 = 54 생쥐)에 대한 HU의 기간 동안 HU 장치 나오는 생쥐에 대한 에피소드가 없었다.
그림 1. 체중 변경 (± SD 평균). 약어 : CON : 체중 베어링 제어 마우스 (n은 = 76); 사전 HU : 이전 HU (n은 = 54)에 대한 모든 마우스, HU14 : 쥐 hindlimb 14 일 (n은 = 34)에 대한 하역, HU28 : 쥐 hindlimb가 언로 드 28일 (n은 = 20); REC : 케이지 수 hindlimb 하역 마우스는 3 일 (n은 = 22)에 대한 복구합니다. 체중에 큰 차이는 집단 간의 관찰되지 않았습니다.
그림 2. Soleus 근육의 위축 (± SD 평균). 약어 : CON : 체중 베어링 제어 마우스 (n은 = 76); HU14 : 쥐 hindlimb 14 일 (n은 = 34)에 대한 하역, HU28 : 쥐 hindlimb 28 일 (n은 = 20)의 하역 및 REC : 허용 hindlimb 언로 드 쥐 에 케이지 3 일 (n은 = 22)에 대한 복구합니다. * 무게 - 베어링 제어 (CON)보다 (P <0.001) 훨씬 다릅니다. HU 그룹 모두보다 (P <0.01) δSignificantly 달라.
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그림 3. 식품 소비 (± SD 평균). 무게 - 베어링 및 hindlimb 하역 동안 일일 평균 식품 섭취량 (g / 일). 약어 : 체중 베어링 제어 마우스 (N = 76); HU : 마우스 hindlimb unloaded14 - 28 일. CON 및 HU 그룹 사이에는 큰 차이가 관찰되지 않았다.
그림 4. 부신 질량 (± SD 평균). 약어 : CON : 체중 베어링 제어 마우스 (n은 = 76); HU14 : 쥐 hindlimb 14 일 (n은 = 34)에 대한 하역, HU28 : 쥐 hindlimb 28 일 (n은 = 20)의 하역 및 REC : 허용 hindlimb 언로 드 쥐 에 케이지 3 일 (n은 = 22)에 대한 복구합니다. 더 큰 차이는 집단 간의 관찰되지 않았습니다.
Discussion
우리는 매우 성공적인 것으로 판단 hindlimb 하역 생쥐의 대체 방법을 평가했다. 여기에 설명된 꼬리 링 방법은 장기 hindlimb 서스펜션에 사용되었고, 복구 다음 HU를 연구하기 위해 서요. 이러한 조건의 각에서 안정적인 음식 섭취, 신체 중량과 생쥐의 부신 무게에 의해 입증으로 적응 실패의 증거가 없었다. 이 꼬리 링 HU 기술은 수행하는 간단하고 쉽게 아주 작은 수술 연습 포함될 수 있습니다.
전통 모리 - 홀턴 5, 6 방법에 비해 꼬리 링 방식의 몇 가지 장점이 있습니다. 문제는 그것이 정학 기간의 끝에, 그냥 바로 분명하지 발생한다면 첫째, 그 꼬리에있는 피부와 고리 주입 사이트는 항상 볼 수 있습니다. 둘째, 동물은 데이터 집합에서 마우스 또는하지를 유지할지 여부를 결정하기 위해 필요 obviating, HU 동안 언제든지 정지 장치 나갈 수 없습니다. 또한, 마우스는 반지 장치 방해하지 않고 그들이 복구를 위해 HU에서 출시 때, 그들은 HU에 따라 완벽한 복구 단계에 대한 수 있도록, 그들의 꼬리로 조작하지 않습니다. 마지막으로, 꼬리 링 방식 hindlimb 하역 생쥐는 모리 - 홀턴 꼬리 - 견인 기술에 의해 언로 드 쥐 hindlimb보다 자신의 체중을 유지합니다. 우리 손에 HU 14 일 이후 우리는 신체 - 질량에있는 작은 (-6.8 %)하지만, 이외의 상당한 손실을 관찰했다. 잉갈스 외가. 모리 - 홀턴 방법 3 HU 날로부터 14 일 후 마우스의 체중에서 상당한 -12 %의 감소를 관찰 반면. 잉갈스은 부신 무게를 신고하지 못했지만, 우리의 꼬리 링 방법은 마우스 (우리 HU 마우스의 부신 무게가 컨트롤 다를되지 않습니다)과 hindlimb 내리기 기간 동안 체중보다 관리에 덜 스트레스를 수여가 나타납니다.
요약, hindlimb 하역의 꼬리 링 방법 개발, 14 및 28 일 동안 생쥐 HU에서 테스트하고, 생쥐에 대한 HU 후 3 일 동안 케이지 회복으로 반환되었습니다. 부신 무게, 신체 질량 및 식품 섭취량을 바탕으로, 생쥐는 꼬리 링 장치에 잘 적응하도록 나타납니다. 방법을 하역 꼬리 링 hindlimb은 전통 모리 - 홀턴 hindlimb 하역 기술에 대한 유용하고 간단한 대안입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 자신의 기술 지원과 동물을 돌보는 위해 앤드류 J 던, 우리 연구실에 탁월한 연구 학부 학생을 감사드립니다. 건강 부여 HD058834와 미주리 생명 과학 원정대의 대학의 국립 연구소는이 작품을 후원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wire cutters/pliers | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Heating pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Silver nitrate applicators | ARZOL | 0001-2 | |
| Isoflurane,USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Chlorhexidine Gluconate 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterile 2-0 surgical steel suture | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| 25 X 5/8 A gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/ needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Size 10-24 X 4 machine screws | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylon lock nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Wing nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Fender Washer size ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metal sewing machine bobbin. | Singer Instruments | 45785 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| 2” black paper binder clamps. | Office Depot | 308957 | |
| Scotch Multi-Use Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| 1-3/8” Plated slotted steel bar | Home Depot | 548932 | Extends slightly beyond the full length of the cage |
| 50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Water Bottle | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Stainless Steel wire | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | U-shaped wire to support water bottle |
References
- Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
- Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization. J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).
- Morey, E. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness. BioScience. 29, 168-172 (1979).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone. 22, 83-88 (1998).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).
- Thomason, D. B., Booth, F. W. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).
- Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery. J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).
