Summary
संरक्षित इंसुलिन संकेतन फल मक्खी में पाया रास्ते
Abstract
संरक्षित पोषक तत्व संवेदन तंत्र स्तनपायी और फल मक्खी जहां पेप्टाइड्स स्तनधारी इंसुलिन और ग्लूकागन, क्रमशः समारोह के लिए विकास लार्वा चरणों 1,2 के दौरान ग्लूकोज homeostasis को बनाए रखने जैसी के बीच मौजूद हैं. बड़े पैमाने पर बाद mitotic वयस्क मक्खियों पर अध्ययन इंसुलिन की तरह (आईएलपी) पेप्टाइड कोशिकाओं (IPCs) 3 उत्पादन के आनुवंशिक पृथक के परिणाम के रूप में ग्लूकोज homeostasis के गड़बड़ी का पता चला है . इस प्रकार, वयस्क फल मक्खियों के प्रकार द्वितीय मधुमेह सहित चयापचय विकारों के लिए एक उपयुक्त आनुवंशिक मॉडल प्रणाली के रूप में महान वादा पकड़. आगे फल मक्खी प्रणाली विकसित करने के लिए, तुलनीय शारीरिक ग्लूकोज और स्तनधारियों में इंसुलिन संवेदनशीलता सहिष्णुता को मापने के लिए इस्तेमाल किया assays स्थापित किया जाना चाहिए. यह अंत करने के लिए, हम हाल ही में वयस्क मक्खी में मौखिक शर्करा सहिष्णुता प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक उपन्यास प्रक्रिया में वर्णित और ग्लूकोज homeostasis 4,5 को बनाए रखने में वयस्क IPCs के महत्व का प्रदर्शन किया. यहाँ, हम के लिए इंसुलिन इंजेक्शन 6 पहले से वर्णित प्रक्रिया को संशोधित किया है और यह एक उपन्यास hemolymph निष्कर्षण विधि वयस्क मक्खी में परिधीय इंसुलिन संवेदनशीलता को मापने के साथ संयुक्त . विशिष्ट, हमारे प्रोटोकॉल वयस्क मक्खी के लिए इंसुलिन इंजेक्शन, है कि बनाता है यह संभव करने के लिए इंसुलिन संकेत म्यूटेंट और संभावित हस्तक्षेप वयस्क मक्खी में ग्लूकोज और इंसुलिन संवेदनशीलता सहिष्णुता को प्रभावित विशेषताएँ एक पद्धति पर एक परिधीय ग्लूकोज लोड के निपटान की क्षमता का प्रत्यक्ष शारीरिक माप की अनुमति देता है.
Protocol
1. इंसुलिन समाधान तैयार
- पीबीएस में इंसुलिन भंग 0.01 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता को प्राप्त करने के द्वारा ताजा गोजातीय इंसुलिन समाधान तैयार करें. दोनों इंसुलिन / PBS और नियंत्रण पीबीएस समाधान इंजेक्शन प्रक्रिया भर में बर्फ पर रखा जाना चाहिए. ये समाधान 0.5% (v / v) एफडी और सी ब्लू नहीं के साथ तैयार रहना चाहिए. 1 रंग भोजन.
2. सुई तैयार करना और सेट - अप इंजेक्शन
- तैयार केशिका गिलास सुई का उपयोग कर एक micropipette निम्नलिखित खींचने सेटिंग्स इंजेक्शन के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की सुइयों का उत्पादन puller.The: गर्मी, 345, खींचो, 210, वेग, 100, समय, 200 (100ms). हौसले से खींच सुइयों Kimwipe ऊतकों के माध्यम से टिप दबाकर पा होना चाहिए. इस blunting प्रक्रिया लम्बी उच्च प्रतिरोध टिप निकालता है और एक बड़ा ताकना व्यास के साथ एक stouter टिप पैदा करता है.
- एक microcentrifuge इंसुलिन / पीबीएस समाधान या पीबीएस अकेले युक्त ट्यूब में टिप पा सुई रखें. प्रत्येक सुई के वापस-भरने में कार्रवाई के परिणाम केशिका. निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई भी मलबे या हवाई बुलबुले नोक पर दिखाई देते हैं stereomicroscope के तहत सुई की नोक. किसी भी सुइयों कि सफाई भर नहीं है त्यागें.
- पुस्तिका microinjector सुई धारक और स्थिति सुई धारक में भरा सुइयों micromanipulator के साथ इतना है कि सुई टिप एक stereomicroscope के माध्यम से दिखाई देता है सम्मिलित करें. मैनुअल microinjector सुक्ष्ममापी microinjector सिरिंज पर सवार करने के लिए संलग्न घुंडी बदल कर सुई में तरल पदार्थ स्तंभ पर सकारात्मक दबाव लागू करें.
- सत्यापित करें कि तरल पदार्थ विस्थापन के लिए पर्याप्त दबाव सुई की नोक के लिए एक Kimwipe छू और द्रव का प्रवाह की पुष्टि द्वारा लागू किया गया है.
- एक बार सुई इंजेक्शन के लिए तैयार किया गया है, प्रत्यय एक अंशांकन चार्ट स्पष्ट टेप के साथ सुई शाफ्ट, और 20X आवर्धन के तहत सुई टिप ध्यान में stereomicroscope के माध्यम से लाने के.
3. तैयार उड़ना
- दस दिन पुराने महिला मक्खियों इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है. Eclosion के 24 घंटे के भीतर मक्खियों ले लीजिए. एक गैस पैड पर humidified सीओ 2, सॉर्ट के साथ मानक उपचार या आहार युक्त शीशियों में पुरुषों और जगह महिला मक्खियों से बाहर मक्खियों anesthetize . 10 दिनों के लिए प्रयोगात्मक आहार पर महिला मक्खियों रखें.
- Eclosion और प्रयोगात्मक आहार पर जुदाई के बाद दसवें दिन, स्थानांतरण उनके भोजन युक्त शीशियों से 2% अगर एक 5 मिलीलीटर प्लग युक्त शीशियों के लिए मक्खियों और उन्हें 12-16 एच. के लिए भूखा
- 10% 1 इंसुलिन इंजेक्शन के लिए पहले घंटे के लिए ग्लूकोज लथपथ फिल्टर युक्त शीशियों भूखे मक्खियों स्थानांतरण.
- संक्षेप में ग्लूकोज खिलाने के बाद humidified सीओ 2 के साथ मक्खियों anesthetize और फिर ठंडे उन्हें बर्फ पर स्थिर है.
4. इंजेक्शन प्रक्रिया
- धीरे ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ एक ठंड immobilized मक्खी समझ और पकड़ यह सुई टिप को बंद इतना है कि टिप मक्खी छाती के बाईं ओर के पूर्वकाल क्षेत्र के निकट है. ध्यान में stereomicroscope के तहत दोनों सुई टिप और मक्खी छाती लाओ.
- धीरे सुई टिप की ओर उड़ चाल इतनी है कि सुई टिप छू मक्खी की छाती (1 छवि) के बाईं prescutum क्षेत्र के उभार के केंद्र. एक बार मक्खी ठीक से उन्मुख है और सुई टिप के साथ गठबंधन, सुई पर मक्खी ताकि सुई prescutum के केंद्र impales अग्रिम जारी है.
- सकारात्मक दबाव के रूप में microinjector micromanipulator घुंडी साथ सिरिंज सवार को आगे बढ़ाने के द्वारा की जरूरत है जब तक तरल पदार्थ की 0.1 μl मक्खी में अंतःक्षिप्त किया गया है लागू करें. मक्खी hemocoel में द्रव का प्रवाह पूर्वकाल छाती के बाईं ओर एक नीले रंग प्रदान करेगा. कभी कभी एक वापस लेना और किसी भी सुई टिप रुकावट बेदखल और द्रव का प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए कई बार अग्रिम चाहिए.
- इंजेक्शन मक्खियों के रूप में 2% की अगर शीशियों में नामित hemolymph निकासी समय से पहले अंक के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें.
5. Hemolymph संग्रह
- संक्षेप humidified सीओ 2 के साथ वांछित बाद इंजेक्शन समय अंक और स्थिति पर मक्खियों anesthetize डबल पक्षीय टेप सीओ 2 पैड की सतह पर चिपका पर पृष्ठीय पक्ष नीचे प्रत्येक मक्खी . सिर गठबंधन कैप्सूल के साथ भी पंक्तियों में मक्खियों व्यवस्थित. एक छंटनी लकड़ी applicator छड़ी का उपयोग करने के लिए टेप चिपकने वाला में अपने पंख प्रेस और स्थिरीकरण सुनिश्चित कर सकते हैं.
- एक बार मक्खियों टेप करने के लिए तय कर रहे हैं, ठीक संदंश के साथ एक मक्खी सूंड समझ और धीरे यह मक्खी के उदर और फिर पीछे क्षेत्र की ओर खींच इतना है कि सिर कैप्सूल के सामने स्टीरियो माइक्रोस्कोप के माध्यम से दिखाई देता है.
- अपने दूसरे हाथ के साथ और जबकि स्थिति में पकड़े सूंड, पंचर ptilinal सीवन बस के ऊपर सिर कैप्सूल के बीच एक तेज टंगस्टन सुई (छवि 2) का उपयोग कर. एक सावधान रहना नहीं सुई बहुत दूर सम्मिलित के रूप में यह आसान है सिर कैप्सूल के दूसरे पक्ष के माध्यम से सुई की नोक पर पंच और बाद में खो गhemolymph प्रवाह की ontrol. पंचर सब hemolymph एकत्रित से पहले एक इंजेक्शन समूह में मक्खियों.
- एक बार सिर कैप्सूल में छेद किया गया है, छंटनी लकड़ी applicator छड़ी का उपयोग धीरे मक्खी पेट के लिए दबाव लागू. मक्खी के लिए इतना अधिक है कि यह अपने उदर पक्ष पर टिकी हुई है के रूप में आप दबाव लागू रोल यह मददगार हो सकता है. यह प्रक्रिया सिर कैप्सूल पंचर साइट से hemolymph की एक छोटी बूंद का उत्पादन होगा.
- 1μl hemolymph सिर कैप्सूल पंचर साइट से उभरते छोटी बूंद के लिए microcapillary ट्यूब के एक सिरे पर टच करें. hemolymph केशिका क्रिया के माध्यम से ट्यूब में प्रवेश करेंगे. Hemolymph microcapillary ट्यूब के भीतर एक स्नातक की उपाधि प्राप्त की मात्रा चार्ट के खिलाफ द्रव कॉलम की जाँच के द्वारा एकत्र की राशि का निर्धारण करें और रिकॉर्ड.
6. Hemolymph ग्लूकोज निर्धारण
- Microplate इन्फिनिटी ग्लुकोज अभिकर्मक के 100 μl युक्त कुओं में hemolymph नमूने बाहरकरें. बर्फ पर थाली रखो जबकि hemolymph नमूने लोड हो रहा है है.
- अलग 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM और 3.125mM 1 μl ग्लूकोज स्टॉक समाधान के प्रत्येक लोड हो रहा है के द्वारा एक मानक वक्र स्थापित करना.
- 37 नमूनों में सेते ° C 10 मिनट के लिए.
- 340 एनएम absorbance पता लगाएँ.
- खाता hemolymph मात्रा के लिए एकत्र और नमूना ग्लूकोज ज्ञात ग्लूकोज सांद्रता के साथ मानक वक्र के आधार पर एकाग्रता का निर्धारण.
7. प्रतिनिधि परिणाम
एक ठेठ इंसुलिन सहिष्णुता प्रतिक्रिया में इंसुलिन इंजेक्शन मक्खियों जहां ग्लूकोज का स्तर परिसंचारी में एक बूंद में 15 मिनट के बाद इंजेक्शन का पता चला है पता चला है. इसके विपरीत, ऐसी प्रतिक्रिया पीबीएस इंजेक्शन मक्खियों (3 छवि) में नहीं देखा है. परिधीय ग्लूकोज निपटान में यह प्रतिक्रिया इंसुलिन इंजेक्शन में जारी 30 मिनट के बाद इंजेक्शन के लिए मक्खियों. हम नियमित रूप से 4-5 मक्खियों प्रति प्रत्येक इंजेक्शन समूह में hemolymph के 0.2-0.5 μl निकाल सकते हैं. तीन इंजेक्शन समूहों में प्रत्येक प्रयोग में शामिल हैं.
चित्रा 1 ड्रोसोफिला सुई प्रविष्टि साइट (Demerec, 1950 से संशोधित) 7 दिखा छाती के बाएं ओर. पूर्वकाल छाती के बाईं ओर के पृष्ठीय क्षेत्र पर prescutum के केंद्र के माध्यम से सुई डालें.
चित्रा 2 ड्रोसोफिला के लिए hemolymph निष्कर्षण (Demerec, 1950 से संशोधित) 7 पंचर स्थान दिखा सिर के ललाट दृश्य . पंचर एक पतले तेज ptilinal सीवन बस के ऊपर सिर कैप्सूल के केंद्र में टंगस्टन जांच के साथ सिर कैप्सूल.
चित्रा 3. एक ठेठ इंसुलिन सहिष्णुता नियंत्रण वयस्क में पता चला प्रतिक्रिया मक्खियों. नियंत्रण w 1118 मक्खियों गोजातीय (पीबीएस में 1 एनजी) इंसुलिन या पीबीएस केवल के साथ अंतःक्षिप्त थे . को दोहराने के समूहों में मक्खियों तो 0, 15 या 30 मिनट और ग्लूकोज का स्तर परिसंचारी के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी गई मापा गया.
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Discussion
इस रिपोर्ट में वर्णित तकनीक संभावित किसी भी अध्ययन है कि ड्रोसोफिला hemolymph संरचना में detectable परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप शारीरिक प्रक्रियाओं की जांच में उपयोगी है . इस तरह से इंजेक्शन और hemolymph संग्रह के संयोजन से, यह संभव है एक विशेष प्रयोगात्मक उपचार या हेरफेर के तत्काल physiologically प्रासंगिक प्रभाव का पता लगाने. पिछले दो कत्ल शामिल तकनीकों से अधिक hemolymph संग्रह में इस 'रक्तपात "तकनीक का प्राथमिक लाभ यह है कि इस तकनीक hemolymph नमूने के संदूषण कम से कम के साथ पेट contents.If देखभाल करने के लिए किसी भी pericerebral वसा शरीर के ऊतकों, जो कभी कभी में प्रकट हो सकता है एकत्रित नहीं लिया जाता है hemolymph छोटी बूंद exuded, तो नमूने सही vivo में संचार तरल पदार्थ में राज्य को प्रतिबिंबित करना चाहिए.
इंजेक्शन के बाद कुल संचार तरल पदार्थ की एक संभावित confounding किसी भी इंजेक्शन प्रयोग पैमाने पर इस प्रदर्शन में निहित कारक प्रारंभिक मन्दन है. के लिए यह आसानी से नियंत्रित किया जा सकता हो, लेकिन उम्र से मिलान नियंत्रण में प्रयोगात्मक मक्खियों या इंसुलिन में पीबीएस का एक ही मात्रा में इंजेक्शन और सामान्य परिणाम. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिसंचारी ग्लूकोज रीडिंग सुनिश्चित करने के लिए, hemolymph बूंदों की गुणवत्ता सबसे अधिक महत्व का है. केवल pericerebral वसा शरीर या अन्य ऊतक मलबे से रहित hemolymph के स्पष्ट बूंदों ग्लूकोज निर्धारण के लिए एकत्र होना चाहिए. यह भी उल्लेखनीय है कि केवल 8 नमूने रिश्तेदार ग्लूकोज सांद्रता का निर्धारण करने से पहले एकत्र होना चाहिए. हम आयुध डिपो 340 रीडिंग जब hemolymph नमूने बर्फ पर समय की एक विस्तारित अवधि के लिए छोड़ दिया गया में "बहाव" देखा.
हमारी प्रोटोकॉल उपलब्ध उपकरणों के आधार पर संशोधन के लिए बहुत कमरा छोड़ देता है. Pipet खींचने सेटिंग्स करने के लिए मॉडल और खींचने की शर्त पर आधारित संशोधित किया जा आवश्यकता हो सकती है. हमने पाया है कि intracellular रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सुइयों के उत्पादन के लिए पर्याप्त सेटिंग्स इंजेक्शन सुइयों के लिए आदर्श होते हैं. इसके अतिरिक्त, जब हम स्टिरियोस्कोप के तहत सुई की स्थिति बनाए रखने के लिए एक तीन अक्ष micromanipulator कार्यरत, यह भी एक तगड़ा ringstand और क्लंप प्रणाली के साथ प्राप्त किया जा सकता है के रूप में सुई इंजेक्शन प्रक्रिया भर में एक निश्चित स्थिति में रहता है. सुइयों के उच्च प्रतिरोध एक 1:1 सिरिंज सवार आंदोलन के रूप में इंजेक्शन तरल पदार्थ की मात्रा का निर्धारण मात्रा विस्थापन के लिए प्राप्त नहीं था के लिए एक वैकल्पिक पद्धति का विकास जरूरी इस्तेमाल किया. हम एक स्नातक पैमाने पर है कि मुद्रित किया जा सकता है सुई शाफ्ट की ओर से जुड़ी विकसित की है. प्रयुक्त सिस्टम पर निर्भर करता है, यह सुई से microinjector की सुई धारक से परे कुछ तरल पदार्थ को विस्थापित करने के लिए आवश्यक हो तो है कि तरल पदार्थ meniscus graduations के साथ गठबंधन किया जा सकता अंशांकन सुई शाफ्ट के पक्ष को चिपका कार्ड हो सकता है.
अंत में, इस तकनीक के दो सीमाओं हमारे प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है. सबसे पहले, दो व्यक्तियों को आम तौर पर दोनों इंजेक्शन और hemolymph निष्कर्षण कदम समन्वय क्रम में संसाधित नमूनों की संख्या को अधिकतम करने के लिए आवश्यक हैं. दूसरा, इंसुलिन सहिष्णुता प्रतिक्रिया में बदलाव कभी कभी एक ही जीनोटाइप के भीतर मनाया जाता है. हमारा मानना है कि इस व्यक्ति मक्खियों बर्फ और अगर पर स्थिरीकरण वसूली के बाद हो सकता है चर प्रतिक्रियाओं की वजह से है. इसलिए, की एक पर्याप्त संख्या में नमूने से पहले विश्वसनीय निष्कर्ष निकाला जा सकता है जांच की जानी चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एनआईए से YW.CF (AG31086 AG21068) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
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- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
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- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
