Summary
Korunmuş insülin sinyalizasyonu meyve sineği bulundu yolaklar
Abstract
Korunmuş besin algılama mekanizmaları, memeli ve peptidler gelişimsel larva aşamaları 1,2 sırasında glikoz dengesini korumak için sırasıyla memeli insülin ve glukagon, fonksiyon benzeyen meyve sineği arasındaki mevcut . Büyük ölçüde post-mitotik yetişkin sinekleri üzerinde yapılan çalışmalar, insülin-benzeri hücreler (IPC) 3 üreten peptid (ILP) genetik ablasyonu sonucu glikoz dengesini pertürbasyon ortaya koymuştur. Böylece, yetişkin meyve sinekleri, tip II diyabet gibi metabolik bozukluklar için uygun bir genetik model sistem olarak büyük umut tutun. Meyve sineği sistemi daha da geliştirmek için, memelilerde glukoz toleransı ve insülin duyarlılığını ölçmek için kullanılan karşılaştırılabilir fizyolojik testlerin oluşturulması gerekir. Bu amaçla, son zamanlarda erişkin sinek oral glukoz tolerans tepki ölçmek için bir roman prosedürü tarif var ve glikoz dengesini 4,5 korunmasında yetişkin IPCs önemini göstermiştir. Burada insülin enjeksiyonu 6 için daha önce açıklanan prosedür değiştirilmiş ve erişkin sinek periferik insülin duyarlılığını ölçmek için yeni bir hemolimf ekstraksiyon yöntemi ile kombine var. Benzersiz, protokol erişkin sinek insülin enjeksiyonu, insülin sinyal mutantlar ve erişkin sinek glukoz toleransı ve insülin duyarlılığını etkileyen olası müdahaleler karakterize etmek mümkün kılan bir metodoloji üzerine periferik glukoz yükü elden çıkarma yeteneği doğrudan fizyolojik ölçümler sağlar.
Protocol
1. İnsülin Çözüm Hazırlığı
- 0.01 mg / ml konsantrasyonu elde etmek için PBS içinde insülin eriterek taze sığır insülin çözüm hazırlayın. Insülin / PBS ve kontrol PBS iki çözüm de enjeksiyon prosedürü boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. Bu çözümler,% 0.5 (v / v) FD & C mavi no ile hazırlanmalıdır. 1 gıda renklendirme.
2. İğne hazırlanması ve Enjeksiyon Set-up
- Kapiller cam iğneler, çekin, 210; Hız, 100; Zaman, 200 (100ms) Isı, 345: çektirmenin ayarları enjeksiyon için yeterli kalitede iğne üreten aşağıdaki mikropipet puller.The kullanarak hazırlayın. Taze çekilmiş iğne ucu Kimwipe doku üzerinden basarak köreldiğini olmalıdır. Bu küntleşme süreci uzamış yüksek direnç ucu kaldırır ve daha büyük bir gözenek çapı ile stouter ucu üretir.
- Köreldiğini iğne ucu-insülin / yalnız PBS solüsyonu veya PBS içeren bir mikrosantrifüj tüp yerleştirin. Her iğne geri-dolum eylem sonuç Kılcal. Stereomicroscope altında hiçbir enkaz veya hava kabarcıkları ucunda görüntülendiğinden emin olmak için bir iğne ucu uyun. Temiz doldurmak değil herhangi bir iğne atın.
- Iğne ucu bir stereomikroskopta görünür böylece manuel mikroenjektör iğne tutucu ve pozisyon iğne tutucu bir micromanipulator ile doldurulur iğne takın. Mikroenjektör şırınga üzerindeki pimi takılı el mikroenjektör mikrometre düğmesini çevirerek iğne sıvı sütun üzerinde pozitif basınç uygulayın.
- Iğne ucu Kimwipe dokunmadan ve sıvı akışını doğrulayan doğrulayın sıvının yer değiştirmesi için yeterli basınç tatbik edilmiştir.
- İğnenin açık bant yapıştırmayın iğne mili, enjeksiyon için bir kalibrasyon grafiği hazırlanır ve 20X büyütme altında, bir stereomikroskopta iğne ucu ile odak noktası haline getirmek olmuştur.
3. Hazırlık Fly
- On günlük erkek sineklerin enjeksiyon deneyleri için kullanılmaktadır. Eclosion 24 saat içinde sinekleri toplayın. Erkek yeri ve erkek sineklerin dışarı standart veya tedavisinde diyet içeren flakon içine bir gaz ped nemlendirilmiş CO 2, sıralama sinekler anestezisi. 10 gün boyunca deneysel diyetler erkek sineklerin koruyun.
- Deneysel diyetler eclosion ve ayırma takip eden onuncu gün, transfer, 5 ml% 2 agar fişi içeren şişeleri, gıda içeren flakon uçar ve 12-16 saat açlıktan
- 1 saat süreyle insülin enjeksiyon öncesinde% 10 glukoz batırılmış filtreleri içeren flakon açlıktan sinek aktarın.
- Kısaca glikoz beslenmeden sonra nemlendirilmiş CO 2 sinekler uyutmak ve o zaman soğuk, buz onları hareketsiz.
4. Enjeksiyon Yöntemi
- Yavaşça ince forseps bir çift ile bir soğuk immobilize sinek kavramak ve ucu sinek toraks sol tarafında ön bölgeye bitişik şekilde iğne ucu yakın tutun. Stereomicroscope altında iğne ucu ve sinek toraks hem de odak noktası haline getirin.
- Iğne ucu tümsek sinek toraks (Şekil 1) sol prescutum bölgenin merkezi değecek şekilde hafifçe sinek iğne ucu doğru hareket ettirin. Sinek düzgün odaklı ve iğne ucu ile uyumlu bir kez, böylece iğne iğne prescutum merkezinde impales üzerine sinek ilerlemeye devam ediyor.
- Sıvı 0.1 ul sinek içine enjekte edilmiş kadar mikroenjektör mikromanipülatör düğmesi ile şırınga pistonu ilerleyen gerektiği gibi pozitif basınç uygulayın. Sinek hemocoel içine sıvı akışı, ön Toraks sol tarafına mavi bir renk verir. Bazen bir geri çekin ve herhangi bir iğne ucu tıkanması yerinden ve sıvı akışı için izin vermek için birkaç kez ilerlemek gerekir.
- Enjekte sinekler hemolimf çıkarma önce belirlenmiş zaman noktaları için% 2 agar şişeleri kurtarmak için izin verin.
5. Hemolimf Koleksiyon
- Kısaca istenilen enjeksiyon sonrası zaman noktalarında ve pozisyon nemlendirilmiş CO 2 sinekler uyutmak dorsal tarafı aşağı bir CO 2 pad yüzeyine yapıştırılmış çift taraflı bant her sinek. Hizalı kafa kapsül ile satır bile sinek düzenleyin. Bir yapıştırıcı bant kanatları basın ve immobilizasyon sağlamak için kesilmiş ahşap bir aplikatör çubuk kullanabilirsiniz.
- Sinek, bant sabit, ince forseps ile her sineğin burnumun kavramak ve baş kapsül ön stereo mikroskop ile görülebilecek şekilde, hafifçe sinek, karın ve arka sonra bölgeye yönelik çekin.
- Diğer el ile ve burnumun pozisyonda tutarak, delinme ptilinal sütür sadece üzerinde kafa kapsül merkezi keskin bir tungsten iğne kullanılarak (Şekil 2). Baş kapsülü diğer tarafı ile iğne ucu yumruk ve daha sonra c kaybetmek kolaydır Bir çok uzak iğne eklemek için dikkatli olmak gerekirhemolimf akış ontrol. Delinme hemolimf toplama önce bir enjeksiyon grubunda uçar.
- Baş kapsülü delinmiş edildikten sonra, hafifçe sinek karına baskı uygulamak için kesilmiş ahşap bir aplikatör çubuk kullanabilirsiniz. Bu kadar üzerinde baskı uygulamak gibi ventral tarafta aittir sinek rulo için yararlı olabilir. Bu prosedür, baş kapsül ponksiyon sitesinden hemolimf Bir damla üretecek.
- Baş kapsül ponksiyon sitesinde çıkan hemolimf damlacık 1μl microcapillary bir tüp bir ucundan dokunun. Hemolimf kapiller eylem ile tüp girecektir. Mezun bir miktar çizelgesi karşı microcapillary tüp içinde sıvı sütununu kontrol ederek toplanan hemolimf miktarını belirleyin ve kaydedin.
6. Hemolimf Glikoz Belirlenmesi
- Mikroplaka kuyuları Infinity Glikoz Reaktif 100 ul içeren hemolimf örnekleri çıkarın. Hemolimf örnekleri yüklenirken buz üzerinde plaka tutun.
- 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM ve 3.125mM 1 ul şekeri stok çözümlerin her biri ayrı ayrı yükleyerek bir standart eğri oluşturulması.
- 37 numune ° C'de 10 dakika.
- 340 nm'de absorbans algılar.
- Hesap hemolimf hacmi için toplanan ve bilinen glikoz konsantrasyonları ile standart eğri dayalı örnek glukoz konsantrasyonu belirlemek.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Tipik bir insülin tolerans yanıt glikoz düzeylerinin bir damla enjeksiyon sonrası 15 dakika tespit ve insülin enjekte sinekler tespit edilmiştir. Buna karşılık, bu tür tepki PBS enjekte sinekler (Şekil 3) görülmez. Periferik glukoz bertaraf Bu yanıt insülin enjekte devam enjeksiyon sonrası 30 dakika kadar uçar. Biz, her enjeksiyon grubunda rutin olarak 4-5 sinek başına 0.2-0.5 ul hemolimf ayıklayın. Üç enjeksiyon grubu, her bir deney yer almaktadır.
Şekil 1 Drosophila toraks iğne ekleme sitesi (Demerec, 1950 Değiştirilmiş) 7 gösteren sol tarafında. Prescutum, göğüs kafesinin sol tarafında ön, dorsal bölge merkezi aracılığıyla iğne yerleştirin.
Şekil 2 hemolimf çıkarımı (Demerec, 1950 Değiştirilmiş) 7 ponksiyon yerini gösteren Drosophila kafa Önden görünüm. Delinme ptilinal sütür sadece üzerinde kafa kapsül merkezinde ince bilenmiş tungsten probu ile baş kapsül.
Şekil 3 kontrolü yetişkin tespit tipik bir insülin tolerans yanıt uçar. Kontrol w 1118 sinekler, sığır insülini (PBS içinde 1 ng) veya PBS sadece enjekte edildi . 0, 15 veya 30 dakika ve glikoz düzeyleri dolaşan kurtarmak için çoğaltmak gruplar halinde Sinekler sonra izin verildi ölçüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda açıklanan teknik Drosophila hemolimf kompozisyon saptanabilir değişiklikler sonucu fizyolojik süreçleri araştıran bir çalışmada, potansiyel olarak yararlı olur. Bu şekilde enjeksiyon ve hemolimf toplama birleştirerek, belirli bir deneysel tedavi veya manipülasyon anında önemli fizyolojik etkilerini tespit etmek mümkündür. Dekapitasyon 2 içeren önceki teknikleri üzerine hemolimf koleksiyonunda bu "katliam" tekniğinin en önemli avantajı, bağırsak contents.If bakım, bazen ortaya çıkabilecek herhangi bir pericerebral yağlı vücut dokusu toplamak için alınır bu tekniği hemolimf numunelerin kontaminasyonu en aza indirir hemolimf damlacık yayılır, sonra örnekleri doğru in vivo dolaşım sıvılarında devlet yansıtmalıdır.
Bu ölçekte yapılan herhangi bir enjeksiyon deneyde doğasında potansiyel karıştırıcı bir faktör toplam dolaşım sıvılarının enjeksiyonu takiben ilk seyreltme. Bu yaş eşleştirilmiş kontrol deneysel sinekleri ya da insülin PBS aynı hacimleri enjekte ve sonuçları normalize kolay, ancak, kontrol edilebilir. Tekrarlanabilir dolaşan glikoz okumalarını sağlamak için, kalite hemolimf damlacıklarının en büyük öneme sahip. Pericerebral yağ vücut veya diğer doku enkaz yoksun hemolimf Sadece berrak damlacıklar şekeri tayini için toplanan olmalıdır. Bu kadar 8 örnekleri bağıl glukoz konsantrasyonlarının belirlenmesi önce toplanan gerektiğini de dikkat çekicidir. Biz, hemolimf örnekleri uzun bir süre için buz üzerinde kaldı OD 340 okuma bir "drift" fark ettim .
Bizim protokolü mevcut ekipman göre değişiklik için fazla yer bırakır. Pipetleyin çektirmenin ayarları çektirmenin model ve durumuna göre değiştirilmesi gerekir. Biz hücre içi kayıt elektrot iğneler üretmek için yeterli ayarları enjeksiyon iğneleri için ideal olduğunu bulduk. Stereoskop altında iğne pozisyonu korumak için üç eksenli bir mikromanipülatör istihdam Ayrıca iğne, enjeksiyon işlemi boyunca sabit bir pozisyonda kaldığı sürece, bu aynı zamanda sağlam bir ringstand ve kelepçe sistemi ile elde edilebilir. Iğneleri yüksek direnç hacmi deplasman 01:01 şırınga pistonu hareket olarak ulaşılabilir enjekte edilen sıvının hacmi değildi belirlenmesinde alternatif bir yöntem geliştirilmesi gerektirdiği kullandı. Biz baskılı ve iğne mili tarafına bağlı olabilir taksimatlıdır geliştirdi. Kullanılan sisteme bağlı olarak, sıvı menisküs mezuniyet iğne mili tarafına yapıştırılmış kalibrasyon kartı uyumlu olabilir ki mikroenjektör iğne tutucu ötesinde bazı sıvı iğne yerinden için gerekli olabilir.
Son olarak, bu tekniğin iki sınırlama protokolde not edilir. İlk olarak, iki kişi genellikle işlenen örneklerin sayısını en üst düzeye çıkarmak amacıyla enjeksiyon ve hemolimf çıkarma adımları koordine etmek gereklidir. İkinci olarak, insülin tolerans yanıt olarak değişiklikler bazen aynı genotip içerisinde görülmektedir. Biz bu bireysel sinekler agar buz immobilizasyon ve kurtarma olabilir değişken tepkiler nedeniyle inanıyorum. Bu nedenle, güvenilir sonuçlara çizilebilir önce yeterli sayıda numune muayene edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, NIA YW.CF (AG21068, AG31086) hibe ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
