Summary
हम एक का वर्णन
Protocol
सुरक्षा उपाय:
Schistosome cercariae एक कट या pores के जरूरतों के बिना सीधे त्वचा घुसना कर सकते हैं और जीर्ण रोग schistosomiasis कारण एस . mansoni एक जैव सुरक्षा स्तर 2 जीव है, इसलिए उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण है और उचित सुरक्षा उपायों संक्रामक cercaria के साथ कार्य करते समय पालन किया जाना चाहिए. Schistosomes बढ़ने और परिणत करने के लिए आवश्यक उपकरणों के अधिकांश कुछ कुंजी तालिका में उल्लेख किया प्रोटोकॉल के अंत में अपवादों के साथ मानक है. सभी cercarial एक अलग कमरे में काम किया जाना चाहिए. Schistosomules एक बाँझ, अनुमोदित जैव सुरक्षा हुड में सभ्य होना चाहिए. Nitrile या लाटेकस दस्ताने की दो परतों, पहना होना चाहिए के रूप में एक प्रयोगशाला कोट, जूते की एक निविड़ अंधकार जोड़ी, कोई छेद या आँसू, अपनी कलाई और हथियारों के लिए और निविड़ अंधकार आस्तीन रक्षक के साथ पैंट चाहिए. एक दुर्घटना में फैल के मामले में, तुरंत 70% या 10% इथेनॉल ब्लीच के साथ दूषित क्षेत्र स्प्रे, अगर अपने व्यक्ति पर सख्ती मलाई. यह परजीवी अक्षम करने के लिए पर्याप्त हो जाएगा, लेकिन सभी संभव संक्रमण और सूचित किया जाना चाहिए गंभीरता से लिया है. हालांकि schistosomules innately संक्रामक नहीं कर रहे हैं, संस्थागत दिशानिर्देशों में भिन्नता है, और चाहे BSL2 सावधानियों noninfectious जीवन के चरणों के दौरान आवश्यक हैं यह निर्धारित करने के लिए सलाह ली जानी चाहिए. सभी सतहों कीटाणुरहित है कि किसी भी संभावित संक्रामक पदार्थ के साथ संपर्क में आने के बाद प्रयोग किया है और एक अनुमोदित biohazard कंटेनर में बर्बाद त्यागें.
नोट: कवर घोंघा मेजबान डिब्बे 1 से 2 दिनों पूर्व बहा और प्रकाश से बचाने
1. घोंघा मेजबान से फसल काटने वाले cercariae
- एक स्वच्छ, 500ml आधे रास्ते कमरे के तापमान पर equilibrated आसुत पानी के साथ पूरा डिटर्जेंट मुक्त बीकर भरें. यदि मेजबान अलग तारीखों पर miracidia से संक्रमित घोंघे के साथ काम कर रहे हैं, प्रत्येक संक्रमण की तारीख के लिए एक अलग बीकर का उपयोग करें (यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर घोंघे भविष्य के प्रयोगों के लिए reused किया जाएगा). बीकर का आकार भी छोटा हो उपयोगकर्ता के अनुभव के आधार पर कर सकते हैं.
- संक्रमित घोंघा मेजबान आप के लिए शेड और उन्हें ध्यान से जमा एक मानक मछलीघर शुद्ध मछली और सामान्य प्रयोजन संदंश के रूप में की जरूरत का उपयोग कर बीकर में इच्छा ले लीजिए.
- एक आपातकालीन फैल पर प्लेस बीकर एक गरमागरम प्रकाश स्रोत के नीचे लगभग 8 से 12 इंच ट्रे. प्रकाश के तहत 1-2 घंटे के लिए खड़े चलो. Cercariae घोंघा मेजबान बाहर निकलें जब उज्ज्वल प्रकाश के संपर्क में है.
- ध्यान से बाहर cercariae मिश्रण से घोंघे फिल्टर. अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियों ले लो, के रूप में मिश्रण अत्यधिक संक्रामक है याद रखें, cercariae सीधे मानव त्वचा घुसना कर सकते हैं.!
- के बारे में 15 मिनट के लिए प्रकाश स्रोत के तहत मिश्रण बदलें, किसी भी कण बेकार बात है व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है.
- एक साफ Erlenmeyer एक pipet का उपयोग फ्लास्क में cercariae स्थानांतरण, बीकर के नीचे मलबे से परहेज. फ्लास्क 60 मिनट, cercariae एक कोने में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है - लगभग 45 के लिए एक 45 ° अंधेरे में बर्फ पर कोण पर रखें.
- 50 एमएल pipet प्रयोग सतह पर तैरनेवाला के 75 से 90% को दूर करने और यह 10% ब्लीच या 70% इथेनॉल युक्त बीकर में जमा करने के लिए, देखभाल लेने के नहीं होने से पानी की बूँदें pipet cercariae ड्रिप से युक्त.
- भंवर Erlenmeyer फ्लास्क cercariae धीरे युक्त समाधान में cercariae resuspend. बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए नमूना हस्तांतरण एक pipet का प्रयोग करें. ट्यूबों फिर अंधेरे में 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखें. Cercariae ट्यूब के नीचे की ओर अंधेरे में बसा होगा.
2. Cercariae के मैनुअल schistosomules परिवर्तन
इससे पहले कि आप शुरू: RPMI 1640 (RPMI, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1X पेन / Strep) को पूरा करने और 37 सी. सेंटीग्रेड तक गर्म (यह महत्वपूर्ण है कि भ्रूण गोजातीय सीरम इस्तेमाल किया ऊष्मायन द्वारा निष्क्रिय किया गया है एक 56 डिग्री सेल्सियस के लिए पूरक के रूप में schistosomes संवेदनशील किया जा सकता है 1 घंटे के लिए).
- एक biohazard हुड में, प्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में 5 से 10 मिलीलीटर समाधान के एक pipettor या वैक्यूम डिवाइस का उपयोग करने के लिए नीचे सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
- एक 22 डबल समाप्त गेज संलग्न, luer लोक एक उचित आकार सिरिंज सुई पायसीकारी.
- धीरे धीरे सिरिंज में मिश्रण आकर्षित. एक सिरिंज में सभी 50 मिलीलीटर ट्यूब से cercariae लीजिए. टपकाव के चौकस रहो.
- ध्यान से अधिक है कि स्वाधीन सुई अंत सिरिंज बारी है. पायसीकारी सुई के इस पक्ष को एक सिरिंज संलग्न.
- सुई के माध्यम से मिश्रण कुल 40 बार (20 आगे और पीछे बार) पास करने के लिए cercariae परिणत.
- स्थिति सीरिंज खड़ी ऐसी है कि मिश्रण नीचे सिरिंज में निहित है और ऊपर सिरिंज खाली है. शीर्ष सिरिंज निकालें और 70% इथेनॉल में कीटाणुरहित.
- जमा ड्रॉप द्वारा एक साफ उच्च दीवारों 100mm x 50mm pyrex पकवान या crystallizing पकवान में मिश्रण ड्रॉप. और 70% इथेनॉल में सुई और सिरिंज कीटाणुरहित.
- 37 डिग्री सेल्सियस RPMI 1640 पूरा मीडिया को ऐसे जोड़ें किपेट्री डिश के नीचे पूरी तरह से कवर किया जाता है के रूप में अगर एक Luria शोरबा थाली डालने के लिये है.
- धीरे भंवर पेट्री डिश के केंद्र में schistosomules इकट्ठा. Splashing से बचें.
नोट: यह इस कदम के लिए बंद हुड प्रकाश बारी के लिए और अधिक पर्याप्त रूप से केंद्र में schistosomules कल्पना उपयोगी हो सकता है. - तुरंत एक ताजा 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति अच्छी तरह से थाली एक बाँझ dropper का उपयोग में केंद्रित schistosomules जमा.
- 2.9 और 2.10 दोहराएँ जब तक कोई schistosomules अब पकवान (लगभग 10 गुना) के केंद्र में मौजूद हैं. एक ताजा अच्छी तरह से में प्रत्येक बाद संग्रह जमा.
- यह अच्छी तरह से ऊपर आधे रास्ते (~ 1.5 एमएल) prewarmed RPMI पूरा मीडिया के साथ प्रत्येक भरें.
- एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कल्पना schistosomules और cercariae के अभाव की उपस्थिति की पुष्टि.
- आगे बढ़ें एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में schistosomules 37 के लिए सेट डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
संस्कृति मीडिया में तब्दील schistosomules के हस्तांतरण लंबित, एक औंधा माइक्रोस्कोप उज्ज्वल क्षेत्र (एक उदाहरण के लिए उपकरणों की तालिका देखें) के तहत दृश्य 1, जो में ही तब्दील schistosomules अच्छी तरह से में मौजूद हैं चित्रा के समान छवि उपज चाहिए. संभावित contaminants बरकरार cercariae, cercarial पूंछ, कटे या अन्य मलबे शामिल हो सकते हैं. यदि कोई उलटा माइक्रोस्कोप उपलब्ध है, एक मानक माइक्रोस्कोप या भी एक विच्छेदन गुंजाइश schistosomules कल्पना करने के लिए पर्याप्त हो जाएगा. नोट है कि इस प्रक्रिया हमेशा cercariae की 100% नहीं बदलना है.
चित्रा 1: बदल Schistosomulum
चित्रा 2: Cercariae और पूंछ कटे
Discussion
कई संभावित समस्याओं परिवर्तन की प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न हो सकता है, तथापि, इस प्रोटोकॉल के लिए इन समस्याओं के अधिकांश से बचने के लिए डिज़ाइन किया गया है. एक संभावित खतरा पायसीकारी सुई है, जो आम तौर पर 1.3 चरण में कटाई से बचे मलबे के कारण पैदा होती है के clogging है. सभी कण 1.5 चरण में बसने और 1.6 चरण में cercariae ध्यान से हस्तांतरण की बात इस समस्या से बचने के लिए अनुमति के लिए यकीन है. इसके अलावा, के रूप में पहले वर्णित है, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर काम, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग (भी चेहरा ढाल) और सीरिंज पर अत्यधिक दबाव के बचाव की सलाह दी जाती है.
अलग cercarial पूंछ मीडिया है, जो 2.9 चरण के दौरान गरीब जुदाई का संकेत है में visualized किया जा सकता. पूंछ प्रदर्शन ऐंठन की तरह एक प्रस्ताव और एक अलग आकार है (देखें चित्र 2), और thusly schistosomules से आसानी से अलग पहचाना जाता है. पूंछ RPMI के अतिरिक्त में schistosomules धोने पूरा schistosomules को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति द्वारा हटाया जा सकता है. पूंछ अस्थायी रहना और बंद vacuumed जा सकता है.
यदि बरकरार cercariae मीडिया में मौजूद हैं, 2.5 चरण में परिवर्तन ठीक से नहीं मार डाला गया था. चित्रा 3b में संदर्भ के लिए एक अक्षुण्ण cercaria की एक छवि में दिखाया गया है. यदि इस समस्या तब होती है, तो बीमा, कि पायसीकारी सुई इस्तेमाल किया जा रहा उचित आकार का है. इसके अलावा, cercarial मिश्रण सुई के माध्यम से पारित कर दिया है बार की संख्या बढ़ा जा सकता है, हालांकि 40 गुना आम तौर पर cercarial पूंछ के 100% कर्तन दृष्टिकोण के लिए पर्याप्त से अधिक है.
Cercaria के schistosomules में परिवर्तन पहली बार Colley और Wikel (13) द्वारा 1974 में वर्णित किया गया था. तब से, schistosomules की तैयारी एक सुई और सिरिंज के साथ या तो बाल काटना रणनीति का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित है, या एक vortexing दृष्टिकोण का उपयोग कर और percoll के gradients के साथ अलग (14, 15) या घूमता रूप में इस पत्र में प्रदर्शन किया गया है. Schistosomules की तैयारी के लिए ये दो तकनीकों खूबसूरती फ्रेड (16) लुईस और दीर्घकालिक विकास के लिए schistosomules के आगे संवर्धन के लिए अधिक जानकारी NIAID Schistosome संसाधन केंद्र (में पाया जा सकता द्वारा वर्णित हैं www.schisto resource.org ).
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस परियोजना के केस वेस्टर्न रिजर्व विश्वविद्यालय स्टार्टअप ई. जॉली के लिए उपलब्ध कराई गई निधियों द्वारा वित्त पोषित किया गया था. संक्रमित घोंघे Schistosome रिसोर्स सेंटर, एनआईएच NIAID (NIAID अनुबंध सं. HHSN272201000009I) द्वारा उपलब्ध कराए गए. हम भी क्रिस राजा और रोनाल्ड Blanton संक्रमित schistosome घोंघे हासिल करने में समर्थन के लिए और उपयोगी विचार - विमर्श के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22g x 2-7/8" Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G | |
| RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D | |
| General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |
References
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