Summary
Nós descrevemos o uso de perfluorodecalin como um meio de montagem infiltrativa. Este é um método simples para melhorar a profundidade da imagem em
Abstract
O problema de aquisição de imagens de alta resolução em profundidade amostras biológicas é amplamente reconhecido 1. No ar cheio de tecidos como o mesofilo esponjoso de folhas das plantas ou dos pulmões dos vertebrados mais dificuldades surgem de várias transições no índice de refração entre os componentes celulares, entre as células e espaços aéreos e entre o tecido biológico eo resto do sistema óptico. Além disso, desencontros índice de refração levar a atenuação da excitação fluoróforo e emissão de sinal em microscopia de fluorescência. Descrevemos aqui a aplicação do perfluorocarbono, perfluorodecalin (PFD), como um meio de imagens infiltrativa que melhora a ótica de varredura a laser microscopia confocal (LSCM) imagem da amostra em profundidade, sem recorrer a aumentos prejudiciais na potência do laser e tem impacto fisiológico mínimo 2. Nós descrevemos o protocolo para utilização do PFD com tecido de Arabidopsis thaliana folha, que é opticamente complexas, como resultado de suaestrutura (Figura 1). PFD tem uma série de atributos que o tornam adequado para este uso 3. O índice de refração do PFD (1,313) é comparável com a de água (1.333) e é mais próximo ao do citosol (aprox. 1,4) do que o ar (1,000). Além disso, PFD está prontamente disponível, não-fluorescentes e não é tóxico. A baixa tensão superficial da PFD (19 dinas cm -1) é menor que a da água (72 dinas cm -1) e também abaixo do limite (25 - 30 cm dyne -1) para a penetração estomática 4, que permite a inundação o mesofilo esponjoso espaços aéreos sem a aplicação de um vácuo potencialmente destrutiva ou surfactante. Finalmente, e crucialmente, PFD tem uma grande capacidade para dissolver CO 2 e O 2, que permite a troca de gás para ser mantido no tecido inundadas, minimizando assim o impacto fisiológico sobre a amostra. Estas propriedades têm sido usados em várias aplicações que incluem respiração líquida parcial e pulmão inflação 5,6, a cirurgia 7, 8 sangue artificial, a oxigenação de crescimento media 9, e os estudos de formação de cristais de gelo nas plantas 10. Atualmente, é comum para montar o tecido em água ou tampão aquoso para a imagem latente confocal ao vivo. Consideramos que o uso de PFD como um meio de montagem representa uma melhoria em prática existente e permite a preparação simples de viver amostras de folhas inteiras para imagem.
Protocol
O protocolo a seguir descreve um método simples para usar PFD como um meio de montagem infiltrativa em folhas de Arabidopsis thaliana, mas prevemos que esse método pode ser usado em uma variedade de aplicações onde a imagem do ar rico em tecidos é desejada.
1. Montagem de amostras de folhas em PFD
- Prepare uma lâmina de microscópio com uma junta de gás-permeáveis de polidimetilsiloxano (PDMS, Carolina Gel de Observação). PDMS é um polímero viscoelástico e pode ser moldada para proporcionar uma câmara adaptada aos requisitos experimental.
- Equilibrar PFD com o ar. Isto pode ser obtido por borbulhamento de ar ou agitando um pequeno volume de PFD em uma garrafa cheia de ar.
- Decantar PFD em uma placa de Petri abertas e flutuar uma muda todo ou em folhas excisadas PFD por 5 minutos. O tecido deve tornar-se translúcida, lembrando de tecido vitrificado (Figura 2 (a)). Folhas podem aparecer mais escuro ou mais claro do que antes da exposição ao PFD, depending nas condições de iluminação ea idade do tecido utilizado.
- Encher a câmara de PDMS com ar-equilibradas PFD e transferir cuidadosamente as amostras de tecido do prato de incubação de Petri para a câmara de PDMS. Selar o slide com uma lamela e imagem de acordo com exigências experimental.
- Nota: PFD também funciona bem em uma câmara aberta construída sobre uma lamela ou em uma câmara de perfusão e é compatível com graxa de silicone. PFD não é compatível com os componentes Teflon, uma vez que dissolve-los.
2. Resultados representativos:
Exame microscópico de amostras PFD-incubadas folha mostra que a maioria dos espaços aéreos são inundadas. Figura 2 (b) mostra espaços aéreos inundado com recombinante GFP suspenso no PFD. É evidente que a folha é inundado após incubação com PFD, mas que os bolsões ocasionais de ar pode permanecer. Água não inundar a folha sob essas condições. LSCM de amostras incubadas e montado em um ri, água ou PFD mostra que PFD dá uma vantagem sobre a água eo ar na profundidade de imagem possível (Figura 3). O exemplo dado na Figura 3 mostra ar, água e PFD Arabidopsis montado deixa expressar Venus cytosolically localizada, uma variante do YFP 11, que é expressa constitutivamente sob o promotor 35S. Podemos ver um aumento de aproximadamente 2 vezes na profundidade de imagem ao comparar PFD e água. Deve-se notar, no entanto, que a melhoria precisa visto quando usando PFD varia com abertura numérica da lente e do tipo de tecido utilizado. Vimos de streaming citoplasmática e alongamento de cabelo raiz em PFD mudas tratadas, cada indicativo de plantas saudáveis. Além disso, temos mostrado que 2 Fv / Fm, uma medida do funcionamento da fotossíntese das plantas 12 permanece dentro de limites toleráveis em escalas de tempo usado em imagiologia.
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Figura 1. Complexidade e as implicações de plantas de folha óptica
Representação diagramática mostrando as características anatômicas do A. folha thaliana em relação à ótica set-up. Abreviaturas utilizadas são obj. = Objetiva de imm. = Fluido de imersão, cov. = Lamela, mnt. = Montagem, corte. = Cutícula, ad. ep. = Epiderme adaxial, st. = Poro estomático, sp. = Mesófilo esponjoso, como = espaço aéreo, amigo. = Mesofilo paliçádico, vb = feixe vascular do anúncio,. ep. = Epiderme adaxial. Paredes celulares são indicados por linhas pretas.
Figura 2. PFD penetra facilmente folhas de Arabidopsis
(A) Folhas incubadas em ar, água ou PFD por 5 minutos e fotografada usando uma câmera digital Leica DCF3000FX com um microscópio MZ16F Leica (Leica Microsystems (UK) Ltd., Milton-Keynes, UK). O logotipo Jove era impresso em filme de acetato e iluminado from abaixo com uma caixa de luz. Tempo de exposição foi de 89 ms e todas as imagens foram coletadas e processadas de forma idêntica. Barras de escala representam 2 mm.
(B) PFD carregando recombinantes purificadas proteína verde fluorescente (GFP) delimita espaços aéreos in vivo. GFP é falsa cor verde, e vermelho é usado para mostrar a clorofila auto-fluorescência, que delimita as células do mesofilo. (Figura 2 (b) reproduzida com a permissão e os detalhes técnicos completos disponíveis em Littlejohn et al. 2010 2). Barras de escala representam 25 m.
Figura 3. PFD melhora de imagem confocal em folhas
LSCM imagens mostrando cytoplasmically localizada Venus fluorescência (verde) e autofluorescência da clorofila (vermelho) em A. thaliana deixa intacta fotografada no ar, água ou PFD. Comprimento de onda de excitação de 514 nm e emissão de fluorescência foi registrada a 518 nm 604 nm para Vênus e em 657 nm679 nm para os cloroplastos. Cada painel é uma única seção confocal tirada de um Z-stack de 11 imagens confocal adquiridos em intervalos de 5 mM. Estes foram extraídos de um total Z-stack de 59 imagens adquiridas em intervalos de 1 M, que têm sido usados para produzir filmes complementares. Medições de profundidade são dados relativos à superfície epidérmica. Imagens representativas, que foram processadas de forma idêntica, são mostrados. Detalhes experimentais, tais como definições de microscópio são idênticos aos encontrados no Littlejohn et al., 2010 2. Scalebars representam 20 mM.
Discussion
Esta é uma técnica simples e fácil de usar para melhorar a microscopia de ar-cheios ou opticamente complexas tecidos. Nós mostramos que a técnica tem algumas vantagens forte e esperamos que ele será usado para elucidar questões biológicas relacionadas com ar-ricos tecidos. Por exemplo, seria uma escolha natural para estudos de ataque de patógenos no mesofilo de plantas ou nos pulmões. Nós também estamos cientes das limitações da técnica. Estamos trabalhando em uma melhor adequação do índice de refração, use com outros modos de microscopia, perfluorocarbono e reposição de montagem durante longos experimentos prazo. Também reconhecemos, no entanto, que uma das principais vantagens do PFC, ou seja, sendo biologicamente inerte tem um flipside. PFCs não são facilmente dissolver moléculas biológicas que também implica que eles não podem ser facilmente usados para compostos de interesse, tais como hormônios, drogas e outras pequenas moléculas ou íons.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Prof Nicholas Smirnoff, da Universidade de Exeter para o seu conselho e da Universidade de Exeter Facility BioImaging. O financiamento foi fornecido pelo UK Biotecnologia e Ciências Biológicas Research Council (concessão de referência BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
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