Summary
Vi presenterar en metod för användning av MALDI masspektrometri och reduktiv metylering kemi för att kvantifiera förändringar i lysin-metylering.
Abstract
Nyligen har epigenetiska regulatorer upptäckts som viktiga aktörer i många olika sjukdomar 1-3. Som ett resultat av dessa enzymer är viktiga mål för små molekyler studier och utveckling av läkemedel 4. Många epigenetiska regulatorer har endast nyligen upptäckts och är fortfarande i färd med klassificeras. Bland dessa enzymer är lysin demethylases som avlägsnar metylgrupper från lysiner på histoner och andra proteiner. På grund av den nya typen av denna klass av enzymer, har få analyser har utvecklats för att studera deras aktivitet. Detta har varit en vägspärr till både klassificering och hög kapacitet studie av histon demethylases. För närvarande mycket få demetylas analyser finns. De som finns tenderar att vara av kvalitativ art och kan inte samtidigt urskilja mellan de olika lysin metylering stater (FN, mono-, di-och tri-). Masspektrometri används ofta för att bestämma demetylas aktivitet men nuvarande masspektrometriska analyser görinte upp om differentiell metylerade peptider jonisera annorlunda. Differential jonisering av metylerade peptider som gör en jämförelse metylering stater svårt och definitivt inte kvantitativt (Figur 1A). Således finns analyserna inte är optimerade för den omfattande analysen av demetylas aktivitet.
Här beskriver vi en metod som kallas MassSQUIRM (masspektrometrisk kvantifiering med användning av isotopiskt reduktiv metylering) som är baserad på reduktiv metylering av amingrupper med deutererad formaldehyd för att tvinga alla lysiner vara di-metylerad, vilket sålunda gör dem väsentligen samma kemiska arter och därför jonisera samma (figur 1B). Den enda kemiska skillnaden efter reduktiv metylering är väte och deuterium, som inte påverkar MALDI jonisering effektivitet. Den MassSQUIRM Analysen är specifik för demetylas reaktionsprodukter med FN-, mono-eller di-metylerade lysiner. Analysen är också tillämplig på lysin metyltransferaser som ger SAmig reaktionsprodukter. Här använder vi en kombination av reduktiv metylering kemi och MALDI masspektrometri för att mäta aktiviteten av LSD1, en lysin demetylas förmåga att avlägsna di-och mono-metylgrupper, på ett syntetiskt peptidsubstrat 5. Denna analys är enkel och lätt tillgängliga för varje laboratorium med tillgång till ett MALDI masspektrometer i laboratoriet eller genom en proteomik anläggning. Analysen har ~ 8-faldig dynamiskt omfång och är lätt skalbar för att plattformat 5.
Protocol
Detta protokoll är modifierad från Blair et al. 6.
1. LSD1 Demetylering Analys
- I en slutlig volym av 20 | il, kombinera 125 ng rekombinant LSD1 med 0,25 ^ g di-metyl histon H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) i demetylas-buffert (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol). Dessutom utför en peptid ensam kontroll utan enzym. Kontrollen är för avsnitt 3 och behöver inte reduktiv metylering.
- Inkubera under 2 timmar vid 37 ° C.
- Att samla de peptider, tillsätt 8 ^ PORÖS R2-20 mikron pärlor till varje prov och skaka i 15 minuter vid rumstemperatur. Förbered PORÖS pärlor genom att avbryta 1 volym av pärlor med 1 volym metanol, och sedan lägga till 10 volymer av 5% myrsyra / 0,2% TFA.
- Tillstånd två C18 ZipTips genom att aspirera 20 | il av 0,1% TFA in i spetsen och att föra det tillbaka ut med en pipett. Gör detta två gånger med 0,1% TFA, fyra gånger med 70% acetonitril / 0,1% TFA, och fyra gånger återigen med 0,1% TFA.
- Ladda två prover (kontroll och demetylas reaktion) på de konditionerade C 18 ZipTips genom att pipettera vulsten slammet bakom C 18 hartset i ZipTips och trycka volymen igenom med en pipett.
- Tvätta ZipTips två gånger med 20 pl av 0,1% TFA.
- Eluera i 40 | il av 70% acetonitril / 0,1% TFA.
- Lyofilisera varje eluant helt med en SpeedVac koncentrator.
2. Reduktiv metylering
Denna del av protokollet ändras från Blair et al. Och Rayment et al. 6,7.
- Ätersuspendera demetylas reaktionen i 100 | il av 50 mM fosfatbuffert, pH 7,4.
- Till demetylas reaktionen, tillsätt 8 | il av 15 mg / ml boran dimetylamin. Borandimetylamin löses i 50 mM fosfatbuffert, pH 7,4, för att ge den 15 mg / ml stamlösning.Detta bör göras färskt.
- Till demetylas reaktionen, tillsätt 16 pl 250 mM deutererad formaldehyd. Den 250 mM deutererad formaldehyd beredd genom utspädning av aktier i H 2 0. Detta bör göras färskt.
- Inkubera vid 4 ° C under 2 timmar.
- Upprepa steg 2,2, 2.3 och 2,4.
- Upprepa steg 2,2.
- Inkubera vid 4 ° C under cirka 15 timmar.
- Till demetylas provet, tillsätt 12,5 | il av 1 M Tris, pH 7,4 för att släcka den reduktiva metylering reaktionen.
3. MALDI-masspektrometri
- Lägg PORÖS R2 20 micron pärlor till demetylas reaktionen och samla på ZipTips som beskrivs i steg 1,3-1,6.
Notera: Ätersuspendera kontroll i 100 | il av 50 mM fosfatbuffert, pH 7,4 och behandlas som det andra provet med början vid steg 3.1.
- Eluera kontroll och demetylas prover reaktion från ZipTips på en MALDI provplattan med 2 pl 33% mättadd 2,5-dihydroxibensoesyra. För att framställa den 33% 2,5-dihydroxibensoesyra, gör en mättad lösning av 2,5-dihydroxibensoesyra i 70% acetonitril / 0,1% TFA och därefter späda till 33% mättad i 70% acetonitril / 0,1% TFA. Låt eluerade prover som torka och kristallisera.
- Samla masspektra med en PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF masspektrometer eller tillgänglig med hög upplösning MALDI masspektrometer 8,9,10.
- Visa spektra och extrahera toppområden med PerkinElmerSciex TOFworks programvara eller programvara som tillhandahålls av masspektrometer tillverkaren.
- Kontrollera reaktionsprodukter av MS 2 med en tillgänglig masspektrometrisk system som ger tandem masspektrometriska kapacitet.
4. Dataanalys
- För att kompensera för de isotopiska överlappning skapats med hjälp av tunga formaldehyd (Figur 1B), bestäm det högsta området (A) förhållande 13 C 2 och 13 C 4 isotoper relative till monoisotopisk toppen för kontrollprovet, som inte har genomgått reduktiv metylering (Figur 2A).
Ekv 1: En 13C2 / A 12C = r 1
Ekv 2: En 13C4 / A 12C = r 2
Detta ger dig förhållandet mellan peptiden som finns i dessa isotop stater (r 1 & R 2) som är specifik för ditt experiment och masspektrometer. - Använda r 1 & r 2 värden i följande formler för att kvantifiera den relativa mängden av peptid som finns i varje modifiering tillstånd i demetylas reaktionsprovet (fig. 2B):
Ekv 3: H3K4me2 = A 1
Eq 4: H3K4me = A 2 - r 1 (A 1)
Eq 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - r 1 (A 1))]
5. Representativa resultat
Med LSD1 visar vi effekten av MassSQUIRM för kvantifieringlysin demetylering. Såsom beskrivs i protokollet text sektionen, utförde vi en demetylas-analys med 125 ng av LSD1 och 0,25 | ig di-metyl histon H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin). Kontroll-och demetylas prover reaktion utsattes för reduktiv metylering och MALDI masspektrometri. Kontrollreaktionen som inte genomgå reduktiv metylering visade den typiska isotopisk anslaget för denna peptid och gav toppareor för ekvationerna 1 och 2 (figur 2A). Masspektrumet för demetylas reaktion som föreskrivits toppareor för ekvationer 3-5 (Figur 2B). Använda toppareor från styrning och demetylas reaktion, bestämde vi att LSD1 demetyleras peptiden för att ge följande reaktionsprodukterna: 33,7% di-metyl Lys4, 42,3% mono-metyl Lys4 och 24% un-metylerad Lys 4. Se Blair et al. För fullständig analys av LSD1 demetylas aktivitet samt studier hämmare 6. Notera att ändra variabler såsom reaktionstid, enzymkoncentration och substratkoncentrationen kommer att möjliggöra en djupgående analys av aktivitet.
Figur 1. MassSQUIRM översikt. (A) en N-terminal peptid från histon H3 visas såsom un-(grön), mono-(röd), eller di-(blå) metylerad vid lysin 4. Variation i den kemiska sammansättningen av varje peptid leder till olika jonisering framställning kvantifiering komplex. (B) Reduktiv metylering konverterar alla lysinrester till di-metyl tillstånd som orsakar alla peptider för att jonisera på liknande sätt. Användningen av tung formaldehyd i den reduktiva metylering reaktionen tillåter retention av identiteten för den ursprungliga metylering. Öppna cirklar visar ljuset metylering, medan slutna cirklar indikerar tungt metylering. Modifierad från Blair et al. 2011 6.
Figure 2. MassSQUIRM kan användas för att kvantifiera differentiellt metylerade peptider. (A) en di-metylerade syntetisk histon H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) analyserades med användning av masspektrometri och förhållanden toppar relativt monoisotopisk topp noterades som r 1 och r 2 i ekvationerna 1 och 2. (B) Samma syntetiska peptiden inkuberades med 125 ng LSD1 i demetylas buffert under två timmar vid 37 ° C. Proverna utsattes sedan för MassSQUIRM analys. En blandad population av överlappande topparna representerar tre olika metylering staterna ses i figur 1B. Områden under form av enkla isotoper topparna noterades som A 1, A 2 och A 3. Toppareor användes i ekvationerna 3-5. Öppna cirklar visar ljuset metylering, medan slutna cirklar indikerar tungt metylering. Modifierad från Blair et al. 2011 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MassSQUIRM är en billig och kvantitativ metod för heltäckande analys av aktiviteten av lysin demethylases involverade i mono-och di-metylering. MassSQUIRM erbjuder kvantifiering inte bara av produkten av reaktionen, utan även för mellanprodukterna. Denna analys kan användas som ett kraftfullt verktyg för att studera mekanismen för LSD1 och andra histon demethylases. Det kommer också att vara användbara för att klassificera många nyligen upptäckta lysin demetylas enzymer såsom PHF8 och skulle kunna användas för vissa metyltransferasmutanter enzymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar UAMS Proteomics faciliteten för masspektrometrisk stöd. Finansieringen för detta projekt har tillhandahållits av NIH bidrag P20RR015569, P20RR016460 och R01DA025755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 | |
| H3K4me2-biotin peptide | Prepared in Lab | none | |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 | |
| C18 ZipTip | EMD Millipore | ZTC18M | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28904 | |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A996 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 85707 | |
| Borane dimethylamine | Sigma-Aldrich | 180238 | |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP154 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Formic acid | Fluka | 06440 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| Na-phosphate | Fisher Scientific | BP329 | |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 | |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmer, Inc. | none |
References
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T.
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
