Summary
Bananflue,
Abstract
Å studere nevrale nettverk i form av deres funksjon i atferd, må vi analysere hvordan nervecellene fungerer når hver atferdsmønster blir generert. Dermed samtidige opptak av neuronal aktivitet og adferd er viktig å relatere hjerneaktiviteten til oppførsel. For slike atferdsproblemer analyser, tillater bananflue, Drosophila melanogaster, oss til å innlemme genetisk kodede kalsium indikatorer som GCaMP 1, for å overvåke neuronal aktivitet, og å bruke avanserte genetiske manipulasjoner for optogenetic eller thermogenetic teknikker for å spesifikt aktiver identifisert nerveceller 2-5. Bruk av thermogenetic teknikk har ført oss til å finne kritiske nevroner for mating oppførsel (Flood et al., Under revisjon). Som en viktig del av fôring atferd, strekker en Drosophila voksen sine snabel for fôring 6 (proboscis forlengelse respons; PER), svarer til en søt stimulans fra sansecellene på sine snabel eller tarsi. Combining protokollen for PER 7 med en kalsium avbildningsteknikk 8 bruker GCaMP3.0 1, 9, har jeg etablert en eksperimentell system, hvor vi kan overvåke aktiviteten til nerveceller i fôring sentrum - den suboesophageal ganglion (SOG), samtidig med atferdsmessige observasjon av snabel. Jeg har designet et apparat ("Fly hjerne Levende Imaging og Elektrofysiologi Stage": "Fluer") for å imøtekomme et Drosophila voksen, slik at dets snabel til å fritt bevege mens hjernen er utsatt til badet for Ca 2 + bildebehandling gjennom en nedsenking i vann linse . Fluene er også egnet for mange typer levende eksperimenter på flue hjerner som elektrofysiologisk opptak eller tidsforløp avbildning av synaptiske morfologi. Fordi resultatene fra levende imaging kan være direkte korrelert med samtidig PER atferd, kan denne metoden gi en utmerket eksperimentelt system for å studere informasjonen behandlingen av nevrale nettverk, og hvordan dette cellular aktivitet er koblet til plast prosesser og minne.
Protocol
1. Constructing the Flies
- Forme en plattform fra lokket på 35 mm Falcon tallerken ved smelting sideveggen og carving det å danne en passende vinkel og tykkelse (figur 1a, figur 2). Bor et hull i plattformen for å godta flua hodet (Figur 1a, b), slik at munndeler er fritt eksponert til utsiden av kammeret (Figur 1a). Skjær enden av en Pipetman spissen, med størrelsen matchende flua å bli observert. Lim spissen til plattformen som vist i Figur 1a å fullføre the Flies (figur 2).
2. Klargjøre Fly til observasjon
- Sulte en voksen flue i 24 timer ved 25 ° C før eksperimentet ved å plassere den i et hetteglass med bare ett vått tørkepapir, hvis sult er nødvendig.
- Anesthetize flua ved å plassere den i en 15ml plastrør stående på is.
- Ved hjelp av tang, sett en flue inn i kammeret iFluer, og skyv flua før den er ute av stand til å bevege seg. Deretter setter en plugg for å beholde flua. (Figur 1a, b).
- Tett de omliggende delene av proksimale snabel (talerstolen) til den indre kanten av hullet; Påfør en liten mengde lys-herdende lim (Tetric EvoFlow) til sidene og over talerstolen fra utsiden (pilene i figur 3). Også bruke lim fra innsiden av fluene til mellomrommet mellom dorsal del av hodet og den indre kanten av hullet (Figur 1b). Hvis du vil tillate talerstolen for å bevege seg fritt, bør man sørge for å hindre lim fra berøre seierspallen ved hjelp av en øyenvippe (eller noe lignende) til å spre limet. Endelig kur limet med den svakeste belysning av blått lys nok for herding for å unngå skade på fly fra sterk varme. Fjern pluggen.
- En tråd for å holde talerstolen delvis opphevet (pilen i figur 3) kan benyttes for å stabilisere fly "hode ved å unngå bump av svelg del å SOG og å eksponere ventrale delen av SOG, spesielt for imaging presynaptiske terminalene Gr5a 8 nevroner som er dekket av en del av svelget når snabel er helt tilbaketrukket.
- Fyll overflaten av plattformen med en sukker-fri saltvann inneholder (i mm): NaCl, 140, KCl, 2, 2 MgCl, 4,5, 2 CaCl, 1,5; og HEPES-NaOH, 5 med en pH på 7,1 10. Dette sukrose-free saltvann har lik tonicity de av vanlig brukte sukrose som inneholder Salines som HL3.1 11.
- Åpne hodet kapselen med en wolfram blad og tang med skjerpet tips som sakser, som er en skreddersydd enhet og opprinnelig utviklet av dr. Kageyuki Yamaoka, Japan, for å klippe cuticle og luftrøret for å avdekke SOG (figur 4). Den ventrale kanten av hodet skjellaget ble kuttet så ventral som mulig mens dorsal kanten kutt var ikke like kritisk. Først må et snitt gjennombakre kant ved hjelp av en tungsten blad. Deretter skjære gjennom siden og de fremre kantene ved hjelp av skjerpet tang. Kuttet cuticle stykket bør løftes med pinsett og fjernet. Antenner og antennal nerver bør kuttes ut av skjerpet tang.
- For å unngå bevegelse gjenstander under opptak, må hjernen være stabilisert gjennom fjerning av visse deler av flua. Først selektivt fjerne luft sekker mellom SOG og skjellaget. Kutt i spiserøret på slutten mot svelget og i enden som går inn i SOG å fjerne forbindelsen mellom svelget og hjernen. Deretter trekker ut Muscle 16 12, og til slutt, ta noen luftrøret kobler hjernen og skjellaget.
- Vi setter våre fluer på scenen av en Olympus BX51WI mikroskop koblet til en spinner disk confocal mikroskop system (Improvision i PerkinElmer) (figur 5). En nedsenking i vann linse, f.eks 40X/0.8 NA, ble oppslukt i badekaret (Figur 6
3. Ca 2 + Imaging of the Brain
- Ca 2 + avbildning ved hjelp GCaMP3.0 1, 9 ble utført gjennom metoden etablert ved Marella et al. 8 (figur 6). Ved hjelp av en roterende disk confocal mikroskop (Improvision), ta en enkel optisk seksjonen ved 4Hz med en eksponeringstid på 122ms bruke 491nm eksitasjon laser, med fokus på regionen av interesse (en celle kroppen av en motor nevron, eller en interneuron, eller presynaptiske terminaler av gustatory sensoriske nevroner) med Velocity programvare, ver. 4.3 (Improvision).
4. Stimulere de Proboscis
- Sug 100mm vandig sukroseløsning inn en kanyle med en liten veke (laget av japansk Washi papir, se tabell over spesifikke reagenser) stikker fra tuppen (figur 7).
- Utslipp en liten dråpe sukroseløsning på veken, da, aspirer det, straks before anvende gjennomvåt Washi papiret veke til tuppen av snabel. Den Washi papir veke bør bare brukes et øyeblikk for å unngå metning (Figur 8). Overvåk Proboscis Extension Response (PER) atferd med en CCD-kamera festet til en disseksjon mikroskop (figur 5) samtidig med Ca 2 + bildebehandling. Data må tas innen en time etter start av disseksjon fordi PER responsen ikke er vedlikeholdt mer enn én time under disse forholdene.
5. Representative Resultater
Motoriske nerveceller i talerstolen vinkelmåler, et par store muskler som er ansvarlige for å løfte talerstolen for snabel forlengelse, har blitt rapportert å vise robuste svar på søte stimuli 13. Figur 9 viser Ca 2 +-signaler gjennom GCaMP3.0 1, 9 uttrykt ved en Gal 4 driver, E49 13, fra en celle kroppen av motoriske nevroner. Som vist i videoen, en robust PER ble observert i synkronisert med en økning i Ca 2 +-signalet.
Figur 1. Skjematisk på flua hjernen Live-Imaging og Elektrofysiologi Stage (fluer). en, er Fluene bygget slik at vinkelen på veggen gjør for flua hodet å komme ut rett. Tre segmenter på flua snabel er fargekodet, talerstolen er magenta. Flua er satt inn i kammeret med pinsett, og et stykke kuttet fra slutten av en Pipetman tips er koblet til på baksiden av kammeret for å blokkere flua rømmer. B, er hullet lei å samsvare med flua hode. De resterende hullene er tettet med lys-herdende lim som angitt for å sikre at det ikke er noen lekkasjer. Etter at limet har herdet, er Pipetman spissen som en plugg fjernet. Saline helles i Fluenes slike at overflaten av hjernen er helt dekket. Det bør sikres at det ikke er saltvann lekkasjeIng ut på den fremre enden av flua hodet. Det skraverte området er omgitt av den stiplede linjen i panel B viser den delen som skal dissekert ut.
Figur 2. Fotografi av fluene. Den halvmåneformede vegg av lim (fra en limpistol) er laget for å kontrollere flyten av saltvann under perfusjon, og for å redusere mengden av saltvann brukes.
Figur 3. Frontal bilde av en flue montert i fluene. Dette bildet viser hvordan en flue er satt i fluer, og hvordan lyset-herding lim påføres rundt hodet på flua (piler) for å skape en saltløsning-bevis forsegling. Hvis noen saltvann lekker gjennom til snabel på flua, så forsøket vil mislykkes. Tråden (pilspisser) tjoret til scenen er å ha snabel i posisjon, slik at den ikke er helt retrac ted. Ellers ville det hindre mer ventrale delen av SOG og forårsake bevegelse gjenstander.
Figur 4. Top-view of the Flies med en dissekert flue. Dette bildet viser den eksponerte SOG av en flue følgende cuticle fjerning. Spiserøret, Muscle 16 og tracheae koblet til hjernen, samt utvalgte luft-sekker har også blitt fjernet for å forhindre dem fra å forstyrre hjernen, noe som kan føre til artefakter i kalsium signaler.
Figur 5. Overvåkingen apparat. Dette apparatet er satt sammen fra en Olympus BX51WI mikroskop festet til en roterende disk confocal mikroskop system (Improvision), og en sidemontert Nikon SMZ800 mikroskop. Dette oppsettet gir live-avbildning av hjerneaktivitet under PER oppførsel.
6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
Figur 6. Fotografier å vise side-visning av fluene. Det tynne laget av saltvann er klemt mellom 40X vann-nedsenking objektiv og flua.
Figur 7. Skjematisk for å gjøre det Washi papiret veke. Gampi-Washi papir er en tradisjonell japansk pergament som er ekstremt tynn og glatt (Haibara, Japan). Det er også veldig sterk og kan beholde en stor mengde væske. Den Washi papir må kuttes i en trapes med svært spesifikke dimensjoner; 0,3 mm og 0,7 mm i bredden, og 4-5 mm i lengde (a). Dette trapesformet blir deretter satt fra 0,7 mm siden i spissen av en 23 G kanyle, og kan også bli stabilisert gjennom innsetting av et insekt-pin, som er bøyd til en V-form (b). C, blir Washi papir gjennomsiktig etter eksponeringtil en væske, noe som gjør det ideelt for dette eksperimentet.
Figur 8. Stimulering av snabel på fluer med den Washi-veke. Den Washi papir veke på spissen av en kanyle er søkt om et øyeblikk med en joystick manipulator med én hånd. Nålen er koblet via et fleksibelt rør til en injektor manipulert med den andre hånden, for å aspirere og utlading sukroseløsning.
Figur 9. Representative resultater. en, PER atferd registrert ved CCD kamera installert på stereomikroskop. Frontale utsikt over en utsultet fly med et utvidet snabel (piler) før stimulering, ved stimulering, og etter stimulering med en veke som inneholder 100 mm sukrose vandig løsning (pilspiss). Illumination oppnås ved en 491 nm laser brukesfor GCaMP fluorescens. b, sukrose-induserte GCaMP 3,0 respons i motoren nervecellen til transportør av seierspallen muskel i sultet tilstand. Den øverste panel, før stimulering, bunnpanelet, umiddelbart etter stimulering. Scale bar, 10 mikrometer. C, Kvantifisering av sukrose-indusert GCaMP 3,0 respons. Den motoriske nevroner svarer på en sukrose stimulans av en kraftig økning i fluorescens, etterfulgt av en restaurering fase av flere sekunder til grunnlinjen.
Discussion
Fluene tillater samtidig opptak av Ca 2 +-signaler og PER atferd. Selv med hjernen utsettes for saltvann normal PER atferd ble observert. Bruke Gampi-Washi veke istedenfor en Kimwipe veken brukt i den opprinnelige kapillær method7 muliggjør en meget reproduserbar og stabil PER atferd og unngår behovet for å bli dyktige i å lage og velge en god Kimwipe veke. De eksperimentelle tipsene nevnt ovenfor tillot oss å kunne unngå forstyrrelser av bevegelse av snabel, som fører til en meget stabil opptak av Ca 2 +-signaler med lavt støynivå. Noen ganger var vevet fjerning ikke er tilstrekkelig til å utsette celler eller undertrykke bevegelse tilstrekkelig, noe som fører til dårlige resultater. Men når vi var dyktig, produsert mer enn 80% av preparater gode resultater. Metoden er ikke bare for Ca 2 + bildebehandling, men kan også tilpasses enhver levende lydbilde samtidig observere PER oppførsel. For eksempel kan vi få tilgang til en celle gjennombruk av en elektrode til direkte registrere aktivitet. Kombinert med to-foton eksitasjon mikroskopi, er vi i stand til å utføre tidsforløp avbildning av synaptisk struktur, som kan være relatert til atferdsendringer. Derfor er denne metoden for avbildning av hjernen med atferdsmessige observasjoner ikke bare verdifullt for den funksjonelle disseksjon av nevrale nettverk, men kan brukes som et kraftig verktøy for å korrelere synaptisk plastisitet 14 til mekanismene bak hukommelse.
Acknowledgments
Jeg takker L Watanabe, M Gorczyca og andre medlemmer av Yoshihara lab for nyttige kommentarer og diskusjon. Jeg takker K. Scott og L. Looger for flue aksjer, S Yokoyama for å demonstrere eksperimenter, Shinya Iguchi for teknisk hjelp, og Nobuko Yoshihara for vesentlige opplysninger. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Mental Health Grants MH85958, og Worcester Foundation for å MY
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetric EvoFlow | Ivoclar vivadent | M04115 | Light-curing glue |
| BX51WI Microscope | Olympus Corporation | BX51WI | With 40X (N.A. 0.8) water immersion objective lens |
| Spinning disk confocal microscope system | PerkinElmer, Inc. | With 491 nm laser | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ-800 | Attached to a swing arm. Stereo view is still available with video recording |
| Gampi-Washi paper | Haibara, Japan | A special kind of traditional Japanese paper | |
| CCD camera | Imaging Source | DFK41AU02 | 1/2" 1080 × 960 pixels SONY CCD |
| Joystick manipulator | Narishige International | MN-151 | |
| Injector | Narishige International | IM-5B |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121, 141-152 (2005).
- Schroll, C. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hamada, F. N. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Peabody, N. C. Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel. J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).
- Dethier, V. G. Hungry Fly. , Harvard University Press. (1976).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).
- Marella, S. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category. 49, 285-295 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth. Science. 310, 858-863 (2005).
