확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster

이 절차의 전반적인 목적은 섭식 행동 관찰과 동시에 칼슘 이미징을 통해 뉴런의 활동을 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 초파리를 초파리 고정 장치에 삽입함으로써 수행됩니다. 그다음, 뇌를 노출시키기 위해 초파리의 머리를 해부합니다.

해부된 초파리가 고정된 장치를 현미경 스테이지 위에 배치합니다. 실험 절차의 마지막 단계는 설탕 심지를 이용해 pro-proboscis를 자극하는 것입니다. 최종적으로, 행동 비디오 녹화를 통한 proboscis 신장과 상관관계가 있는 칼슘 이미징을 통해 특정 뉴런의 활성화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

저는 수면 위를 헤엄치는 비팅 비어(beating beers)의 눈을 보고 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 비어는 갈라진 눈을 가지고 있어 수면 위와 아래를 동시에 볼 수 있습니다. 제 실험에서 까다로운 점은 뇌와 SCU가 서로 가깝다는 것이지만, 비어의 눈처럼 깔끔하게 분리할 수 있다면 뇌가 새틀라이트(satellite)에 노출된 동안에도 SCU를 건조한 상태로 유지할 수 있습니다.

건조한 면과 습한 구역을 분리하기 위해 SCU 바로 위에 매우 단순한 격벽을 만들었습니다. 35 mm 팔콘 디쉬 뚜껑의 측벽을 녹이고 적절한 각도와 두께로 깎아 플랫폼 형태를 잡습니다. 파리 머리가 들어갈 수 있도록 플랫폼에 구멍을 뚫어, 입 부분이 챔버 외부로 자유롭게 노출되게 합니다. 파리의 몸체가 들어갈 수 있을 만큼의 너비로 피펫 팁의 끝부분을 자른 후, 이 팁을 플랫폼에 접착제로 고정합니다.

성체 초파리를 25 °C에서 24시간 동안 기아 상태로 둡니다. 핀셋을 사용하여 초파리를 얼음 위에 세운 15 mL 플라스틱 튜브에 넣어 마취시킵니다. 초파리를 챔버에 넣고, 움직일 수 없을 때까지 부드럽게 밀어 넣습니다.

속눈썹 족집게나 유사한 도구를 사용하여 접착제를 조심스럽게 펴 바르면서, 광경화성 접착제를 소량 도포하여 근위부 주둥이 또는 rostrum의 주변부를 구멍의 내측 가장자리에 밀봉합니다. 또한, 파리 내부에서 머리의 등쪽 부분과 구멍의 내측 가장자리 사이의 공간에 접착제를 도포합니다. 마지막으로, 파리에 손상을 주지 않도록 경화에 충분한 가장 약한 강도의 청색광을 조사하여 접착제를 경화시킵니다.

초파리의 머리를 고정하고 SOG의 복측 부위를 노출시키기 위해, 실을 연결하여 주둥이가 부분적으로 들려 있게 유지합니다. 초파리가 적절히 배치되면, 플랫폼 표면을 sucrose-free saline으로 채웁니다. 텅스텐 블레이드와 끝을 날카롭게 만든 핀셋(sharpened forceps)을 사용하여 머리 캡슐을 열어 SOG를 노출시킵니다.

Scis zips. 이것은 비교를 위해 Kim wipe에서 섬유 한 가닥을 절단하는 scis zips의 시연입니다. 먼저 시야 내에서 iris scissors로 수행한 후, 1mm 눈금 자 앞에서 수행합니다.

먼저 텅스텐 블레이드를 사용하여 후측 가장자리를 절개합니다. 그런 다음 정밀 핀셋을 사용하여 측면과 전측 가장자리를 절단합니다. 핀셋으로 절단된 큐티클 조각을 들어 올려 제거합니다.

포셉을 사용하여 더듬이와 더듬이 신경을 절단합니다. 그런 다음 뇌를 안정시키고 움직임으로 인한 아티팩트를 방지하기 위해 SOG와 큐티클 사이의 기낭을 선택적으로 제거합니다. 다음으로, 인두와 뇌 사이의 연결을 제거하기 위해 인두 쪽 끝부분과 SOG로 들어가는 끝부분의 식도를 절단합니다.

그다음 근육 16을 식별하여 끌어낸 후, 뇌와 큐티클을 연결하는 모든 기관을 분리합니다. 초점 회전 디스크 공초점 현미경(spinning disc confocal microscope)의 스테이지 위에 초파리를 놓고, 이미징을 위해 수침 렌즈로 전환합니다. 그런 다음 491 nm 여기 레이저를 사용하여 관심 영역에 초점을 맞추고, 노출 시간 122 ms, 4 Hz의 속도로 단일 광학 절편을 촬영합니다.

초파리에게 설탕물을 제공하기 위해 팁 부분에 일본어지(Japanese paper) 심지가 작게 돌출된 주사바늘을 사용하십시오. 심지에 설탕물 용액을 소량 떨어뜨린 다음, 조이스틱 조작기로 바늘을 고정한 상태에서 유연한 튜브를 통해 바늘과 연결된 인젝터로 용액을 흡입하십시오.

적신 거름종이 심지를 프로브 팁에 아주 잠시만 접촉시키십시오. 이는 포화를 방지하기 위함입니다. 칼슘 이미징과 동시에 해부 현미경에 부착된 CCD 카메라를 사용하여 PROBUS 신장 반응 또는 PER 행동을 모니터링하고, 반드시 해부 후 1시간 이내에 데이터를 수집하십시오.

여기에 100 millimolar sucrose가 포함된 WIC 자극에 대한 전형적인 prob Bois 신장 반응이 나타나 있습니다. G CAMP 형광 측정을 위해 491 nanometer 레이저를 사용하여 수용액 상태를 이미지화했습니다. proba 신장 반응 행동 동안 동시에 수행된 칼슘 이미징을 통해, 자극 전후로 rostrum 견인근의 운동 뉴런에서 sucrose에 의해 유도된 GAMP 3.0 반응을 시각화할 수 있습니다.

상태 정량화의 시작 단계에서 sucrose로 유도된 GAMP 3.0 반응을 살펴보면, 운동 뉴런이 sucrose 자극에 대해 형광 강도의 급격한 증가로 반응한 후, 수 초 동안 기저선으로 회복되는 단계가 나타남을 알 수 있습니다. 이 플랫폼의 초파리를 이용하면 전기생리학, 광유전학, 심리유전학, 또는 화학적 뉴런 활성화와 같은 다른 방법들이 가능하며, GFP로 표지된 구조의 타임랩스 랩 이미징을 통해 시냅스 가소성과 기억 사이의 상관관계와 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.