Name: 확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster의 먹이 행동 중 칼슘 이미징을 이용한 뉴런 활성 동시 모니터링 방법을. 이 기술은 신경 과학 연구자들이 섭취 반응의 신경 메커니즘을 실시간으로 시각화하고 분석하는 데 활용됩니다.

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나는 L 와타나베, M Gorczyca하고 유용한 의견과 토론 요시 연구소의 다른 회원들에게 감사드립니다. 나는 파리 주식, 실험을 시연을위한 S 요코야마, 기술적인 도움 신야 Iguchi 및 재료 정보에 대한 Nobuko 요시 위해 K. 스캇과 L. Looger 감사드립니다. 이 작품은 정신 건강 보조금 MH85958 국립 연구소, 그리고 내로 우스터 재단에 의해 지원되었다

1. 파리를 구축 <ol><li> 측벽에 녹아하고 적절한 각도와 두께 (; 그림 2 그림 1A)을 형성하기 위하여 그것을 조각하여 35mm 팔콘 요리의 뚜껑에서 플랫폼을 형성. mouthparts 자유롭게 챔버 (그림 1A)의 외부에 노출되는 등 파리 헤드 (그림 1A, B)를 수용하는 플랫폼에 구멍을 드릴 다운합니다. 파리가 관찰되는 매칭 크기, Pipetman 팁의 끝을 잘라요. 플랫폼에 접착제는 팁 파리 (그림 2)를 완료하기 위해 그림 1A와 같이. </li></ol> 2. 관측을위한 플라이 준비하기 <ol><li> 25 24 시간 동안 성인 파리를 굶어 ° C에서 기아가 필요한 경우에만 젖은 종이 타월과 함께 유리병에 넣어 의해 실험 이전. </li><li> 빙판에 서있는 15ml 플라스틱 튜브에 배치하여 파리를 마취. </li><li> 포셉 사용의 챔버로 플라이를 삽입파리, 그리고 움직이지 못할 때까지 가볍게에서 파리를 밀어. 그런 파리를 유지하기 위해 플러그를 삽입합니다. (그림 1A, B). </li><li> 구멍의 안쪽 가장자리에 근위 코 (연단)의 주변 부분을 밀봉, 양쪽에 가벼운 경화 접착제 (Tetric EvoFlow)의 소량을 적용하고부터 연단 위에 밖으로 (그림 3의 화살표). 파리의 안쪽에서 머리 지느러미 부분과 구멍의 내부 모서리 (그림 1B) 사이의 공간에 접착제도를 적용합니다. 연단 자유롭게 이동할 수 있도록하려면주의가 접착제를 확산 속눈썹 (또는 비교 무언가)을 사용하여 연단을 만져서 어떤 접착제를 방지하기 위해 이동해야합니다. 마지막으로, 과도한 열에서 파리 손상을 방지하기 위해 치료를위한 충분한 푸른 빛의 약한 조명과 접착제를 치료. 플러그를 제거합니다. </li><li> 연단 부분 (그림 3의 화살표) 해제를 개최하는 스레드 플라이를 안정시켜 고용 수 있습니다 &#39;SOG로 pharyngeal 부품의 충돌을 피하고, 특히 코가 완전히 철회되는 인두의 일부로 적용되는 Gr5a 뉴런 8의 영상 presynaptic 터미널에 대해, SOG의 복부 부분을 노출하여 s의 헤드. </li><li> , KCl, 2, MgCl 2, 4.5, CaCl 2, 1.5, 그리고 HEPES-NaOH, 5 7.1 10 산도와 NaCl, 140 : 무설탕 염분 함유 (㎜)을 함께 플랫폼의 표면을 채우십시오. 이 자당없는 염분은 일반적으로 사용되는 분들 자당 함유 같은 HL3.1 11로 salines을과 비슷한 tonicity 있습니다. </li><li> 맞춤 장치이며 원래 SOG를 (그림 4) 노출 표피와 호흡 관을 버리 박사 Kageyuki 야마오카, 일본, 설계한 가위처럼 날카롭게 조언과 텅스텐 칼날과 집게를 사용하여 헤드 캡슐을 엽니다. 지느러미 가장자리 상처 등 중요한 아니었 반면 머리 표피의 복부 가장자리는 가능한 한 복부으로 절단되었다. 첫째,을 통해 절개를 할후부 가장자리 텅스텐 블레이드를 사용. 그런 측면을 잘라 날카롭게 집게를 사용하여 앞부분은 가장자리. 컷 표피 조각은 집게와 함께 해제 및 제거해야합니다. 안테나 및 antennal 신경이 날카롭게 포셉 의해 절단해야합니다. </li><li> 녹음하는 동안 움직임 유물을 피하기 위해, 머리가 파리의 특정 부분의 제거를 통해 안정되어야합니다. 첫째, 선택적으로 SOG와 표피 사이에 공기 자루를 제거합니다. 인두쪽으로 끝에 및 인두와 뇌 사이의 연결을 제거하는 SOG로가는 끝에 식도를 잘라. 그렇다면 근육 16 12를 꺼내, 그리고 마지막으로, 두뇌와 표피를 연결하는 기관을 분리. </li><li> 우리는 스피닝 디스크 공촛점 현미경 시스템 (PerkinElmer에서 Improvision) (그림 5)에 연결된 올림푸스 BX51WI 현미경의 무대에서 우리의 파리를 설정합니다. 물 침지 렌즈, 예를 들어 40X/0.8 NA는 목욕탕 (그림 6에 열중했다 </strong&gt;). </li></ol> 3. 칼슘이 뇌 + 이미징 <ol><li> 칼슘 2 + 영상은 GCaMP3.0를 사용하여 1, 9가 Marella 외가 정한 방법을 통해 수행되었다. 8 (그림 6). 스피닝 디스크 공촛점 현미경 (Improvision) 사용하면, 관심있는 지역 (모터 신경 세포의 세포 본문, interneuron, 또는 presynaptic 터미널에 초점을 맞추고, 491nm 여기 레이저를 사용하여 122ms의 노출 시간과 4Hz에서 하나의 광학 부분을 받아 gustatory 감각 뉴런의) 속도 소프트웨어 버전과. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. 코을 자극 <ol><li> 팁 (그림 7)에서 튀어나온 작은 심지 (일본어 Washi 종이로 만든, 특정 시약의 표 참조)로 피하 주사 바늘로 100mM 수성 자당 솔루션을 기음. </li><li> 심지쪽으로 자당 솔루션의 작은 방울 방전 후 즉시 befor, 그것을 기음코 끝에 젖은 Washi 종이 심지를 적용 5. Washi 종이 심지는 포만 (그림 8)을 피하기 위해 즉각 신청해야합니다. 코 확장 응답 (당) 칼슘 2 + 이미징와 동시에 (그림 5) 해부 현미경에 부착된 CCD 카메라를 사용하여 동작을 모니터링합니다. 데이터 인당 응답이 이러한 조건 하에서 하나 이상의 시간 유지되지 않기 때문에 절개를 시작 후 한 시간 이내 촬영해야합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 연단의 분도기, 코 확장을위한 연단을 리프팅을 담당 주요 근육의 쌍의 모터 뉴런은 달콤한 자극 13 강력한 반응을 보여주보고되었습니다. 그림 9 보여주는 칼슘 2 + 신호 GCaMP3.0 1, 9까지로 표현 모터 신경 세포의 세포 시체에서 걸 네 드라이버, E49 13. 비디오, robu에 표시된 바와 같이일 인당는 칼슘 2 + 신호의 증가 synchrony에서 관찰되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> 1 그림. 플라이 두뇌 라이브 이미징 및 전기 생리학 무대 (파리)의 개략도. , 파리는 파리 머리는 똑바로 나오게하는 벽의 각도가 허용되는 등 내장되어 있습니다. 플라이 코 세 세그먼트는 색깔, 연단은 자홍색이다. 파리는 집게와 챔버에 삽입하고, Pipetman 팁의 끝 부분부터 잘라 조각 탈출 플라이를 차단하는 챔버의 뒷면에 연결합니다. B는, 구멍은 파리의 머리에 부합하는 지루합니다. 전혀 누수가없는 것을 확인하기 위해 지적대로 남아있는 격차는 광 경화 접착제로 봉인된다. 접착제가 완치되면 플러그 같은 Pipetman 팁이 제거됩니다. 식염수는 두뇌의 표면이 완전히 덮여있는 등 파리에 부어있다. 그것은 아무 식염수 누수가 없다는 것을 보장해야파리 머리의 앞부분 끝에 밖으로 접근한. 패널 B의 점선으로 둘러싸인 음영처리된 영역 밖으로 해부되는 부분을 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> 그림 2. 파리 사진. 접착제의 초승달 모양의 벽이 (아교 총에서) 재관류 동안 생리 식염수의 흐름을 제어하고, 사용되는 염분의 양을 줄이기 위해 만들어졌다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> 그림 3. 파리의 정면보기 광 경화 접착제는 염분 방지 도장을 만들 플라이 (화살표)의 머리 주위에 적용되는 방법이 이미지는 파리가 파리에서 설정하는 방법을 보여줍니다. 파리에 마운트합니다. 파리의 코에 이르기까지 모든 식염수 누수 다음, 실험이 실패합니다 바랍니다. 무대 곁에 스레드 (화살촉) 완전히 retrac되지 않도록 위치 코를 개최하는 것입니다<html> 테드. 그렇지 않으면 그것은 SOG의 더 많은 복부 부분을 방해하고 운동 아티팩트를 일으킬 것이다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> 4 그림. 해부 플라이와 함께 파리 최고의 전망.이 이미지는 파리 다음과 표피 제거의 노출된 SOG를 보여줍니다. 식도, 근육 16 tracheae는 두뇌에 연결뿐만 아니라, 선택된 공기 자루는 또한 칼슘 신호의 유물로 이어질 수있는 두뇌를 방해 못하도록 방지하기 위해 제거되었습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> 그림 5. 감시 장치가.이 장치는 회전 디스크 공촛점 현미경 시스템 (Improvision)에 연결된 올림푸스 BX51WI 현미경에서 조립, 그리고 니콘 SMZ800 현미경 측면 - 마운트됩니다. 이 설정은 동작 인당 동안 뇌 활동의 라이브 영상을 허용합니다. 6 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; 6 그림. 파리의 측면 뷰를 게재할 사진은. 생리 식염수의 얇은 계층은 40X 물에 침지 렌즈와 플라이 사이에 끼워 넣었지있다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> 그림 7. Washi 종이 심지를 만들기위한 설계도. Gampi - Washi 종이는 (Haibara, 일본) 매우 얇고 매끄러운입니다 일본 전통 양피입니다. 그것은 또한 매우 강한 액체의 다량을 유지하실 수 있습니다. Washi 용지는 매우 구체적인 치수와 사다리꼴로 절단되어야하며 0.3 mm 및 0.7 mm 폭 및 길이 4-5밀리미터합니다 (). 이 사다리꼴 그때 23 G의 피하 바늘 끝으로 0.7 밀리미터 측면에서 삽입하며 V 자형 (B)에 굽습니다 곤충 핀의 삽입을 통해 안정 수 있습니다. C가, Washi 종이가된다 투명 다음 노출액체로,이 실험에 이상적입니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> 그림 8. Washi-심지가있는 파리에 코의 자극은. 피하 주사 바늘의 일각에 Washi 종이 심지는 한 손으로 조이스틱 조작하는 사람을 사용하여 인스턴트에 대해 적용됩니다. 바늘은 자당 솔루션을 aspirating 및 배출을 위해, 다른 한편으로 조작 주입기에 유연한 튜브를 통하여 연결되어 있습니다. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> 9 그림. 대표 결과입니다. 는 행위 당 stereomicroscope에 설치된 CCD 카메라를 통해 기록했습니다. 자극에 자극을하기 전에 확장 코 (화살표)와 100 밀리미터 자당의 수성 솔루션 (화살촉)를 포함하는 심지와 자극 후 굶주린 파리의 정면 전망이 있습니다. 조명이 사용 491 nm의 레이저에 의해 수행됩니다GCaMP 형광. B를 위해, 굶주린 상태에서 연단 근육의 분도기를위한 모터 신경 세포의 GCaMP 3.0 응답 자당 유발. 자극 전에 상단 패널, 하단 패널, 즉시 자극 후. 스케일 바, 10 μm의. C, 자당 유발 GCaMP 3.0 응답의 부량. 모터 뉴런은베이스 라인에 몇 초 정도의 복원 단계 다음에 형광의 급격한 증가에 의해 자당의 자극에 응답합니다.

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</ol>

<p class="jove_content"&gt; 저는 공개할 게 없다.</p

파리 칼슘 2 + 신호와 PER 행동의 동시 녹음을 허용합니다. 비록 함께 식염수 정상 인당 행동에 노출되어 머리가 관찰되었다. 대신 원래 모세관 method7에서 사용 Kimwipe의 심지의 Gampi-Washi의 심지를 사용하여 높은 재현성과 안정 인당 행동을 용이하게하고 만들고 좋은 Kimwipe의 심지를 선택하는데 숙련된 될 필요성을 방지합니다. 실험 조언은 우리가 성공적으로 칼슘 2의 매우 안정적인 녹음으로 이어지는, 코의 움직임에 의해 교란을 피하기 위해 + 신호를 저소음으로 사용할 위에서 언급한. 때로는 조직 제거 가난한 결과로 이어지는, 세포를 노출하거나 적절하게 운동을 억제하기에 충분 아니었어요. 그러나 일단 우리가 숙련된 있었 준비를 80 % 이상 좋은 결과를 생산했다. 이 방법론은 칼슘 2 + 이미징을위한뿐만 아니라하지만, 행동에 따라 관찰하면서 또한 실시간 영상으로 적응 수 있습니다. 예를 들어, 우리를 통해 세포에 액세스할 수 있습니다직접 활동을 기록하는 전극을 사용하지 않습니다. 두 광자 여기 현미경과 결합하여, 우리의 행동 변화에 관한 수 시냅스 구조의 저속 이미징을 수행할 수 있습니다. 따라서, 행동 관찰을 통한 두뇌 이미징이 방법의 연결 네트워크의 기능적 해부에 대한 가치뿐만 아니라,하지만 메모리의 배후 메커니즘에 시냅스 소성의 14 연관시키는 강력한 도구로 사용될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비 / 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar vivadent </td><td> M04115 </td><td> 광 경화 접착제 </td></tr><tr><td> BX51WI 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> BX51WI </td><td> 40X (NA 0.8) 물 침지 객관적인 렌즈로 </td></tr><tr><td> 디스크 공촛점 현미경 시스템을 스피닝 </td><td> PerkinElmer에서 Improvision </td><td></td><td> 491 nm의 레이저로 </td></tr><tr><td> Stereomicroscope </td><td> 니콘 </td><td> SMZ-800 </td><td> 스윙 암에 첨부. 스테레오보기는 아직 비디오 녹화 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Gampi-Washi 종이 </td><td> Haibara, 일본 </td><td></td><td> 일본의 전통 종이의 특별한 종류 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> 이미징 소스 </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1 / 2 &quot;1080 × 960 픽셀 SONY CCD </td></tr><tr><td> 조이스틱 조작하는 사람 </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 drosophila melanogaster</em

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

행동에서의 기능의 측면에서 네트워크의 연결을 공부하기 위해, 우리는 각각의 행동 패턴이 생성되면 뉴런이 작동 방법을 분석한다. 따라서,의 연결 활동 및 행동의 동시 녹음 행동 두뇌 활동을 연관시키는 것은 필수적입니다. 그러한 행동 분석은 과일 파리, Drosophila melanogaster, 우리 같은 GCaMP 1 등 유전자 인코딩 칼슘 지표를 통합할의 연결 활동을 모니터링하고, 특히 뉴런 2-5 확인된 활성화 optogenetic 또는 thermogenetic 기법에 대한 정교한 유전자 조작을 사용할 수 있습니다. thermogenetic 기법의 사용은 먹이 행동에 중요한 뉴런 (홍수 외., 개정 이하)을 찾기 위해 우리를 이끌었습니다. 의 코 또는 tarsi의 감각 세포에서 달콤한 자극에 반응; 동작을 먹이의 주요 부분으로 Drosophila 성인 6 (사람마다 코 확장 응답)를 먹일 때 그 코를 확장합니다. 공동행동 관찰과 동시에, suboesophageal 신경절 (SOG) - GCaMP3.0 1을 사용 칼슘 이미징 기법 8, 9와 7 작자에 대한 프로토콜을 mbining, 난 우리가 먹이 센터에서 뉴런의 활동을 모니터할 수있는 실험적인 시스템을 설립 코니다. 뇌의가 물 침지 렌즈를 통해 + 이미징 칼슘 2 목욕에 노출되는 동안의 코 자유롭게 이동할 수 있도록 Drosophila 성인을 수용할 수 있도록 : 나는 장치를 ( &quot;파리&quot; &quot;플라이 두뇌 라이브 이미징 및 전기 생리학 스테이지&quot;) 설계했습니다 . 파리 또한 electrophysiological 녹음이나 시냅스 형태의 저속 이미징과 같은 플라이 두뇌에 게재 실험의 여러 유형에 적합합니다. 라이브 이미징의 결과가 직접적으로 동시 인당 동작과 상호 수 있으므로,이 방법론의 연결 네트워크의 정보 처리를 공부하기위한 좋은 실험적인 시스템을 제공하고, 어떻게 사용자 수ellular 활동은 플라스틱 프로세스 및 메모리에 결합됩니다.

과일 파리,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;의 코 또는 족근에서 설탕 자극에 반응, 먹일의 코를 확장합니다. 난 우리가 행동 관찰과 함께 동시에, 두뇌의 뉴런의 활동을 감시할 수 있도록 칼슘 이미징 기술을 코 확장 반응 (당)의 관찰을 결합했습니다.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

행동에서의 기능적 측면에서 신경망을 연구하기 위해서는, 각 행동 패턴이 생성될 때 뉴런이 어떻게 작동하는지를 분석해야 합니다. 따라서...

이 절차의 전반적인 목적은 섭식 행동 관찰과 동시에 칼슘 이미징을 통해 뉴런의 활동을 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 초파리를 초파리 고정 장치에 삽입함으로써 수행됩니다. 그다음, 뇌를 노출시키기 위해 초파리의 머리를 해부합니다.해부된 초파리가 고정된 장치를 현미경 스테이지 위에 배치합니다. 실험 절차의 마지막 단계는 설탕 심지를 이용해 pro-proboscis를 자극하는 것입니다. 최종적으로, 행동 비디오 녹화를 통한 proboscis 신장과 상관관계가 있는 칼슘 이미징을 통해 특정 뉴런의 활성화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.저는 수면 위를 헤엄치는 비팅 비어(beating beers)의 눈을 보고 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 비어는 갈라진 눈을 가지고 있어 수면 위와 아래를 동시에 볼 수 있습니다. 제 실험에서 까다로운 점은 뇌와 SCU가 서로 가깝다는 것이지만, 비어의 눈처럼 깔끔하게 분리할 수 있다면 뇌가 새틀라이트(satellite)에 노출된 동안에도 SCU를 건조한 상태로 유지할 수 있습니다.건조한 면과 습한 구역을 분리하기 위해 SCU 바로 위에 매우 단순한 격벽을 만들었습니다. 35 mm 팔콘 디쉬 뚜껑의 측벽을 녹이고 적절한 각도와 두께로 깎아 플랫폼 형태를 잡습니다. 파리 머리가 들어갈 수 있도록 플랫폼에 구멍을 뚫어, 입 부분이 챔버 외부로 자유롭게 노출되게 합니다. 파리의 몸체가 들어갈 수 있을 만큼의 너비로 피펫 팁의 끝부분을 자른 후, 이 팁을 플랫폼에 접착제로 고정합니다.성체 초파리를 25 °C에서 24시간 동안 기아 상태로 둡니다. 핀셋을 사용하여 초파리를 얼음 위에 세운 15 mL 플라스틱 튜브에 넣어 마취시킵니다. 초파리를 챔버에 넣고, 움직일 수 없을 때까지 부드럽게 밀어 넣습니다.속눈썹 족집게나 유사한 도구를 사용하여 접착제를 조심스럽게 펴 바르면서, 광경화성 접착제를 소량 도포하여 근위부 주둥이 또는 rostrum의 주변부를 구멍의 내측 가장자리에 밀봉합니다. 또한, 파리 내부에서 머리의 등쪽 부분과 구멍의 내측 가장자리 사이의 공간에 접착제를 도포합니다. 마지막으로, 파리에 손상을 주지 않도록 경화에 충분한 가장 약한 강도의 청색광을 조사하여 접착제를 경화시킵니다.초파리의 머리를 고정하고 SOG의 복측 부위를 노출시키기 위해, 실을 연결하여 주둥이가 부분적으로 들려 있게 유지합니다. 초파리가 적절히 배치되면, 플랫폼 표면을 sucrose-free saline으로 채웁니다. 텅스텐 블레이드와 끝을 날카롭게 만든 핀셋(sharpened forceps)을 사용하여 머리 캡슐을 열어 SOG를 노출시킵니다.Scis zips. 이것은 비교를 위해 Kim wipe에서 섬유 한 가닥을 절단하는 scis zips의 시연입니다. 먼저 시야 내에서 iris scissors로 수행한 후, 1mm 눈금 자 앞에서 수행합니다.먼저 텅스텐 블레이드를 사용하여 후측 가장자리를 절개합니다. 그런 다음 정밀 핀셋을 사용하여 측면과 전측 가장자리를 절단합니다. 핀셋으로 절단된 큐티클 조각을 들어 올려 제거합니다.포셉을 사용하여 더듬이와 더듬이 신경을 절단합니다. 그런 다음 뇌를 안정시키고 움직임으로 인한 아티팩트를 방지하기 위해 SOG와 큐티클 사이의 기낭을 선택적으로 제거합니다. 다음으로, 인두와 뇌 사이의 연결을 제거하기 위해 인두 쪽 끝부분과 SOG로 들어가는 끝부분의 식도를 절단합니다.그다음 근육 16을 식별하여 끌어낸 후, 뇌와 큐티클을 연결하는 모든 기관을 분리합니다. 초점 회전 디스크 공초점 현미경(spinning disc confocal microscope)의 스테이지 위에 초파리를 놓고, 이미징을 위해 수침 렌즈로 전환합니다. 그런 다음 491 nm 여기 레이저를 사용하여 관심 영역에 초점을 맞추고, 노출 시간 122 ms, 4 Hz의 속도로 단일 광학 절편을 촬영합니다.초파리에게 설탕물을 제공하기 위해 팁 부분에 일본어지(Japanese paper) 심지가 작게 돌출된 주사바늘을 사용하십시오. 심지에 설탕물 용액을 소량 떨어뜨린 다음, 조이스틱 조작기로 바늘을 고정한 상태에서 유연한 튜브를 통해 바늘과 연결된 인젝터로 용액을 흡입하십시오.적신 거름종이 심지를 프로브 팁에 아주 잠시만 접촉시키십시오. 이는 포화를 방지하기 위함입니다. 칼슘 이미징과 동시에 해부 현미경에 부착된 CCD 카메라를 사용하여 PROBUS 신장 반응 또는 PER 행동을 모니터링하고, 반드시 해부 후 1시간 이내에 데이터를 수집하십시오.여기에 100 millimolar sucrose가 포함된 WIC 자극에 대한 전형적인 prob Bois 신장 반응이 나타나 있습니다. G CAMP 형광 측정을 위해 491 nanometer 레이저를 사용하여 수용액 상태를 이미지화했습니다. proba 신장 반응 행동 동안 동시에 수행된 칼슘 이미징을 통해, 자극 전후로 rostrum 견인근의 운동 뉴런에서 sucrose에 의해 유도된 GAMP 3.0 반응을 시각화할 수 있습니다.상태 정량화의 시작 단계에서 sucrose로 유도된 GAMP 3.0 반응을 살펴보면, 운동 뉴런이 sucrose 자극에 대해 형광 강도의 급격한 증가로 반응한 후, 수 초 동안 기저선으로 회복되는 단계가 나타남을 알 수 있습니다. 이 플랫폼의 초파리를 이용하면 전기생리학, 광유전학, 심리유전학, 또는 화학적 뉴런 활성화와 같은 다른 방법들이 가능하며, GFP로 표지된 구조의 타임랩스 랩 이미징을 통해 시냅스 가소성과 기억 사이의 상관관계와 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 초파리 뉴런의 생체 내 칼슘 이미징을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 후각 조절 실험 중 버섯체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

이 비디오는 유전적으로 암호화된 형광 리포터 단백질을 사용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 개별 뉴런에서 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. 이 연구는 기생충의 움직임을 이미징하고 뉴런에서 리포터 형광 비율을 측정하여 세포 내 칼슘 수치를 알을 낳는 동안 뉴런 활동 및 행동 변화와 상관시키는 단계를 간략하게 설명합니다.

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)

이 비디오는 파리에서 시냅스적으로 국소화된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징 방법을 보여줍니다. 현미경 검사를 위해 파리를 준비하고, 후각 조절을 수행하고, 냄새로 인한 칼슘 유입을 시각화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

두 개의 서로 다른 뇌 neuropiles 또는 두 개의 서로 다른 해부학 책자에서 동시 세포 장기 기록은 꿀벌에 설립되었다. 이 기록은 다른 뇌 영역 하나의 신경 세포에서뿐만 아니라 행동 동물의 앙상블 수준에서 신경 세포의 처리 시간 측면의 조사를 할 수 있습니다.

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

초파리의 앞다리와 주둥이는 미각 감각 뉴런의 풍부한 레퍼토리를 포함하고 있습니다. 여기에서는 칼슘 이미징을 사용하여 미각 페로몬의 외인성 적용 시 살아있는 파리의 앞다리와 주둥이에 있는 감각 뉴런의 생리적 반응을 측정하는 방법을 제시합니다.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

학습하세요 Drosophila melanogaster의 먹이 행동 중 칼슘 이미징을 이용한 뉴런 활성 동시 모니터링 방법을. 이 기술은 신경 과학 연구자들이 섭취 반응의 신경 메커니즘을 실시간으로 시각화하고 분석하는 데 활용됩니다.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster

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