확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster

이 절차의 전반적인 목표는 섭식 행동의 관찰과 동시에 칼슘 이미징을 통해 신경 세포 활동을 모니터링하는 것입니다. 이것은 먼저 파리 장치에 파리를 삽입함으로써 수행됩니다. 다음으로, 파리의 머리를 해부하여 뇌를 드러냅니다.

그런 다음 절개된 파리가 있는 파리의 장치를 현미경 스테이지에 배치합니다. 절차의 마지막 단계는 설탕 심지로 프로 부아를 자극하는 것입니다. 궁극적으로, 행동의 비디오 녹화를 통한 Probus 확장과 상관관계가 있는 칼슘 이미징을 통해 식별된 뉴런의 활성화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법에 대한 아이디어는 물 표면에서 헤엄치는 맥주를 치는 눈을 생각했을 때 처음 떠올랐습니다. 우리 맥주는 눈이 갈라져 물 표면의 위와 아래를 모두 볼 수 있습니다. 내 실험의 까다로운 점은 뇌와 SCU가 서로 가까이 있지만, 우리 맥주의 눈처럼 잘 분리되어 있다면 뇌가 위성에 노출되어 있는 동안 SCU를 건조하게 유지할 수 있다는 것이다.

이것은 SCU 바로 위에 매우 간단한 칸막이를 만들어 마른 면과 너비 위치를 분리하고, 측벽을 녹이고 조각하여 적절한 각도와 두께를 형성하여 35mm 팔콘 접시의 뚜껑에서 플랫폼을 형성합니다. 입 부분이 챔버 외부에 자유롭게 노출되도록 플라이 헤드를 수용하기 위해 플랫폼에 구멍을 뚫습니다. 피펫 맨 팁의 끝을 파리의 몸체를 수용할 수 있을 만큼만 넓게 자른 다음 팁을 플랫폼에 붙입니다.

성인은 굶어 죽은 후 섭씨 25도에서 24시간 동안 비행합니다. 파리를 15ml 플라스틱 튜브에 넣고 집게를 사용하여 얼음 위에 서서 파리를 마취합니다. 파리의 방에 파리를 삽입하고 파리가 움직일 수 없을 때까지 파리를 부드럽게 밀어 넣습니다.

속눈썹이나 이와 유사한 도구를 사용하여 접착제를 조심스럽게 펴 바르고 측면과 연단 위에 소량의 광경화 접착제를 바르고 근위 또는 연단의 주변 부분을 구멍의 내부 가장자리에 밀봉합니다. 또한 파리 안쪽의 접착제를 머리의 등쪽 부분과 구멍의 안쪽 가장자리 사이의 공간까지 바르십시오. 마지막으로, 파리가 손상되지 않도록 경화하기에 충분한 청색광의 가장 약한 조명으로 접착제를 경화합니다.

파리의 머리를 안정시키고 SOG의 복부 부분을 노출시키려면 연단을 부분적으로 들어 올릴 수 있는 실을 연결합니다. 파리가 제자리에 있으면 플랫폼 표면을 자당이 없는 식염수로 채웁니다. 헤드 캡슐을 열어 텅스텐 날과 날카로운 집게라고 하는 날카로운 팁이 있는 집게를 사용하여 SOG를 노출시킵니다.

가위 지퍼. 이것은 비교를 위해 Kim 물티슈에서 섬유를 자르는 scis zips의 시연입니다. 이것은 먼저 시야에서 홍채 가위로 수행 한 다음 1mm 눈금자 앞에서 수행됩니다.

먼저 텅스텐 칼날을 사용하여 뒤쪽 가장자리를 절개합니다. 그런 다음 날카로운 집게를 사용하여 측면과 앞쪽 가장자리를 자릅니다. 자른 큐티클 부분을 집게로 들어 올려 제거합니다.

집게를 사용하여 더듬이와 안테나 신경을 자릅니다. 그런 다음 SOG와 큐티클 사이의 공기 주머니를 선택적으로 제거하여 뇌를 안정시키고 운동 아티팩트를 방지합니다. 다음으로, 식도의 끝 부분을 인두 쪽으로 자르고 끝 부분을 SOG로 잘라 인두와 뇌 사이의 연결을 제거합니다.

그런 다음 근육 16을 확인하고 꺼낸 후 뇌와 큐티클을 연결하는 모든 기관을 분리하십시오. 회전하는 디스크 컨포칼 현미경의 스테이지에 파리를 놓고 이미징을 위해 수침 렌즈로 전환합니다. 그런 다음 관심 영역에 초점을 맞춘 491나노미터 여기 레이저를 사용하여 122밀리초의 노출 시간으로 4헤르츠에서 단일 광학 단면을 취합니다.

작은 일본어 심지가 있는 주사기 바늘을 사용합니다. 그녀는 파리에게 자당을 제공하기 위해 끝에서 튀어나온 종이였습니까? 자당 용액을 심지에 소량 떨어뜨린 다음 조이스틱 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 잡고 유연한 튜브를 통해 바늘에 연결된 인젝터로 흡입합니다.

물에 적신 종이 심지를 프로스 끝에 바르되 잠시 동안만 바르십시오. 포만감을 피하기 위해. 칼슘 이미징과 동시에 해부 현미경에 부착된 CCD 카메라를 사용하여 PROBUS 확장 반응 또는 PER 동작을 모니터링하고 해부 후 1시간 이내에 데이터를 수집해야 합니다.

여기에 표시된 것은 100 밀리몰 자당을 함유한 WIC를 사용한 자극에 대한 일반적인 prob Bois 확장 반응입니다. G CAMP 형광을 위해 491 나노미터 레이저를 사용하여 이미지화한 수용액. 자극 전과 후에 먼저 여기에 표시된 프로사 확장 반응 행동 중 동시 칼슘 이미징을 통해 연단근의 각도기에 대한 운동 뉴런에서 자당 유도 GAMP 3.0 반응을 시각화할 수 있습니다.

자당에 의해 유도된 GAMP 3.0 반응의 상태 정량화에서 운동 뉴런은 형광의 급격한 증가에 의해 자당 자극에 반응한 후 기준선까지 몇 초의 복원 단계가 뒤따른다는 것을 보여줍니다. 플랫폼 파리는 시냅스 가소성과 기억 사이의 상관 관계와 같은 추가 질문에 답하기 위해 전기 생리학, 광유전학 또는 정신 유전학, 뉴런에 대한 화학적 활성화 또는 GFP 표지 구조의 TimeLapse 실험실 이미징과 같은 다른 방법을 허용합니다.