Summary
Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.
Abstract
Virus infecties na stamceltransplantatie behoren tot de meest voorkomende oorzaken van sterfte, vooral na navelstrengbloed (CB) transplantatie (CBT), waar de CB bevat geen aanzienlijke aantallen van virus-ervaren T-cellen die de ontvanger kan beschermen tegen infectie 1. - 4 Wij en anderen hebben aangetoond dat virus-specifieke CTL gegenereerd uit seropositieve donoren en toegediend aan de ontvanger veilig en beschermend. 5-8 Tot voor kort, virus-specifieke T-cellen niet kunnen worden gegenereerd uit navelstrengbloed, waarschijnlijk door de Aangezien virus-specifieke geheugen T-cellen.
In een poging om beter na te bootsen in vivo priming omstandigheden van naïeve T-cellen hebben we een methode die gebruikt CB-afgeleide dendritische cellen (DC) getransduceerd met een adenovirale vector (Ad5f35pp65) met de immunodominante CMV pp65 antigen dus een T celspecificiteit in de richting van CMV en adenovirus. 9 Bij initiatie, gebruiken we deze mareerde DCs als CB-afgeleide T-cellen in aanwezigheid van de cytokinen IL-7, IL-12 en IL-15. 10 Op de tweede stimulatie we EBV-getransformeerde B-cellen of EBV-LCL, die zowel uitdrukken latente en lytische EBV-antigenen. Ad5f35pp65-getransduceerde EBV-LCL worden gebruikt om de T cellen te stimuleren in aanwezigheid van IL-15 bij de tweede stimulatie. Volgende stimulaties gebruik Ad5f35pp65 getransduceerde EBV-LCL en IL-2.
Van 50x10 6 CB mononucleaire cellen kunnen wij ruim 150 x 10 6 virus-specifieke T-cellen die antigen-gepulseerde doelen en afgifte cytokines lyseren in reactie op antigene stimulatie genereren. 11 Deze cellen werden in een GMP-compatibele wijze met alleen de 20% fractie van een gefractioneerde navelstrengbloed en zijn vertaald voor klinisch gebruik.
Protocol
1. Mononucleaire cellen Isolatie (dag 0)
- Plaats spike van vrouwelijke luer adapter in uitlaatpoort van de 20% fractie van de navelstrengbloed, sluit spuit en verwijder bloed. Overdracht ontdooid bloed 20 ml verwarmd RPMI in 50 ml centrifugebuis. Spoel navelstrengbloed zakje met 5 ml RPMI en transfer naar dezelfde centrifugebuis.
- Centrifugeer cellen gedurende 10 minuten bij 400 x g. Aspireren supernatant.
- Resuspendeer cellen in 20 ml warm RPMI. Laag cellen op 15 ml Lymphoprep in 50 ml centrifugebuis. Centrifugeer 40 minuten bij 400 x g.
- Oogst de interface met de mononucleaire cellen en was in 20 ml RPMI. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 450 x g.
- Aspireren supernatant en was in 20 ml RPMI. Tel cellen en draaien gedurende 5 minuten bij 400 x g.
- Aspireren supernatant en resuspendeer cellen bij 5 x 10 6 mononucleaire cellen / ml Cellgenix DC media (serumvrij). Verwijder 1 mL voor EBV-LCL generatie en in 15 ml centrifuge buis.
2. Dendritische Cel Generation (beginnend op dag 0)
- Plaat 2 ml cellen (reeds bij 5 x 10 6 cellen / ml media DC) per putje in een 6-well plaat. Laat in de broedstoof gedurende 1-2 uur.
- Na 1-2 uur, wassen van de niet-hechtende cellen door wassen 3-4 keer met PBS. Verzamel de niet-hechtende cellen en bevriezen. Voeg 2 ml / putje DC media met 1000 U / ml IL-4 en 800 U / ml GM-CSF.
- 3-4 dagen na aanvang DC, vul de IL-4 en GM-CSF door toevoeging van 100 ul / putje van media met een eindconcentratie van 1000U/mL IL-4 en 800 U / ml GM-CSF.
- Op dag 5-6, oogst de DC door schrapen de put met een transfer pipet. Tel de grote cellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. Aspiraat media en resuspendeer DC op 2x10 6 cellen / ml DC media. 0,5 ml / putje van een plaat met 24 putjes.
- Transduceren de DC met de Ad5f35pp65 vector bij een MOI van 10 per cel infectieuze eenheden. Voeg vector aan elk putje in een 24-well plaat. Incubeer cellen gedurende 1,5 uur. Na 1,5 uur voeg 1,5 ml / putje DC media bevattende: 1000 U / ml IL-4, 800 U / ml GM-CSF, 10 ng / ml TNF-alfa, 1 ug / ml PGE-1, 100 ng / mL IL-6 en 10 ng / mL IL-1beta. Deze cytokines rijpen de DC's.
3. Genereren van EBV-LCL (op dag 0)
- Centrifugeer de buis met het 5 x 10 6 mononucleaire cellen. Voeg 200 ul geconcentreerd EBV B95.8 supernatant en 1,8 ml compleet medium (RPMI + 10% FBS + 2 mM L-glutamine) bevattende cyclosporine (1 ug / ml).
- Aliquot 100 ui cellen in 10 putjes van een 96-wells plaat en 200 pl in 5 putjes. Voeg 100 ui compleet medium + cyclosporine de putjes die slechts 100 ul cellen. Vul overige wells met steriel water.
- Voer de LCL wekelijks en uit te breiden van een 96-wells plaat met een 24-well plaat na ~ 2 weken. Na een week, naar een T25 fles en in de daaropvolgende overdracht naar weekeen T75 kolf. In dit stadium is het aanbevolen dat je porties van LCL bevriezen. Het duurt meestal 1 maand tot het genereren van voldoende aantallen LCL.
4. CTL Initiation - 7 dagen na aanvang van DCs
- Oogst DCs en bestralen bij 30 Gy. Was 4 x en tellen. Resuspendeer DC in T cell media humaan serum (45% RPMI, 45% CLICK's, 10% menselijk serum, 2 mM L-glutamine) @ 1 x 10 5 DC / mL.
- Ontdooien niet-hechtende cellen van stap 2.2. Was de cellen, en tellen. Resuspendeer bij 2 x 10 6 niet-hechtende cellen / ml in T cel media die humaan serum. Voeg 10 ng / mL IL-7 en IL-12, en 5 ng / mL IL-15. Voeg 1 ml cellen per putje in een 24-well plaat. Voeg 1 ml per well DC. Vul lege putten van 24-well plaat met steriel water.
- 7 dagen na T cel initiatie, voeding en / of splitsing van de cellen met T-cel medium dat menselijk serum.
- 9-12 dagen na T-cel initiatie, bevriezing van de T-cellen tot de LCL klaar zijn.
- ONCE LCL zijn uitgebreid en worden gepasseerd in T75 flessen, transduceren de LCL door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 400 x g. Voeg de vector aan de celpellet bij een MOI van 100 infectieuze eenheden per cel. Incubeer gedurende 1,5 uur. Na 1,5 uur, resuspendeer in compleet medium met 5 x 10 5 LCL / ml en voeg 2 ml per well in een 24-well plaat 12.
- Na 2 dagen, de oogst van het LCL en bestralen bij 40 Gy. Was 4 x en tellen. Resuspendeer de LCL in T cell media humaan serum van 2,5 x 10 5 cellen / ml. Voeg 1 ml LCL per putje van een plaat met 24 putjes. Ook voeg 5 x 10 6 LCL een Grex40 cultuur apparaat en 5 ng / mL IL-15 13.
- Oogst de T-cellen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 xg, zuig de supernatant en resuspendeer in T cell media humaan serum bij 1 x 10 6 T cellen / ml. Voeg 5 ng / ml IL-15 en voeg 1 ml / putje van T-cellen (totaal 1 x 10 6 cellen T) aan de LCL die reeds in de 24-well plaat. In de Grex40, brengde totale media tot 30 ml.
- Op dag 3-4 na stimulatie, wanneer de cellen confluent vervolgens splitsen (in de plaat) 1:1 door vers medium dat 50 U / ml IL-2. Als ze niet confluent dan gewoon zuigen ½ media en vervangen door medium dat 50 U / ml IL-2. In de Grex40, zuigen helft van het medium vervangen met vers medium en voeg 50 U / ml IL-2.
- Op dag 7, herhaalt in stap 4.6, maar met IL-2 op de dag van de stimulatie niet IL-15.
5. Representatieve resultaten
Een schema van de GMP-compliant FDA goedgekeurde productie protocol is weergegeven in figuur 1. Het proces duurt ongeveer 50 dagen. Typische methoden voor het opwekken virus-specifieke T-cellen vergroten bestaande geheugen T-cellen, maar navelstrengbloed mist virus-ervaren T-cellen en daarom moeten prime naïeve T-cellen. Hiervoor gebruiken we dendritische cellen en de cytokines IL-7, IL-12 en IL-15,nodig voor het genereren van virale specificiteit.
Na 3 stimulaties, moet de opbrengst meer dan 100x10 6 cellen. Als er voldoende cellen zijn niet beschikbaar zijn, kunnen extra stimulaties worden uitgevoerd totdat het gewenste aantal CTL's zijn beschikbaar. De meerderheid van deze cellen moeten CD3 + met een mengsel van CD4 + en CD8 + T cellen. Er moet minder dan 15% NK cellen (CD3-/CD56 +) en minder dan 1% CD19 + B-cellen (figuur 2).
De geëxpandeerde CTL herkent de antigen pp65 van CMV, hexon en penton van adenovirus, evenals talrijke EBV-antigenen die tot expressie komen op EBV-LCL. Wanneer getest in een ELISPOT assay, CTL zouden afscheiden meer IFN-? in antwoord op deze antigenen dan irrelevante antigenen (figuur 3).
De CTL ook lyseren virale peptide gepulste doelwitten PHA ontploffing. In een 51Cr-afgifte assay moet CTL lysis LCL, CMVpp65-gepulseerde en Adenovirus-en /of penton-gepulseerde doelen maar niet doelstellingen gepulseerd met irrelevant peptiden (Figuur 4).
Figuur 1. Generatie multi-virus-specifieke CTL uit navelstrengbloed. Schematische weergave het gehele proces van CTL vervaardiging uit navelstrengbloed. Eerst het navelstrengbloed mononucleaire cellen worden geïsoleerd uit de 20% fractie van de gefractioneerde navelstrengbloed unit. Met uitzondering van 5x10 6 cellen die opgeslagen worden voor LCL generatie, alle cellen vervolgens uitgeplaat in dendritische cel media gedurende 1-2 uur, waarna de niet-hechtende cellen worden geoogst en ingevroren. De DC DC Vervolgens wordt aan media die IL-4 en GM-CSF. Na 5 dagen kweken worden de DC gerijpt en getransduceerd met een adenovirale vector die het immunodominante CMV pp65 antigen. Bij aanvang worden deze DC gecombineerd met de niet-hechtende cellen en de cytokines IL-7, IL-12,en IL-15. Bij daaropvolgende stimuleringen wordt dezelfde adenovirale vector die voor EBV-LCL, die worden gebruikt als antigeen presenterende cellen te transduceren. IL-15 wordt gebruikt bij de tweede stimulatie en daarna IL-2.
Figuur 2. Fenotype van de resulterende T-cellen. Getoond wordt het percentage levende cellen in de lymfocytpoort. CTL zijn CD3 + en CD4 + of CD8 + maar grotendeels CD3-/CD56- en CD19-.
Figuur 3. T-cel functie. T-cel specificiteit werd getest door IFN-γELISPOT. T-cellen werden gepulseerd met overlappende peptiden die de gehele eiwit van hexon, penton, pp65 en irrelevant antigen IE-1. CTL alleen staat voor media die alleen. Autologe LCL werden bestraald en toegevoegd aan 1x10 5 / goed. Afgebeeld is de gemiddelde plek die cel cedrag van drievoudige putjes.
Figuur 4. Cytolytische activiteit van CTL. Het vermogen van de resulterende CTL om doelen expressie virale antigenen lyseren werd getest in een 51Cr assay. 51Cr-gelabelde autologe PHA ontploffing werden gepulseerd met overlappende peptiden die de gehele antigen of 51 Cr-gemerkte autologe LCL werden gekweekt samen met CTL. Na 4 uur werd gamma release geteld op een gammateller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Huidige strategieën gericht op de beheersing virale infecties na CBT kan effectief zijn, maar ze geassocieerd met significante toxiciteit, zijn duur en niet verlenen langdurende bescherming tegen infectie later. In feite kan het gebruik van een aantal antivirale middelen beperkt de groei van virus-specifieke T-cellen die anders beschermende 14. Een andere mogelijkheid is de infusie van donor afgeleide virus-specifieke T cellen. Wij en anderen hebben aangetoond dat T cellen Hier veilige, effectieve en rendabele. 15-17, tonen we dat deze benadering ook kan worden uitgebreid tot navelstrengbloed.
Het is noodzakelijk om te gebruiken aseptische techniek bij het kweken van menselijke primaire cellen. Vanwege de aard van de naïeve T-cellen, is het ook belangrijk dat menselijke serum wordt gebruikt in alle media waarvoor serum. In onze ervaring, zal FBS-bevattende producten leiden tot een enorme uitbreiding van T-cellen gericht eiwitten afkomstig van FBS.
ve_content "> Wanneer isoleren mononucleaire cellen met de Ficoll-gradiënt, is het vaak moeilijk om rode bloedcellen uitsluiten omdat veel gekiemd en niet gelyseerd door red cell lysis buffer. Als het aantal rode bloedcellen is overdreven, kan het product opnieuw worden -ficolled.Terwijl de methode hier is beperkt tot de expansie van virus-specifieke T-cellen, namelijk CMV, EBV en adenovirus-is voor het genereren van andere antigeen-specifieke T-cellen uit navelstrengbloed ook. Het gebruik van dendritische cellen en de bovenstaande cytokine cocktail is een krachtige stimulator van naïeve T-cellen en te rijden uitbreiding van antigeen-specifieke CTL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Dan L. Duncan collaboratief onderzoek subsidie (CMB en EJS), het National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), een leukemie en lymfoom Society Clinical Research Scholar Award (CMB), en het National Cancer Institute (RO1 CA06150816; EJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | ||
| IL-12 | National Cancer Institute | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1beta | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-alpha | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | ||
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
- Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
- Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
- Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
- Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
- Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
- Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
- O'Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
- Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
- Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
- Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
- Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
- Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
- Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
- Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
- Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
- Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
- Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).
