Summary
Le proiezioni stereotipata di afferenze sensoriali nel midollo spinale di roditori offrire un sistema facilmente accessibile sperimentale per studiare ramificazione degli assoni attraverso il tracciamento degli assoni singolo.
Abstract
Qui vi presentiamo una tecnica per etichettare le traiettorie di piccoli gruppi di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale dalla colorazione diffusivo utilizzando il tracciante lipofilo 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . Il confronto di percorsi assonale di wild-type con quelli di topi in cui sono mutati i geni consente di testare per un ruolo funzionale delle proteine candidato nel controllo della ramificazione degli assoni che è un meccanismo essenziale per il cablaggio del sistema nervoso. Assonale ramificazione permette ad un singolo neurone per connettersi con bersagli multipli, fornendo così le basi fisiche per l'elaborazione parallela di informazioni. Ramificazioni in regioni obiettivo intermedio di crescita assonale può essere distinto da arborizzazione terminale. Inoltre, diverse modalità di formazione ramo assonale possono essere classificati a seconda che i risultati ramificazione delle attività del cono di crescita (splitting o reggiseno in ritardonching) o lo sbocciare di collaterali dal pozzo assone in un processo chiamato interstiziale ramificazione 2 (Fig. 1).
Le proiezioni centrali dei neuroni dal DRG offrire un utile sistema sperimentale per studiare entrambi i tipi di ramificazione assonale: quando i loro assoni afferenti raggiungere la dorsale zona di ingresso principale (DREZ) del midollo spinale embrionale tra i giorni 10-13 (E10 - E13) che visualizzare un modello stereotipato di T-o Y biforcazione. I due assoni figlia risultante quindi procedere in direzione rostrale o caudale, rispettivamente, al margine dorsolaterale del midollo e solo dopo un periodo di attesa collaterali germogliano da queste assoni staminali di penetrare la materia grigia (interstiziale ramificazione) e il progetto di neuroni in specifiche relè lamine del midollo spinale, dove ulteriori arborize (ramificazione terminale) 3. Tracciati DII hanno rivelato coni di crescita nella zona dorsale voce principale del midollo spinale che sembrava essere in process della scissione suggerendo che biforcazione è causata dalla scissione del cono di crescita in sé 4 (Fig. 2), tuttavia, altre opzioni sono state discusse anche 5.
Questo video dimostra come prima di sezionare il midollo spinale dei topi E12.5 lasciare il DRG allegato. A seguito di fissazione degli importi piccolo campione di DII vengono applicati a DRG con aghi di vetro tirato da tubi capillari. Dopo una fase di incubazione, il midollo spinale è montato etichettato come un libro aperto rovesciato preparazione di analizzare i singoli assoni usando la microscopia a fluorescenza.
Protocol
1. Dissezione procedura
Nota: l'uso sperimentale di topi dovrebbe seguire ufficialmente approvato le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
- Prima della preparazione, impostare il microscopio da dissezione e disporre gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione tra cui forbici grandi e piccole, grandi pinza dentata, pinze curve e quattro set di Dumont n.5 dissezione pinze (di cui due con dentro-lucido punte) ( Per i dettagli si veda la tabella di reagenti e attrezzature specifiche). Mettere un foglio di carta da filtro in un 100-mm Sylgard rivestite piastra di Petri. Versare PBS freddo nei pozzetti di una piastra ben 12, un 100-mm Petri e un tubo di 12 ml e lasciare sul ghiaccio. Pipettare 2 ml di tampone di fissaggio (4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4) in ciascun pozzetto di secondo a 12 pozzetti e posto sul ghiaccio.
- Dopo anestesia, il sacrificio della diga a tempo incinta E12.5 (rilevamento di plug vaginale è stato designato come E0.5), posizionare il mousecon il suo lato ventrale fino a tre fogli di carta assorbente e bagnare la zona addominale con etanolo al 70%.
- Aprire la cavità addomino, isolare le corna bilaterale uterina e trasferirli in uno dei piatti da 100 mm con gelida PBS.
- Sotto il controllo microscopico, fare una incisione longitudinale della parete uterina con le piccole, le forbici e tagliare subito via ogni sacco amniotico della placenta.
- Sbucciare via il sacco amniotico da ciascun embrione e tagliare il cordone ombelicale.
- Utilizzando piccole forbici, decapitare gli embrioni e mettere la testa o una parte di essi da parte per l'isolamento di DNA genomico se la genotipizzazione dovrebbe essere richiesto. Successivamente, il trasferimento Torsi nei pozzetti rispettivi del 12-pozzetti con PBS freddo.
- Bagnare la carta da filtro nel piatto Sylgard con qualche goccia di PBS e posizione di un torso embrionale con il suo lato dorsale fino sulla carta. Per una migliore stabilità, raddrizzare la coda e le estremità lontano dal corpo.
- Lavorosotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento di circa 16x, con attenzione pizzicare la pelle di un embrione al di sopra del midollo spinale con due paia di pinze a punta sottile e delicatamente a pezzi. A partire dalla metà, procedere in primo luogo verso la coda e poi ripresa dalla metà verso il lato anteriore.
- Bagnato l'embrione di volta in volta con due o tre gocce di PBS per evitare che si secchi.
- Per evitare che DRG sono strappato fuori dal midollo spinale, quando viene rimosso dall'embrione staccare il DRG e il midollo spinale dalla colonna circostante cartilagineo vertebrale del movimento a scorrimento orizzontale con la lama di una pinza sottile con dentro-lucido punte. A partire dalla metà del lato destro dell'embrione, il lavoro la strada verso la coda e poi alla fine anteriore. In seguito, ripetere la procedura sul lato opposto. Fare attenzione a non strappare il DRG associati.
- Per staccare completamente il midollo spinale allentato dall'embrione, sollevare la sua cervicoAl parte con una pinza sottile ed estrarlo in un unico pezzo verso il suo fine caudale.
- Immergere il midollo spinale isolato con DRG attaccato in un pozzo di 12-pozzetti riempiti con tampone di fissaggio e procedere con la preparazione del midollo spinale da embrioni restanti.
- Fissare midollo spinale almeno due ore sul ghiaccio.
2. DII-etichettatura dei neuroni DRG
- Per ogni midollo spinale di essere etichettati, preparare due aghi di vetro con un estrattore micropipetta. Noi utilizziamo un modello di Sutter P-97 elettrodo estrattore (impostazione di programma: 1 CALORE = 625, VEL = 35, TEMPO = 175, 2 CALORE = 600, VEL = 25, TEMPO = 175, 3 CALORE = 630, VEL =... 30, TEMPO = 150).
- Sotto il controllo microscopico intingere nell'acqua la punta di ogni ago di vetro tre a cinque volte in un (w / v) di soluzione al 5% del DII in etanolo. Evaporazione dell'etanolo crea un sottile strato di cristalli Dii sul ferro.
- Lavorando sotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento di circa 40x, mettere un midollo spinale con la sua vlato entral su una diapositiva. Utilizzando forbici primavera, aprire il cordone sul lato ventrale in tutta la sua lunghezza, tagliando attraverso il fondello per consentire il successivo montaggio della preparazione di un libro aperto rovesciato modalità (vedi sezione C).
- Posizionare il midollo spinale con la parte dorsale su una diapositiva. Poi manualmente il cavo di approccio con il DII coperte punta dell'ago di vetro sotto la visualizzazione microscopica e con attenzione perforare ogni DRG secondo su un lato del midollo spinale. Quasi nessuna traccia di Dii dovrebbe essere visibile nella DRG trafitto per assicurare l'etichettatura di solo un piccolo numero di neuroni. Prendete un secondo ago per l'altro lato del cavo. Mirando solo ogni DRG secondo evita una sovrapposizione di proiezioni etichettati assonale da DRG vicini che potrebbero complicare la differenziazione dei singoli assoni.
- Ritorno il midollo spinale al buffer fissazione e incubare al buio per almeno sei ore a temperatura ambiente o notte a 4 ° C per dare tempo per la tintura di diffuse lungo l'assone all'interno della membrana plasmatica. Lasciare per un periodo di incubazione più lungo (fino a due giorni a 4 ° C) se l'analisi della crescita collaterali nel midollo spinale è voluta.
3. Analisi di montaggio e microscopiche
- A seguito di tintura diffusione, la posizione di una sola corda spinale con il suo lato dorsale verso il basso su un vetrino in una goccia di PBS. Fare attenzione che i DRG collegati siano correttamente orientati lateralmente e non si mescolano. Aspirare il liquido in eccesso e appiattire il cavo in un libro aperto rovesciato modalità con pinze.
- Montare la preparazione su un vetrino da microscopio utilizzando PBS.
- Per evitare l'aumento della colorazione di fondo indesiderati analisi microscopica di fluorescenza etichettati proiezioni assonale deve essere effettuata il giorno del montaggio. Fino ad allora tenere le diapositive al buio a 4 ° C.
4. Rappresentante dei risultati:
Il midollo spinale del mouse riceve afferente projections da 8 coppie di cervicale, 13 paia di toracici, 5 paia di paia lombare e 4 del DRG sacrale per un totale di 60 gangli spinali. Dopo un po 'la formazione di un midollo spinale con la maggior parte DRG ancora attaccato può essere isolato da un embrione in meno di cinque minuti. Questa procedura è adatta per l'isolamento di midollo spinale con DRG attaccato da E11.5 E13.5 a embrioni di topo. Tuttavia, i risultati migliori sono ottenuti da E12.5. Risultati esemplare della procedura di etichettatura descritti qui sono mostrati in Figura 3. L'etichettatura dei DRG su tutta la lunghezza del midollo spinale può quindi essere utilizzato per quantificare il comportamento ramificazione degli assoni a diversi livelli vertebrali (Fig. 4).
Figura 1. Schema raffigurante le due principali modalità di diramazione assonale. (A) Branching dalle attività del cono di crescita che potrebbe portare a una biforcazione - come indicato qui - così come pergole terminale complessi o(B) formazione collaterale all'albero assone (interstiziale ramificazione). Quest'ultima modalità è il tipo dominante ramificazione di proiettare assoni corticali e talamocorticale 6,7.
Figura 2 proiezioni afferenti di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale visualizzare entrambi i tipi di ramificazione assonale:. Ramo assoni prima volta al DREZ di biforcazione (1) e dalla risultante figlia forma rami collaterali dopo un periodo di attesa di interstiziale ramificazione (2).
Figura 3. Visualizzazione di singole traiettorie degli assoni dei neuroni embrionali DRG del mouse. (A) del midollo spinale con DRG allegato preparato da un embrione E12.5 mouse. (Bar Scala, 1 mm.) (BD) viste dorsali di DII marcato DRG di topi wild-type con un ingrandimento maggiore sono mostrati. In B ogni DRG secondo è labeled di DII. Immagini di fluorescenza sono invertite, caudale è a sinistra e in C e D, laterale è in fondo. In C un piccolo numero di assoni è etichettato e ad un maggiore ingrandimento la presenza di T-come i rami possono essere identificati nel DREZ del midollo spinale. (Bar Scala, 250 micron (B), 100 micron (C) e 50 micron (D).)
Figura 4. Quantificazione dei rami a forma di T, singolo turno rostrale o caudale nel wild-type e C-peptide natriuretico di tipo (CNP) topi con deficit a E13.5. Il numero di assoni singolo contati sono riportati tra parentesi per i livelli di tronco diverso per ogni genotipo. C-o-R si trasforma - la crescita solo in direzione caudale e rostrale, rispettivamente.
Figura 5. Un cGMP segnalazione innesca biforcazione sensoriale assone al DREZ del midollo spinale. (A) Schema divia di segnalazione cGMP composto da CNP ligando, il recettore guanylyl ciclasi Npr2 e la serina / treonina chinasi cGKIα nei neuroni DRG embrionale. Npr2 genera cGMP dal GTP su stimolazione da parte di CNP. (B) DII tracciamento degli assoni dei singoli DRG neuroni nei topi wild-type e CNP-carenti. (Bar Scala, 25 micron).
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Discussion
Modelli stereotipati di proiezione che comprende entrambi i tipi di formazione ramo assonale insieme a facilità di preparazione, in combinazione con l'uso di tessuto fissato per Dii etichette rende il midollo spinale embrionale con allegato un modello DRG favorevole per lo studio assonale ramificazione. L'applicazione di piccole quantità di Dii con aghi di vetro rivestito permette - in contrasto con l'etichettatura maggior parte dei DRG - la visualizzazione di piccoli gruppi di neuroni DRG e quindi l'analisi dei singoli assoni e dei loro modelli di diramazione. Il metodo descritto potrebbe essere ulteriormente migliorata mediante iniezione iontoforetica del tracciante lipofilo che riduce ulteriormente il numero di neuroni etichettati 8. Tuttavia, questo sarebbe più tempo.
Etichettatura Dii di singole traiettorie assonale nella preparazione montare tutto il midollo spinale embrionale è stato fondamentale per l'identificazione di un cGMP segnalazione cascata comprende il CNP ligando, il suo recettore Npr2, e lachinasi cGMP-dipendente cGKIα - che regola un tipo di ramificazione assonale: la biforcazione del DRG neuroni al DREZ 4,5,9-12. In contrasto con il wild-type, gli assoni dei neuroni DRG in cGMP mutanti di segnalazione svolta in una sola direzione, invece di biforcano al DREZ (Fig. 5). Questi studi hanno anche rivelato che la formazione di garanzia non è stata influenzata in cGMP mutanti di segnalazione che indicano che questo secondo tipo di formazione ramo osservato nei neuroni DRG è diversamente regolata 4.
In alternativa, il comportamento ramificazione dei singoli assoni DRG può anche essere studiato nelle linee di topo transgenico che ha espresso una proteina fluorescente solo in un piccolo sottogruppo di neuroni DRG 13 o contenenti una combinazione di marcatori fluorescenti che permette di distinguere tra i singoli neuroni 14. Tuttavia, lo sforzo per incrociarsi il modello di topo mutante da analizzare con le linee del mouse fluorescente deve essere considerato. Inoltre, grazie al promotore (Thy1) espressione usata delle proteine fluorescenti nelle linee di topo transgenico inizia solo in una fase post-natale che rende difficile sapere se un fenotipo osservato ramificazione è il risultato della formazione di ramo di compromissione durante lo sviluppo embrionale o una degenerazione più tardi processo, invece. Al contrario, Dii etichettatura dei DRG embrionale ha il vantaggio di studiare il processo di ramificazione degli assoni e la sua interruzione in mutanti di topo appropriate al momento in cui si verifica assonale ramificazione.
Preparazioni a base di midollo spinale embrionale con DRG allegato potrebbe essere ulteriormente utilizzati per le procedure di etichettatura altri (montaggio intero ibridazione in situ, o LacZ-AP-colorazione di topi transgenici), raccolta di midollo spinale e del tessuto DRG per la RNA-isolamento, o con gli opportuni adeguamenti alle condizioni sterili per gli esperimenti di colture di tessuti e applicazioni a valle, come immagini di calcio o le misurazioni elettrofisiologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center di Berlino) per gli utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal centro di ricerca collaborativa (SFB665) del Consiglio di ricerca tedesco (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
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