Analisi della maturazione polmonare delle cellule dendritiche e migrazione durante l'infiammazione allergica delle vie aeree

Summary

Descriviamo una strategia per monitorare la maturazione e la migrazione delle cellule dendritiche polmonari in risposta ovalbumina nel contesto di infiammazione delle vie aeree ovalbumina indotta allergica. Questa strategia può essere modificato per valutare la migrazione di cellule dendritiche in polmonari impostazioni di infezione.

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) sono i principali attori coinvolti in avvio di risposta immunitaria adattativa mediante l'attivazione antigene-specifiche cellule T. DC sono presenti nei tessuti periferici in stato stazionario, ma in risposta alla stimolazione antigene, DC prendere l'antigene e migrare rapidamente i linfonodi drenanti dove iniziano risposta di cellule T contro il ^1,2 antigene. Inoltre, DC svolgono un ruolo chiave nell'attivare autoimmune nonché allergica risposta immunitaria ^3.

Dendritiche svolgono un ruolo essenziale nel sia all'inizio della risposta immunitaria e l'induzione di tolleranza nel contesto di ambienti polmone ^4. Ambiente polmonare è largamente tollerogenica, a causa della esposizione vasta gamma di antigeni ambientali ^5. Tuttavia, in alcuni individui vi è un'interruzione in tolleranza, che porta ad induzione delle allergie e asma. In questo studio, si descrive una strategia, che può essere utilizzato per monitorare la maturazione delle vie aeree DC e migrazione in risposta per l'antigene usato per la sensibilizzazione. La misurazione di maturazione delle vie aeree DC e migrazione permette di valutare la cinetica della risposta immunitaria durante infiammazione delle vie aeree allergica e aiuta anche a comprendere la grandezza della risposta immunitaria successivo insieme con i meccanismi sottostanti.

La strategia si basa sull'uso di ovalbumina come agente sensibilizzante. Ovalbumina indotta l'asma allergico è un modello ampiamente utilizzato per riprodurre l'eosinofilia delle vie aeree, l'infiammazione polmonare ed elevati livelli di IgE trovati durante l'asma ^6,7. Dopo la sensibilizzazione, i topi sono sfidati con la consegna intranasale di ovoalbumina marcato con FITC, che permette di un'etichettatura specifica dei PVS delle vie aeree che ovoalbumine assorbimento. Successivamente, utilizzando diversi marcatori specifici DC, possiamo valutare la maturazione di queste cellule dendritiche e può anche valutare la loro migrazione verso i linfonodi che drenano impiegando la citometria a flusso.

Protocol

1. Sensibilizzazione dei topi con ovoalbumina

1. Preparare una soluzione di OVA (grado V, Sigma, MO) in PBS sterile a una concentrazione di 1 mg / ml (soluzione può essere conservato a -80 ° C).
2. Al fine di preparare OVA-Alum miscela, prendere allume in un tubo e aggiungere la soluzione di OVA in maniera a gocce mentre il tubo vortex ad un rapporto di 1:1. Mescolare il composto per 30 minuti e usare subito dopo la miscelazione.
3. Uso di una siringa da 1 ml, iniettare 0,2 ml della miscela nella cavità peritoneale del mouse e ripetere l'iniezione dopo 2 settimane.

2. Sfida intranasale di topi con FITC ovoalbumina etichetta

1. 7 giorni dopo la seconda iniezione di OVA-Alum, i topi sono pronti per essere inoculati per via intranasale con OVA-FITC.
2. Preparare una soluzione di OVA-FITC (Sigma) usando PBS sterile a una concentrazione di 1 mg / ml e conservare in aliquote a -80 ° C.
3. Inserire una garza sterile sul fondo di un tubo Falcon da 50 ml e in uno h chimicoood, aggiungere 5 ml di Aerrane sulla garza. Allo scopo di anestetizzare topi, dirigere l'animale nel tubo per circa 5-10 secondi.
4. Tenere l'animale anestetizzato in posizione verticale e l'utilizzo di puntali sterili, Pipettare 100 ul del OVA-FITC soluzione sulle narici di topi in una goccia a goccia moda.
5. Ripetere sfida intranasale con OVA-FITC per i prossimi due giorni.

3. Preparazione di singole cellule Sospensione dei polmoni e dei linfonodi che drenano

1. Sacrifica i topi con l'iniezione intraperitoneale di Euthanyl.
2. Al fine di ridurre la contaminazione dei macrofagi, che può complicare l'analisi DC, lavaggio polmonare viene eseguita. Per lavanda i polmoni, trachee mouse sono brevemente esposto e cannulata con un catetere e una siringa, utilizzando PBS ghiacciato di 5 mM EDTA, il tratto respiratorio inferiore è risciacquato 3 volte per rimuovere le cellule dagli spazi alveolari.
3. Perfondere i polmoni con 10 ml di PBS contenente 10 U / ml heparin attraverso il ventricolo destro del cuore, per rimuovere le cellule del sangue dal sistema vascolare polmonare. Eseguite le perfusioni fino ai polmoni diventare bianchi, indicativo di rimozione della maggior parte delle cellule del sangue. Questo è particolarmente importante rimuovere cellule contaminanti dal sangue periferico.
4. Staccare i polmoni e rimuovere i linfonodi mediastinici (MLN) e porre i linfonodi in un piatto a parte. (Provare a minimizzare l'esposizione dei tessuti alla luce per evitare lo spegnimento del FITC.)
5. Posizionare i polmoni su una piastra di Petri e tritare con le forbici. Avanti digerire i polmoni per 25 minuti a 37 ° C con 250 U / ml Collagenasi D (Roche) e aggiungere EDTA (10 mM di concentrazione finale) per i prossimi 5 minuti per fermare le attività collagenasi.
6. Passare i frammenti dei polmoni digeriti attraverso un colino 100 pm cellulare e procedere alla lisi ipotonica per rimuovere eritrociti. La sospensione singola cellula è pronto per ulteriori analisi delle DC.
7. Per preparare sospensione di cellule singole dal MLN, tfacilitare la MLN utilizzando aghi sottili e digerire con collagenasi come descritto in precedenza seguita da sforzo attraverso un colino cella.

4. La colorazione per DC Marcatori per valutare Maturazione / migrazione

1. Al fine di identificare DC nei polmoni, colorazione viene eseguita per CD11c e CD11b. Inoltre, per valutare per la maturazione, la colorazione viene eseguita per CD86 e CD80, che sono upregulated come controller di dominio sottoposti a maturazione. CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC le cellule ⁺ nel MLN sono identificati come DCs polmonari migratori dai polmoni al MLN in risposta alla sfida delle vie aeree OVA.
2. Sospensione cellule ad una concentrazione di 10 x 10 ⁶ cellule / ml in tampone FACS (PBS con 1% FBS e 1 mM EDTA) e un'aliquota 150 microlitri di sospensione cellulare / provetta per colorazione FACS. Per l'identificazione dei PVS polmonari, le macchie sono necessari: avviare l'elaborazione di controllo (cellule polmonari di topi non esposti a OVA-FITC), OVA-FITC, controllo CD11c singolo, CD11b singolo controllo, CD11bCD11c ^{+ +} doppio controllo, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ doppio controllo, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ doppio comando, MHC II singolo controllo, controllo CD86 singolo controllo CD80 singolo e campioni colorati per OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ^{+ +} MHCII , OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ e OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD80 ^+.
3. Per valutare la migrazione DC, eseguire la conta delle cellule assoluti della sospensione cellulare singolo MLN e successivamente preparare i tubi seguenti: controllo avviare l'elaborazione MLN (cellule di topi non esposti a OVA-FITC), OVA-FITC controllo, CD11c ⁺ di controllo unico, CD11b ⁺ doppio controllo, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ doppio comando, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ doppio controllo e CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ campioni.

5. Risultati rappresentativi

I punti di tempo necessari per la sensibilizzazione intraperitoneale per indurre infiammazione allergica delle vie aeree è importante e deve essere eseguita come illustrato in Figura 1. Dopo sensibilizzazione intraperitoneale e OVA sfida vie aeree, per confermare l'induzione delle vie aeree allergica, alcuni topi possono essere sacrificati e analisi istologica può essere eseguita su sezioni polmonari come mostrato nella Figura 2. La presenza di cellule infiammatorie può essere confermata da ematossilina e eosina (Figura 2A) e presenza di produzione di muco può essere valutata mediante periodica-acido-Schiff macchia (Figura 2B). In tutto questo conferma l'induzione di infiammazione delle vie aeree allergica sfida OVA OVA di topi sensibilizzati ^8. Al contrario, le sezioni polmonari da Saline topi trattati dovrebbero essere esenti da qualsiasi infiammazione lungo con assenza di qualsiasi produzione di muco. Inoltre, in seguito sfida OVA, polmonare DC unde RGO maturazione e successiva migrazione verso i linfonodi drenanti. Analisi dei CD11c ⁺ cellule nei linfonodi mediastinici (MLN) da topi sensibilizzati e stimolati con OVA dovrebbe mostrare una maggiore percentuale di cellule CD11c ⁺ rispetto a topi trattati con soluzione salina (Figura 3A). Inoltre, l'analisi della conta assoluta delle cellule del CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ cellule in MLN di topi OVA sensibilizzate e contestato, dovrebbe mostrare una significativamente più alta (vale a dire diverse volte superiore) conta che le controparti di topi trattati con soluzione salina ( Figura 3B).

Figura 1. Protocollo sperimentale per l'induzione di ovoalbumina (OVA) indotta infiammazione delle vie respiratorie allergiche nei topi insieme con la sfida delle vie aeree con marcato con FITC ovoalbumina (OVA-FITC).

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Sensibilizzazione Figura 2. OVA seguita da sfida vie aeree OVA porta a induzione delle vie aeree allergica come identificato dalla colorazione con ematossilina e eosina di sezioni polmonari indicate in (A) e porta anche alla produzione di muco nelle vie aeree come identificati mediante colorazione di acido periodico Schiff polmone sezioni come illustrato in (B).

Figura 3. OVA-FITC sfida induce la migrazione DC dai polmoni ai linfonodi mediastinici (MLN). (A) appezzamenti di citometria a flusso raffigurante proporzioni di CD11c ⁺ cellule in MLN di controllo o di OVA topi sensibilizzati. (B) conte assolute dei CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC celle ⁺ in MLN di topi saline o OVA-sensibilizzato. * P <0,05. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

Il metodo qui presentato offre un approccio basato citometria a flusso per l'analisi DC polmonari, sulla base di consegna di OVA-FITC per la sfida delle vie aeree. Questo consente il monitoraggio selettivo delle DC polmonari, che assorbono OVA-FITC e quindi le popolazioni DC, che sono monitorati sono effettivamente quelli che partecipano nella risposta immunitaria vie aeree durante il corso di OVA indotta infiammazione delle vie aeree allergica. In topi di controllo, in assenza di infiammazione delle vie aeree allergica, il numero di DC migratori (OVA-FITC + DC) individuati nel MLN sono indicativi di basali di DC migrazione, che accelerano in risposta ad infiammazione delle vie aeree allergica conseguente aumento significativo conta assoluta dei OVA-FITC + DCS nel MLN. La strategia descritta, offre vantaggi rispetto ai tradizionali approcci basati immunoistochimici / immunocolorazione perché l'analisi può essere effettuata in breve tempo durata e l'efficienza / sensibilità è molto più elevato. Pertanto è postaqually importante garantire che i controlli adeguati, come descritto nei metodi sono impiegati durante l'analisi in citometria a flusso. Un altro parametro che può influenzare i risultati è la preparazione di sospensione singola cellula dal polmone. Quindi occorre prestare attenzione per evitare l'esposizione significativa del tessuto alla luce per esso può influenzare la fluorescenza di OVA-FITC e cura deve essere adottata anche durante la digestione enzimatica del polmone per digestione oltre può portare alla scissione dei marcatori di superficie sulle cellule, che influirà analisi a valle. Macrofagi alveolari e DC condividere insiemi simili di marcatori di superficie, il che complica ulteriormente l'analisi delle popolazioni polmonari DC ^9. Pertanto è fondamentale lavanda i polmoni per rimuovere macrofagi alveolari che possono interferire con l'analisi DC.

In aggiunta all'analisi di migrazione DC polmonare durante l'infiammazione delle vie aeree allergica, la metodologia descritta può essere potenzialmente modificato per valutare la risposta immunitaria ad altri unotari, per cui antigeni specifici possono essere etichettati con un colorante fluorescente e consegnato per via intranasale. Successivamente analisi simili come descritto sopra può essere effettuata per valutare la risposta polmonare DC. Nei casi in cui l'antigene non possono essere etichettati, poche ore prima della consegna antigene, FITC-destrano o CFSE può essere consegnato ai topi. Successivamente, dopo la consegna antigene, analisi può essere effettuata per monitorare la migrazione di FITC-destrano o CFSE etichettati DC al MLN, che indicherà la cinetica di polmonare migrazione DC dopo l'inoculazione con l'antigene specifico ^10,11. Nel nostro precedente lavoro, abbiamo utilizzato questa strategia per valutare la maturazione / migrazione di DC polmonari in seguito alla consegna di vettori adenovirali terapia genica ^10. Dal momento che DC sono fagocitaria, la somministrazione intranasale di FITC-destrano risultati in rapida diffusione di DCS polmonari, che possono poi essere monitorati mediante citometria di flusso. Nei casi in cui il monitoraggio dei polmonare plasmacitoidi DCS è desiderato, CFSE dovrebbe essere dipendenYed dal controller di dominio plasmacitoidi non assorbimento FITC-destrano nel modo più efficiente di altri sottoinsiemi DC polmonari ^10.

Complessivamente, la strategia descritta offre vantaggi rispetto ad altri approcci tradizionali per offre una analisi quantitativa di maturazione polmonare DC / migrazione nel corso delle vie aeree.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Alum	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Collagenase D	Roche	11088858001
Antibodies	e-Bioscience