Summary
I denne protokol beskriver vi fremstilling, oprensning og titrering af lentivirale vektorer. Vi giver et eksempel lentivirale vektor-formidlet gen-levering i primære dyrkede neuroner og astrocytter. Vores metoder kan også gælde for andre celletyper
Abstract
Effektiv gen-levering i centralnervesystemet (CNS) er vigtigt at studere genfunktioner, modellering neurologiske sygdomme og udvikle terapeutiske fremgangsmåder. Lentivirale vektorer er attraktive redskaber i transduktion af neuroner og andre celletyper i CNS, som de transducerer både delende og ikke-delende celler, støtte vedvarende ekspression af transgener og har relativt store emballager kapacitet og lav toksicitet 1-3. Lentivirale vektorer er blevet anvendt med held i transducerende mange neurale celletyper in vitro 4-6 og i dyr 7-10.
Store bestræbelser er blevet gjort på at udvikle lentivirale vektorer med forbedret biosikkerhed og effektivitet genafgivelse. De nuværende tredje generation replikationsdefekte og selv-inaktiverende (SIN) lentivirale vektorer er afbildet i figur 1.. De nødvendige elementer til vektor emballage er opdelt i fire plasmider. I lentivirale transfer plasmid er U3 regionen i 5 'lange terminale gentagelse (LTR) erstattet med en stærk promotor fra en anden virus. Denne modifikation tillader transkription af vektorsekvensen uafhængigt af HIV-1 Tat-protein, der normalt kræves for HIV-genekspression 11. Emballagen signal (Ψ) er afgørende for indkapsling og Rev-responsive element (RRE) er påkrævet til frembringelse af høj titer vektorer. Den centrale polypurin tarmkanalen (cPPT) er vigtig for kerneimport af vektor-DNA, en egenskab der kræves til at transducere ikke-delende celler 12. I 3'-LTR, er cis-regulatoriske sekvenser fjernes fuldstændigt fra U3 region. Denne deletion kopieres til 5 'LTR efter revers transkription, hvilket resulterer i transkriptionel inaktivering af begge LTR'er. Plasmid pMDLg / pRRE indeholder HIV-1 gag / pol gener, som giver strukturelle proteiner og revers transkriptase. pRSV-Rev koder Rev som binder til RRE til effektiv RNA eksport fra kernen. pCMV-G koderdet vesikulære stomatitis virus glycoprotein (VSV-G), der erstatter HIV-1-env. VSV-G udvider tropisme af vektorerne og tillader koncentration via ultracentrifugering 13. Alle de gener, der koder de accessoriske proteiner, herunder vif, vpr, vpu og Nef er udelukket i emballagen systemet. Produktion og manipulation af lentivirale vektorer skal udføres i overensstemmelse med NIH retningslinjer for forskning, der involverer rekombinant DNA ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). En godkendelse fra de enkelte institutioners biologiske og kemiske Sikkerhedsudvalget kan være påkrævet, før du bruger lentivirusvektorer. Lentivirale vektorer fremstilles almindeligvis ved cotransfektion af 293T-celler med lentiviral transferplasmidet og hjælpeviruset plasmider kodende for proteiner nødvendige for vektor emballage. Mange lentivirale transferplasmider og hjælper plasmider kan opnås fra Addgene en ikke-Profit plasmid arkiv ( http://www.addgene.org/~~V ). Nogle stabile pakkecellelinier er blevet udviklet, men disse systemer giver mindre fleksibilitet, og deres emballage effektivitet overordnet set falder over tid 14, 15. Kommercielt tilgængelige transfektion kits kan understøtte høje effektivitet af transfektion 16, men de kan være meget dyrt for store vektor-præparationer. Calciumphosphatpræcipitation metoder tilvejebringe højeffektive transfektion af 293T-celler og således tilvejebringe en pålidelig og omkostningseffektiv fremgangsmåde til lentiviral vektor-produktion.
I denne protokol, fremstiller vi lentivirusvektorer ved cotransfektion af 293T-celler med fire plasmider baseret på calciumphosphatpræcipitation princip, efterfulgt af oprensning og koncentrering med ultracentrifugering gennem en 20% saccharosepude. Vektoren titere bestemmes ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) Analysis eller ved realtid qPCR. Produktion og titrering af lentivirusvektorer i denne protokol kan afsluttes med 9 dage. Vi giver et eksempel på transducerende disse vektorer i murine neocorticale kulturer indeholdende både neuroner og astrocytter. Vi viser, at lentivirusvektorer understøtte høje effektivitet transduktion og celletype-specifik genekspression i primære dyrkede celler fra CNS.
Protocol
1. Emballering af lentivirusvektorer
Lentivirale vektorer fremstilles ved cotransfektion af en lentiviral overføringsvektor og andre plasmider, der kræves til pakning i 293T-celler ved calciumphosphat-transfektion metode. Vi anvender 10 100 mm vævskulturskåle i denne protokol. Det kan skaleres op eller ned afhængigt af anvendelser. Den 293T cellelinie holdes i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med højt glucoseindhold (4500 mg / L), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin i 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Frø 293T-celler ved 30-40% konfluens til 10 100 mm vævskulturskåle (3 x 10 6 celler / skål) i dyrkningsmedium. Tilbage cellerne til inkubatoren.
- Efter 20-24 timer kultur, kontrollere celledensiteten. Cellerne bør være omkring 80% konfluens ved transfektion.
- Fremstilling af en 50-ml rør. Tilsættes 4,4 ml TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) minus det totale volumen af den følgende plasmid-DNA. Tilsæt 100 ug lentiviral transferplasmidet (fig. 1), 58 ug pMDLg / pRRE, 31 ug pCMV-G, 25 ug pRSV-Rev, 600 pi 2M CaCl2. Bland forsigtigt.
- Forberede en anden 50 ml rør. Tilsæt 5 ml 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, 1,5 mM Na2 HPO4, pH 7,12).
- Tag DNA-CaCl2 blanding af 10 ml pipette, og der tilsættes til røret indeholdende 2 x HBS, dråbevis mens prøveglasset omrystes.
- Holde udfældningsreaktion ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter.
- Fjern dyrkningsskålene fra inkubator. Bland udfældningsreaktion og ved hvirvelbehandling. Tilsæt 1 ml suspension til hver 100-mm-skål holdige celler. Suspensionen skal tilsættes langsomt, dråbevis under forsigtig omrystning mediet i skålen. Retur disse retter til inkubator og orlov til 5 timer.
- Fjernelse af mediet fra kulturen. Tilsættes 6 ml frisk kulturmedium indeholdende 6 mM natrium butyrate til hver skål. Returnér kulturer inkubator. Efter dyrkning natten over, hvis der er en fluorescerende reporter i konstruktionen kontrollere reporter-genekspression under fluorescensmikroskop. Sædvanligvis over 80% af cellerne udtrykker reportergenet, hvis det drives af et allestedsnærværende promoter (f.eks CMV-promotor).
- To dage (40-44 h) efter transfektion indsamle supernatanten fra 10 skåle i 2 50 ml rør (ca. 30 ml hvert rør). Fryse supernatanten i -80 ° C fryser eller gå til næste trin.
2. Koncentrering og rensning af vektorerne
- Centrifugeres frisk opsamlet og optøet supernatanten ved 900 g (ca. 2000 omdrejninger per minut) i 10 minutter for at fjerne eventuelle cellerester i supernatanten.
- Vedhæfte en 60 ml sprøjte med en 0,2 um SFCA sprøjtefilter. Overføres supernatanten fra 50 ml rør til sprøjten. Filtreres supernatanten til et polyallomer centrifugerør.
- Tage 5 ml 20% sucrose (fremstillet i PBS) i en 5 ml pipette. Indsætpipetten til bunden af centrifugerøret indeholdende supernatant. Tilsæt langsomt saccharoseopløsningen under vektoren supernatanten. Gentag disse trin for supernatanten fra et andet rør.
- Centrifugeres supernatanten ved 11.000 rpm og 4 ° C i 4 timer med Beckman SW28 sving rotor.
- Fjern supernatanten. Tilsæt 150 pi 4% lactose (fremstillet i PBS) til hvert centrifugerør. Resuspenderes pelleterne.
- Overføre koncentrerede vektoren fra alle centrifugerør med en 1,5 ml rør. Forlader røret på is i 15 min.
- Blandes vektoren suspensionen ved pipettering. Spin med mikrocentrifuge ved fuld hastighed (ca. 16000 g) i 1 min.
- Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml rør. Opdele slutprøven i 20 pi alikvoter og opbevaret dem -80 ° C fryser.
3. Titrering af vektorerne
- Frø 5 x 10 4 / brønd af HT1080-celler i 12-brønds plade i 1 ml DMEM-medium suppleret med 10% FBS.
- Efter overnight kultur, tælle celler fra en brønd, og scorer på celleantal.
- Gøre 5-fold seriefortynding (1:5, 1: 25, 1:125 og 1:625) af den koncentrerede vektoren med dyrkningsmedium. Tilsættes I pi af hver fortyndet vektor til separate brønde. Prøverne kan duplikeres at forøge nøjagtigheden.
- Tilsæt 1 ul 4 mg / ml Polybrene (hexadimethrinbromid) i hver brønd indeholdende vektor og i en brønd uden vektor. Blandes ved forsigtig rystning af pladen. Tilbage til inkubatoren i 48 timer.
- Fjerne medium fra cellekulturen brønde. Vaske hver brønd med PBS. Tilsæt 250 pi 1x trypsin-EDTA-opløsning til cellerne. Når cellerne løsnes (3-5 minutter), og der tilsættes 1 ml dyrkningsmedium. Cellerne ved pipettering. Overførsel cellesuspension til 1,5 ml centrifugerør.
- Centrifugeres ved 900 g i 6 min. For vektorer med en fluorescerende reporter gen (f.eks GFP), gå til trin 3,7 til FACS-analyse. For vektorer uden en journalist, gå til trin 3,8 til tidstro qPCR.
- For vektorer indeholdende en fluorescent reportergen, fjernes supernatanten og resuspender pelleten i 300 pi 3,7% formaldehyd i PBS. Bestemmelse af den procentdel af reporter-positive celler ved FACS-analyse. Titeren er repræsenteret som transduktion enheder pr milliliter koncentreret vektor (TU / ml).
For eksempel blev givet 1 x 10 5 celler transduceret med 1/25 ul (0,04 pl) vektor og 30% celler er reporter positive, vil titeren er:
Kun anvende fortyndinger ligge inden for et lineært forhold mellem procentdelen af positive celler og mængden af vektoren tilsat til beregning titer. Den endelige titer bør være et gennemsnit af de titere opnået fra transduktioner af mindst 2 forskellige mængder af vektoren.
- For vektorer udenfluorescerende reporter-gen, ekstrahere genomisk DNA fra HT1080-celler under anvendelse QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. Amplificere vektorsekvens i genomisk DNA ved anvendelse af ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) med primere (i HIV-1 PBS / psi regionen 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 'og 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3', og TaqMan-proben 5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'. Albumin gen, som er et enkelt kopigen i genomet (2 kopier / celle) blev også amplificeret med primerne 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 'og 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3', og probe 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 'som en intern kontrol. Bestemme kopiantal af vektoren og albumin ved PCR i 96-brønds plade ifølge producentens instruktion med følgende program: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, og 35 cyklusser af 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 2 min. Ti-fold seriefortyndinger af plasmider med kendt koncentration (repræsenteret som kopiAntallet) indeholdende template-sekvenser også amplificeres for at skabe en standardkurve til kvantificering af ukendte prøver. Titeren er repræsenteret som integration enheder pr milliliter koncentreret vektor (IU / ml).
4. Transduktion af neocorticale Cultures
Neocorticale kulturer indeholdende både neuroner og glia fremstilles ud fra muse-cortex under anvendelse af en totrins-udpladning procedure som tidligere beskrevet 18. Neocortices opnået fra føtale mus på 14-16 dage drægtighed udplades på en tidligere etableret glial monolag i MEM suppleret med 10% FBS, 20 mM glucose og 2 mM glutamin i 24-brønds vævskulturplade.
- Efter 5 dage in vitro, og der tilsættes 10 uM cytosin arabinosid (ara-C) i neocortical kultur til at inhibere ikke-neuronal celledeling. Dyrkes cellerne i 2 dage.
- Varm dyrkningsmedium i 37 ° C vandbad i 5-10 min. Erstatte Ara-C-holdigt medium med frisk dyrkningsmedium (500 gl / brønd).
- Tilsættes vektor med ønskede MOI (mangfoldighed af infektion, forholdet mellem antallet af vektorpartikler til antallet af målceller) til kulturen. Dyrkes i 24 timer. Vi anvender MOI på 1-10 (sædvanligvis 5) i primære corticale kulturer.
- Erstatte dyrkningsmediet med frisk medium. Fortsæt kultur. Hvis der er en reporter-gen i vektorkonstruktionen, se celler under fluorescensmikroskop 2 dage efter transduktion. Reporter-genekspression vil være synlige i neuroner 2-7 efter transduktion, afhængigt af vektoren udformning og den anvendte dosis.
5. Repræsentative resultater
Titerne af lentivirale vektorer produceret med denne protokol området 10 8 -10 10 IU / ml, which er egnede til transduktion af en række celletyper fra CNS både in vitro og in vivo. tabel 1 og figur 2 viser et repræsentativt resultat under anvendelse af vektorerne fremstillet ved denne protokol. Vi transduceret murine neocorticale kulturer med lentivirale vektorer, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) kontrolleret af synapsin (SYN) promotor eller glial fibrillært surt protein (GFAP)-promotoren. Syv dage efter transduktion, udførte vi immunfarvning til mærkning neuroner og astrocytter med anti-Neun og anti-GFAP antistoffer. Som vist i tabel 1 og fig. 2A, efter transduktion med vektoren, der bærer synapsin promotoren, over 90% af neuroner (Neun +-celler) udtrykker GFP og ingen astrocytter (GFAP +-celler) udtrykke dette reportergen. Når GFAP promotor anvendes i vektorkonstruktionen (fig. 2B), cirka 80% af astrocytter (GFAP + celler) udtryks GFP, alle GFP +-celler er astrocytter som bekræftet ved co-lokalisering med GFAP og fraværet af GFP-ekspression i Neun-mærkede celler. Disse resultater viser, at lentivirale vektorer er meget effektive til at levere transgener til celler fra centralnervesystemet og celle-specifik genekspression kan opnås ved egnede promotorer anvendes.
Figur 1. Skematisk repræsentation af HIV-baserede lentivirale vektorer og emballering plasmider. HIV-1 provirus er vist øverst. Elementerne til vektorproduktion separeres i fire forskellige plasmider. Den lentivirale transferplasmidet indeholder et hybrid 5 'LTR i hvilken U3 region er erstattet med cytomegalovirus (CMV)-promotor, emballagen signal (ψ), RRE sekvensen, den centrale polypurin-tarmkanalen (cPPT), et gen af interesse (f.eks en fluorescerende reporter) sammen med en promotor til at vælge, og 3'-LTR, hvorcis regulatoriske sekvenser er fuldstændigt fjernet fra U3 region. pMDLg / pRRE indeholder gag og pol-generne og RRE sekvensen fra HIV-1 under kontrol af CMV promotoren. pRSV-Rev indeholder den kodende sekvens af Rev drevet af RSV-promotoren. pCMV-G indeholder VSV-G-protein-genet under kontrol af CMV promotoren. PA angiver polyadenyleringssignalet fra humant β-globin-genet.
Figur 2. Ekspression af reportergener i mus neocorticale blandet kultur transduceret med lentivirale vektorer, der bærer celletype-specifikke promotorer. Kulturerne blev transduceret med LV-SYN-GFP (A) eller LV-GFAP-GFP vektorer (B) ved en MOI på 5. Syv dage efter transduktion blev cellerne immunfarvet med anti-Neun eller anti-GFAP-antistoffet. Øvre paneler viser GFP-fluorescens-, middle-paneler viser immunfarvning og lavere paneler er fusioneret billeder (GFP: grøn, Neun eller GFAP: rød).
Tabel 1. Sammenligning af GFP-ekspression i murine neocorticale kulturer transduceret med lentivirusvektorer bærer forskellige projektlederne et.
a Murine neocorticale kulturer (5 x 10 5 / brønd i 24-brønds plade) blev transduceret med LV-SYN-GFP eller LV-GFAP-GFP ved en MOI på 5. Syv dage efter transduktion, blev kulturerne fikseret og immunofarvet for Neun eller GFAP. Antallet af GFP og Neun / GFAP-udtrykkende celler blev talt i billeder fra 10 felter per eksperimentel betingelse. Værdierne repræsenterer procent af neuroner (Neun + celler) ellerastrocytter (GFAP +-celler), der også udtrykte GFP-reportergenet. De viste værdier er middelværdier ± SD fra tre uafhængige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, har vi vist, at produktionen af lentivirusvektorer og anvendelsen af disse vektorer i neocorticale kulturer. Vi demonstreret effektiv og celletype-specifik transduktion med vektorerne fremstillet ved disse fremgangsmåder. Når synapsin promotor anvendes, GFP-ekspression er strengt neuron specifik. Når GFAP promotor anvendes, GFP-ekspression udelukkende i astrocytter. Hvis der ikke celletype-specifik ekspression er nødvendig, kan en allestedsnærværende promoter anvendes. Fandt vi både ubiqutin og phosphoglyceratkinase (PGK) promotorer kan køre højt niveau af genekspression i neocorticale kulturer 6. Genekspression drevet af lentivirale vektorer kan tilpasses til specifikke niveauer af ekspression eller celletyper ved valg af promotorer (f.eks allestedsnærværende eller celletype-specifik) eller ved anvendelse af forskellige kappeproteiner eller vektorer pseudotyper at målrette specifikke væv eller programmer. For eksempel pseudotyping med rabies G protein eller en fusion af VSV-G end rabies protein understøtter retrograd axonal transport 19,20. Transient transfektion protokol tillader vektoren emballage med forskellige kappeproteiner.
Lentivirale vektorer almindeligvis koncentreret ved ultracentrifugering uden oprensningstrin. Disse urensede vektorer er egnede til mange celletyper. Imidlertid primære neuronale kulturer er følsomme over for kontaminanter fra producerende celler, hvilket resulterer i batch til batch variation for cytotoksicitet. 20% saccharosepude oprensningstrin gør vektorerne konsekvent ikke-toksiske i de primære neuroner. Vi anbefaler anvendelse af oprensede vektorer til transduktion af primære neuroner og injektion i dyr. Hvis større skala eller højere renhed af vektor-præparationer er påkrævet, kan andre oprensningsteknikker, såsom affinitetskromatografi 21 og anionbyttermembran chromatografi 22 anvendes. Som langvarig transduktion generelt kræves i primære neuronale kulturerBør udvises særlig forsigtighed for at minimere forurening under forberedelsen af vektorer. Passerer vektoren supernatanten med 0,2 um filter og anvendelse autoklaverbare polyallomer centrifugerør under koncentrationen af vektoren vil tjene dette formål. Flaske top filtre kan anvendes, hvis et stort volumen af supernatant skal filtreres. Natriumbutyrat er blevet rapporteret at stimulere aktiviteten af promotorer 23. Tilsætning af natriumbutyrat til dyrkningsmediet efter transfektion af producentcelleme kan forøge vektortiter mere end 10 folder 24. Polybren (hexadimethrinbromid) er blevet udbredt anvendt til genoverførsel protokoller for at øge effektiviteten af retroviral genoverførsel ved at neutralisere de negative ladninger, hvilket letter vektor-celleinteraktion 25. I vore hænder, er polybrene giftig for neuroner i neocorticale kulturer. Derfor bør polybren undgås i transducerende primære neuronale kulturer. Hvis der eren fluorescerende reporter i vektoren, er det bekvemt at bestemme vektortiter ved FACS-analyse. Når der ikke reporter er tilgængelig eller et reportergen styres af en vævsspecifik promotor, qPCR til detektering integrering af vektoren i målceller skulle være et bedre valg til integration af vektoren er uafhængig af transgen ekspression. Titeren af specifikke vektorer bestemt ved FACS-analyse vil være lavere end qPCR som ikke alle integrerede kopier af vektoren er funktionel. Vektor titere kan også bestemmes ved måling af HIV p24-protein ved Elesa eller vektor genomisk RNA ved QRT-PCR i vektor-præparationer. Imidlertid er disse metoder er mindre nøjagtige på grund af det store antal defekte viruspartikler uundgåeligt frembringes under emballeringsprocessen og de funktionelle partikler, der ikke med held transducerer målceller 26. De vektorer, som denne protokol er blevet anvendt med succes i både in vitro og in vivo i roDent hjerne 27. Undersøgere bør teste deres systemer individuelt, som vektor-medieret genekspression ikke nødvendigvis identisk i cellekulturer og in vivo systemer, selv i den samme celletype 6,28. Lentivirale vektorer er blevet udbredt anvendt til overekspression eller vælte gener af interesse i en række celletyper i CNS. Vores Protokollen skal være nyttigt for neurovidenskab efterforskerne at udvikle lentivirusvektorer i deres forskning applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH Neuroscience handleplanen Core tilskud (P30 NS057105, BJS) til Washington University, Program Project Grant NS032636 (BJS) og af Hope Center for neurologiske lidelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CM | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 | |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 1 x 3 ½ in polyallom–r centrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
References
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
- Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
- Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
- Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
- Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
- Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
- Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
- Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
- Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
- Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
- Wang, X., McManus, M.
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
- Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
- Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
- Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
- Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
- Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
- Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
- Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).
