Summary
Engineered мышечной ткани имеет большой потенциал в регенеративной медицине, как болезнь модели, а также в качестве альтернативного источника для мяса. Здесь мы описываем техники мышц конструкции, в данном случае от мыши миобластов клеток-предшественников, а также стимуляции электрическими импульсами.
Abstract
Разработан мышечных тканей может быть использован для различных целей, в том числе производство тканей для использования в качестве модели заболевания в пробирке, например, для изучения пролежней, для восстановительной медицины и в качестве мяса альтернативные 1. В первом сообщалось 3D конструкций мышцы были сделаны много лет назад и пионерами в этой области являются Vandenburgh и коллег 2,3. Авансы в мышцах тканевой инженерии являются не только результатом огромного выигрыша в знаниях биохимических факторов, стволовых клеток и клеток-предшественников, но и, в частности, основанные на выводы, полученные исследователями, что физические факторы играют существенную роль в контроле клеточного поведения и развитие тканей. Государство-оф-искусство инженерных мышцы строит в настоящее время состоит из ячейки населенных конструкций гидрогеля. В нашей лаборатории это обычно состоят из мышиных миобластов клеток-предшественников, выделенных из мышиных задних мышц конечностей или мышиной линии клеток миобластов C2C12, мильфиксировано смесью коллаген / Matrigel и помещают между двумя точками крепления, имитируя мышцы связки. Другие клетки могут быть рассмотрены, а также, например, альтернативных клеточных линий, таких как L6 миобластов крысы 4, новорожденных мышц, полученных клеток-предшественников, 5, клеток, полученных из взрослых тканей мышц от других видов, таких как человека 6 или даже индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (индуцированных плюрипотентных клеток) 7 . Сотовые сократимость вызывает выравнивание ячеек вдоль длинной оси конструкции 8,9 и дифференциацию клеток-предшественников мышц приблизительно через одну неделю культуре. Кроме того, применение электрической стимуляции может улучшить процесс дифференциации в некоторой степени 8. Из-за своего ограниченного размера (8 х 2 х 0,5 мм), полная ткани могут быть проанализированы с помощью конфокальной микроскопии для контроля, например, жизнеспособность, дифференциация и выравнивание ячейки. В зависимости от конкретного применения требований к инженернокрасные мышечные ткани будет меняться, например, использование для регенеративной медицины требуется масштабирование до размеров ткани и васкуляризации, а в качестве перевода мясо альтернативой другим видам необходимости.
Protocol
1. Культуры миобластов мышиной клетки-предшественники или клетки C2C12
- Изолировать клеток в соответствии с протоколом первоначально опубликовано Шефер и его коллеги 10 и более поздних адаптированы Collins и соавт. Боонен 11 и соавт. 12 и хранить их в жидком азоте. Это требует мышей, например, C57Bl / 6. Альтернативные методы, которые используются в других лабораториях, например, метода опубликована в журнале Визуализированные Эксперименты Li Y и соавт. 13. Для реактивов и оборудования вам следует обратиться к таблице на стр. 7 и 8. Из мышц от одной мыши вы, как правило получить достаточное количество клеток для криоконсервирования около 20 флаконов в жидком азоте. Далее, мы начинаем протокол таять клетки от жидком азоте.
- Поместите клетки от 1 флакона в 25 см 2 Matrigel (1 мг / мл) с покрытием колбы культуры тканей и добавить питательную среду (GM), состоящей из (335 мл DMEM передовой, 100 мл плода Бовинэлектронной сыворотки (FBS), 50 мл HS, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл L-глутамина, 5 мл куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ)).
Примечание: пальто в течение 2 ч при комнатной температуре и удалить Matrigel стремлением.
- Субкультура клеток примерно 1:03 каждые 3 дня.
Это означает: на 3-й день: Переход от одной клетки 25 см 2 до 75 см 2 колбы, на 6-й день: переход от одной клетки 75 см 2 колбы с двумя 150 см 2 колбы (с 30 мин preplating в колбах без покрытия). На 9-й день передачи на расстоянии 150 см 2 колбы до 1 трехместный 150 см 2 колбы, или если недоступны до трех 150 см 2 колбы (при необходимости preplate опять же в зависимости от фенотипа клеток). На 12-й день клетки готовы для посева в мышцу конструкции.
Примечания: - За тройное 150 см 2 числа клеток составит примерно 4,5 х 10 6 клеток.
- Используйте помощьюLs из различных выделений смешивать их для получения смешанной популяции клеток во время посева.
Примечание: Если вы не хотите работать с первичными клетками, C2C12 миобластов являются хорошей альтернативой.
2. Инженерные скелетных мышечных тканей
- Подготовка кремния клея путем смешивания "эластомер" с "отвердителя" (10:1). Вырезать + / - 5 мм квадратных сегментов липучкой с одной стороны треугольного (дом-образную форму; рис. 1). Клей липучки в лунки 6-луночный культуральный планшет в пространстве примерно на 12 мм между квадратами.
Примечания: - используйте только мягкую сторону липучки и сталкиваются с этой стороной вверх.
- Убедитесь, что крышам навстречу друг другу.
- Только покрытие Velcro с силиконовым клеем, не распространяются клея во всем хорошо.
- Для дальнейшего электрической стимуляции уместно привести конструкций в вертикальном направлении и плели (вдоль длинной оси).
- Оставьте сохнуть в течение ночи в вакуумной печи, не отапливается, в первую очередь, чтобы удалить пузырьки воздуха. Стерилизовать добавлением 70% этанола в лунки и инкубировать в течение 15 мин. Промыть 3 раза с PBS и поставить под УФ в течение 15 мин. Удалите все PBS из скважин и липучки и место в инкубаторе до использования.
- Оттепель Matrigel решение в холодильнике и подготовки раствора коллагена до нужной концентрации незадолго до принятия 3D конструкций. Развести фондовом коллагена стерильным 0,02% уксусной кислоты (конечная концентрация 3,2 мг / мл).
Примечание: оставить все на льду.
- Trypsinize клетки, ресуспендирования в GM и кол. Оставьте клеток в центрифуге трубки в инкубаторе.
- Добавить необходимое количество коллагена раствора для чисел конструкций, которые вы хотите, чтобы к трубке (в соответствии с таблицей 1), добавляют 0,5 М NaOH до этого раствора коллагена до светло-розового колоГ указывает, рН 7,5. Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз и избежать образования пузырьков. Затем добавить Matrigel и смешать очень осторожно, но тщательно. Наконец, добавьте ГМ коллаген / Matrigel смеси (при соответствующем количестве см. Таблицу 1).
Примечания: - Выполняйте каждый шаг на льду! Matrigel и коллагена охотно гель при повышении температуры.
- Имейте в виду, что цвет действительно розовый! Увеличение рН также вызывает быстрое застывание.
- Конечная концентрация коллагена: 1,6 мг / мл.
- Центрифуга нужное количество клеток при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и удалить супернатант.
Примечание: - В зависимости от активности клеток число клеток в построить нуждается в корректировке. Как правило, количество клеток находится между 750000 и 1250000 клеток на конструкцию.
- Использование некоторых из геля смесь ресуспендируют осадок клетоки передать клеток в оставшуюся смесь и тщательно перемешать, но без введения пузырьков воздуха.
- Возьмите разогретую также пластин из инкубатора и пипеткой 0,35 -0,4 мл клетки-гель смесь в липучки в первую очередь. Затем начинают пипетировать смесь из центра между вложений сайтах и распространяются на липучке. Наконец, используйте оставшуюся часть геля, чтобы заполнить разрыв между двумя якорями липучки и пипеткой по части липучки.
- Тщательно проверьте через 5-10 мин, если гели достаточно прочной, чтобы быть переданы, то есть слегка постучите по блюд и визуального осмотра, если гель будет жесткой. Если это так, осторожно поместите посуду в инкубаторе. Как правило, они могут быть подняты через десять минут. Затем, после 1-2 часов, аккуратно накладываются друг на гель с 4 мл теплой GM.
Примечание:-Не делайте никаких энергичных движений при обработке пластин.
- Заменить GM дифференциация среды (рост среднегобез куриных эмбрионов экстракт), после 24 часов, и заменить свежей среде каждые 2-3 дня. На 7-й день вы должны были получить зрелые ориентированных волокон мышц, а может быть оценена с окрашиванием для кросс-разработки страт в расплавленном мышечных волокон.
3. Электрическая стимуляция
- Стерилизовать электроды от пластины ionoptix (см. таблицу реагентов и оборудования) перед использованием с 70% этанола и затем сушат под УФ в безопасности кабинета. Поместите пластину с электродами на культуру пластину с конструкциями и накрыть крышкой от пластины культуры и передачу инкубатора. Подключите Ionoptix C-иноходца с соответствующими кабелями.
Примечание: электроды расположены параллельно рядом с мышц конструкции (рис. 2).
- Применение протокола стимуляции, как ожидалось.
Примечание: Мы обычно используем 4 В / см,6 мс импульсы с частотой 2 Гц. Изменение культуры средних каждые 24 часа во время стимуляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конечный продукт будет мышцы конструкции, как показано на рисунке 3. Размер ткани будет около 8 мм длиной, 2 мм шириной и толщиной 0,5 мм. Электрическая стимуляция при дифференциации будет менять выражение изоформ миозина тяжелой цепи, но не значительно повысить дифференциацию процесса, индуцированного дифференциации среднего 8, но электрической стимуляции могут также применяться в конце процесса для проверки функциональности мышц , потому что мышцы полностью разработана саркомеров смогут заключить контракт на электрический импульс.
Дифференцировки и созревания могут быть проанализированы с помощью количественной ПЦР для гена оценки выражения и окрашивание на мышцы созревание маркеров или кросс-разработки страт (например, окрашивания для альфа-актинина) либо на разделы сделаны из ткани или целые горы окрашенных образцов ткани. Мышцы созревания и дифференцировки отношенийТед генов и миозина тяжелой цепи выражения включают, например, MyoD, миогенин, MFR4 и MLP, и 1 MYH, 2, 4 и 8 8. Доказательство того, что мышечная ткань, которая образуется в самом деле является мышечная ткань, основанные на экспрессии генов, иммуногистохимического окрашивания и сокращение индукции электрического раздражения, была опубликована ранее 8 и рисунок с цветными сечения мышечных тканей из клеток-предшественников миобластов и C2C12 клеток Из этого документа отображается на рисунке 4.
| Решение | Объем (если решений 10 мышц) в мкл |
| Коллаген (3,2 мг / мл, разбавляют 0,02% уксусной кислоты) | 2570 (51,3%) |
| NaOH (0,5 М) | 10 (0,2%) |
| Matrigel | 430 (8.6%) |
| Рост средних | 2000 (39,9%) |
| общий | 5010 (должно хватить с достаточной для разлива и пипеткой убыток) |
Таблица 1. Смесь клеток и геля для генерации тканей мышц инженерные конструкции.
Рисунок 1. Резка кусочки липучки.
Рисунок 2. Снимок, сделанный из нижней части мышцы построить в лунку 6-луночный планшет показывает размещение электродов. Электроды (указаны с белыми стрелками) расположены параллельно мышцы конструкций.
Рисунок 3. Тканиразработаны мышцы между двумя кусочками липучки в 6-и культуру пластину.
Рисунок 4. Типичные примеры крест-страт в C2C12 (А) и ПДК (B) в инженерных скелетной мышечной ткани. Frozen разделы нестимулированных mBAMs (8-й день дифференциации) были окрашены для саркомерного α-актинина (красный), саркомерного миозина (зеленый ) и ядер (синий). (Ла-Ab и Ba-Bb) Увеличения в коробках районов (A, B) α-актинина (красный) и саркомерного миозина (зеленый). Печатается с разрешения 8. Нажмите, чтобы увеличить цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инженерные мышечной ткани имеет большой потенциал для использования в качестве модели заболевания, для скрининга лекарственных средств, в регенеративной медицине и для производства мяса. Тем не менее, требования к этим приложениям меняться. Мы решили работать с комбинацией коллагена и матригель, потому что коллаген обеспечивает выравнивание ячейки и потому, что клетки предшественники миобластов требуют присутствия базальной мембраны, полученные белки, как это определено в предыдущих исследованиях 2D 12. Кроме того, фибрин, гели были протестированы в нашей лаборатории и, кажется, не поддерживает клеток и миобластов C2C12 предшественников как это делает смесь коллагена и Matrigel ™ и уж тем более не приводит к уплотнению ткани 14. Эта модель, как описано здесь уже был использован в исследованиях по давлению повреждения кишки при использовании клеточной линии 15. Для регенеративной медицины приложений, перевод с клетками человека спутниковой недавно был сделан 6,16. Кроме того,в качестве альтернативного источника для потребления мяса техника имеет большой потенциал 1. По нашему мнению, однако, современные технологии необходимо, чтобы перейти к следующему этапу дальнейшего его использования в клинике, а также для потребления. Например, дифференциация останавливается на отметке новорожденных этапе, а также производительная сила гораздо меньше, чем мышцы производит в естественных условиях. Кроме того, хотя клеток мыши, крысы и человека стволовые может быть реализована в 3D-конструкции, изоляции и, особенно, дифференцировки и созревания сельскохозяйственных животных клеток, полученных из мышечных стволовых не развита, что далеко еще 1. Кроме того, использование Matrigel и животного происхождения, сыворотка должна быть опущена 1. Для дальнейшего применения в регенеративной медицине, ткани, размер должен быть увеличен, и требует (нео) васкуляризации и использования системы перфузии биореактора для преодоления кислорода и питательных веществ ограничения диффузии. Некоторые предварительные исследования васкуляризации на небольших конструкциях чпр. было сделано в последние годы 9,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Yabin Wu для культивирования тканей представлен на рисунке 2, снимок был сделан Барт ван Overbeeke. Работа выполнена при финансовой поддержке SenterNovem, грант ISO 42022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
