STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

요약

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

초록

네 전사 인자, Oct4, Klf4의 이소성 표현을 통해 Sox2와 cMyc는 인간의 체세포의 세포는 소위 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs) ^1-4 발생 만능 상태로 변환 할 수 있습니다. 환자 별 iPSCs는 배아 줄기 세포 (ESCs)를 둘러싸고 가능한 면역 거부를 무시할 것이다 윤리적 문제를 부족합니다. 따라서, iPSCs는 질병 모델링 연구, 약리 화합물의 심사 및 재생 치료 ^5에 대한 상당한 주목을 받고있다.

우리는 야마나카의 요인 ⁶ 인코딩 한 excisable polycistronic lentiviral의 줄기 세포 카세트 (STEMCCA)를 사용하여 서로 다른 폐 질환 환자에서 transgene 무료 인간 iPSCs의 생성을 보여 주었다. 이 iPSC 라인은 피부 섬유 아세포, 재 프로그램에 사용되는 가장 일반적인 세​​포 유형에서 생성되었습니다. 일반적으로 섬유 아세포를 취득하면 세포의 확장에 의한 펀치 생검은 다음 피부가 필요합니다몇 구절에 대한 문화에 s입니다. 중요한 것은 그룹의 수는 iPSCs ^7-9으로 인간의 말초 혈액 세포의 재 프로그래밍을보고했습니다. 한 연구에서, STEMCCA 벡터의 Tet의 inducible 버전은 혈액 세포가 동시에 반대 테트라 사이클린 transactivator 인코딩 constitutively 활성화 lentivirus에 감염 될 필요하는 ⁹ 고용되었다. 섬유 아세포는 대조적으로, 말초 혈 세포는 크게 환자의 불편 함과 고통을 감소 최소한 침략 절차를 통해 수령하실 수 있습니다. 제정 한 excisable 벡터를 사용하여 혈액 세포를 재 프로그램에 대한 간단하고 효과적인 프로토콜은 광범위한 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 응용을 촉진 할 수 있습니다. 또한, 주변 혈액 세포의 재 프로그래밍 피부 biopsies을 피할 수 (예. 탈선은 흉터) 또는 인해 기존의 질병 상태 preventi에해야하는 개인의 iPSCs의 생성을 허용펀치 biopsies에 NG 액세스 할 수 있습니다.

여기 constitutively 4 요소를 표현하는 하나의 floxed - excisable lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)에서 인간 iPSCs의 생성을위한 프로토콜을 보여줍니다. 갓 수집하거나 해동 PBMCs은 STEMCCA의 lentivirus와 transduced되기 전에 같은 매체를 포함하는 아스코르브 산에 ^{10,11 설명} 구일, SCF, IGF-1, IL-3와 EPO에 대해 확장됩니다. 셀은 다음 MEFs에 도금되어 있으며 ESC와 같은 식민지 두 주 감염 후 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 선택한 클론을 확장하고 pluripotency 마커 SSEA-4, Tra-1-60 Tra-1-81 표현으로 테스트됩니다. 이 프로토콜은 혈액의 쉽게 접근 할 4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 신뢰할 수있는 방법론을 제공, 간단한 튼튼하고 매우 일치합니다.

프로토콜

1. 말초 혈 Mononuclear 세포 (PBMCs)의 절연 및 확장

DAY 0

1. 나트륨 시트르산과 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브에 말초 혈 4 ML을 그립니다. 관에게 8-10 번 반전하고 실온에서 30 분에 1,800 XG에 원심 분리기. 이상적으로,이 단계는 컬렉션의 2 시간 이내에 완료해야합니다.
2. 멸균 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 버피 코트 (겔 장벽과 플라즈마 사이의 세포 층)을 pipetting하여 mononuclear 세포 (MCS)를 수집합니다. 15 분 300 XG에 여러 시간과 원심 분리기 반전, 멸균 인산 버퍼 생리 (PBS)로 10 ML에 총 볼륨을 가져와.
3. 멸균 PBS의 10 ML에있는 세포를 Resuspend과 셀 카운트를 수행합니다. 10 분 300 XG에서 멸균 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 1 2x10 ⁶ 세포를 전송합니다.
4. 확장 매체 2 ML (EM) (에서 세포를 Resuspend 50 μg / ML Asco을 포함 QBSF-60 줄기 세포 중rbic 산성, 50 NG / ML SCF, 10 NG / ML IL-3, 2 U / ML EPO는 40 NG / ML IGF-1, 1 ....

결과

우리는 하나의 lentiviral 벡터를 사용하여 PBMCs에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 그림 1A는 프로토콜의 개략도를 보여줍니다. 피가 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 구연산과로 수집하고 있으며, 원심 분리 후, mononuclear 세포는 폴리 에스터 젤과 플라즈마 (버피 코트) (그림 1b) 사이의 인터페이스에서 수령하실 수 있습니다. 절연 PBMCs 그 다음 구일에 대한 문화에 확장됩니다. 그림 2는 세포가 현저하게 나누어하는 보여주는 일 0 일 9시 PBMCs를 비교합니다. STEMCCA의 lentivirus와 약 10-15일 후 전달은 작은 밝은 식민지의 모습은 여전히​​ 정의되지 않은 식민지의 형태로, 관찰된다. hESC 매체의 추가 후, hESC 같은 식민지 쉽게 (그림 2D) 식별 할 수 있습니다. 이러한 식민지의 일부는 기.......

토론

우리는 여기에서 갓 수집 말초 혈의 몇 밀리리터 격리 mononuclear 세포에서 인간 iPSCs를 생성하는 STEMCCA lentiviral 벡터의 사용을 설명합니다. 프로토콜은 먼 위치에서 획득 한 기증자 세포를 활용하면 냉동 PBMCs (버피 코트에서 직접 취득), 상당한 실질적인 의미의 상세를 재설정하는 데 사용할 수 있습니다. 재 프로그램의 유도하기 전에, 절연 PBMCs는 핵 재활 더받을 수있는 세포의 건강한 proliferating 인구를 렌더링 중요한 확장 단계를 받아야합니다. 이것은 쉽게 조혈 문화 조건에서 확장시 세포의 클러스터 '포도 같은의 무리'의 존재에 의해 관찰된다. 이하 5x10 ⁵ 세포 transduced 때, 세포는 MEFs를 포함하는 6 잘 접시의 하나 또는 두 개의 우물에 도금 할 수 있습니다. 우리는 25일 후 전달에 몇 가지 경우에 hESC 같은 식민지를 관찰하는 데 필요한 시간에 몇 가지 변화를 경험하고 있습니다.ROCK 억제제의 사용은 새로운 iPSC.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 구연산과	BD Biosciences	362760
QBSF-60 줄기 세포 중	품질 생물	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12,440
DMEM/F12	Invitrogen	11,330
FBS	애틀랜타 체액	S10250
넉 아웃 세럼 교체	Invitrogen	10,828
Primocin	Invivogen	개미-PM-2
펜 / 패 혈성	Invitrogen	15,140
L-글루타민	Invitrogen	25,030
비 필수 아미노산	Invitrogen	11,140
β-메르 캅토 에탄올	MP의 Biomedicals	190242
아스 코르 비 산	시그마	A4544
IGF-1	R & D 시스템	291-G1
IL-3	R & D 시스템	203-IL
SCF	R & D 시스템	255-SC
EPO	R & D 시스템	286-EP
Dexamethasone	시그마	D4902
Polybrene	시그마	H-9268
bFGF	R & D 시스템	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES 세포 마커 샘플 키트	Millipore	SCR002