Summary
De paramagnetiska egenskaper hemozoin används för att isolera sena stadier av
Abstract
Till skillnad från andra Plasmodium-arter, P. falciparum kan odlas i laboratoriet, vilket underlättar sin studie 1. Medan parasitemi uppnåtts kan nå ≈ 40%-gränsen, håller utredaren vanligtvis andelen på runt 10%. I många fall är det nödvändigt att isolera de parasit-innehållande röda blodkroppar (RBC) från de oinfekterade sådana, att berika kulturen och fortsätt med ett givet experiment.
När P. falciparum infekterar erytrocyt, försämrar parasiten och matar från hemoglobin 2, 3. Måste dock parasiten hantera en mycket giftig järninnehållande haem del 4, 5. Parasiten undgår dess toxicitet genom att omvandla haem till en inert kristallpolymer heter haemozoin 6, 7. Denna järn-innehållande molekylen lagras i sin födovakuolen och metallen i den har en oxidativ tillstånd som skiljer sig från den i haem 8. Den trevärt tillstånd av järn i haemozoin ger det en paramagnetisk fastighet frånvarande i oinfekterade erytrocyter. Eftersom de invaderande parasiten når mognad, ökar halten av haemozoin också 9, vilket skänker ytterligare paramagnetism om de senaste stadierna av P. falciparum inuti erytrocyt.
Baserat på denna paramagnetiska egendom, de senaste stadierna av P. falciparum infekterade-röda blodkroppar kan separeras genom att låta kulturen genom en kolonn innehållande magnetiska pärlor. Dessa pärlor blir magnetisk när kolumnerna innehåller dem placeras på en magnethållare. Infekterade RBC på grund av sin paramagnetism, kommer sedan att fångas inuti kolonnen, medan genomflödet kommer att innehålla, till största delen, oinfekterade erytrocyter och de som innehåller tidiga stadier av parasiten.
Här beskriver vi den metod att anrika populationen av sent stadium parasiter med magnetiska kolonner, som upprätthåller god parasit livskraft 10.Efter att ha utfört denna procedur kan den fria kulturen returneras till en inkubator för att återstående parasiter att fortsätta växa.
Protocol
Alla steg i protokollet, med undantag för centrifugering, bör genomföras i en huv för att hålla provet steril.
1. Sent stadium Isolering av P. falciparum-infekterade erytrocyter
Alla sena stadier av Plasmodium-infekterade erytrocyter kan separeras med denna metod, eftersom hemozoin som ger paramagnetism på parasiten, är en vanlig metabolit till släktet. En hög parasitemi (3-10%) i kultur rekommenderas att få bättre avkastning med detta protokoll, även om en typisk kultur kommer att innehålla 2-4% hematokrit (volym andel röda blodkroppar) och 1-8% parasitemi (andelen smittade röda blodkroppar). Parasiter kan odlas såsom beskrivits av Trager och Jansen 1.
- En enkel, flera delar installationen måste monteras för varje schizont isolering förfarande. För detta LS kolumner, en magnetisk MidiMACS separator och en MACS MultiStäll från Miltenyi Biotec (figur 1
- I ett separat rör (använd 50 ml conicals hela), blanda 23,2 ml RPMI 1640 och 750 pl av 7,5% natriumbikarbonat för att skapa arbete lösningen. Har ytterligare rör till hands för kassering och uppsamling av genomströmning av parasiten kulturen.
- Tillsätt 3 ml av arbetet lösningen till kolonnen till jämvikt den, och kassera genomflödet till ett rör.
- Tillsätt 8 ml av P. falciparum kulturen till kolonnen, och se till att så snart som den sista delen av arbetet lösningen har tryckts ut från kolonnen genom odlingen, är det mottagande röret ersättas av insamling en att börja återvinning av den obundna kulturen. Detta är nödvändigt för att undvika spädning av kulturen ytterligare.
- När flödet av kulturen genom kolonnen har upphört, tillsätt 1 ml av lösningen arbetet att driva de återstående RBC ut ur kolonnen.
- Tvättsteg: Lägg till ytterligare 3 ml av arbetet lösningen till kolonnen och samla den strömmande vätskan i "kassera" röret för att undvika utspädning av kulturen som sparas som genomströmning i det andra röret.
- Eluering: När 3 ml har passerat genom kolonnen, lossa den senare från stativet och placera den på toppen av en 15 ml tub.
- Återigen, tillsätt 3 ml arbete lösning till kolonnen. Detta steg eluerar erytrocyterna infekterade med sent stadium parasiter som fångade i pärlorna i kolonnen.
Obs: Vid denna punkt, och beroende på hur mycket som krävs av parasiter, starta en ny runda / s insamling, uppenbarligen inom de gränser för parasitemi i den ursprungliga kulturen. Kolonnen kan återanvändas så länge som flödet upprätthåller ett stabilt tillstånd.
- Koncentration av de uppsamlade parasiter: Centrifugera 15 ml tub innehållande eluatet under 5 minuter vid 150 xg vid rumstemperaturför att bilda en mörk pellet från parasiterade erytrocyter.
- Avlägsna supernatanten lämnar tillräckligt med vätska för att ta ett mycket litet prov och bestämma koncentrationen och total avkastning genom mikroskopi (se steg 2 nedan).
- I detta ögonblick, om isolering och fånga sent stadium parasiter uppnås tillfredsställande inkubera insamlade kulturen igen med färskt medium.
- Späd de uppsamlade parasiter i volymen och lösningen som behövs för efterföljande experiment.
2. Renhet och utbyte analys
- Verifiera koncentrationen av parasiter som erhållits genom användning av en hemocytometer och räkna under ett ljusmikroskop. Att räkna, lägga 10 pl av blandningen av de insamlade parasiter och media under täckglaset av hemocytometer. Räkna antalet parasiter i de fyra kvadranterna i hemocytometer och dividera det totala antalet med 4. Multiplicera den siffran med 10 4 för att erhålla koncentrationen av infekterade erythrocytes per ml.
Anmärkningar: a.) Koncentrationen av blandningen kommer att beslutas av användaren vid tidpunkten för att återsuspendera pelleten, genom att tillsätta mer eller mindre mediet. En föreslagen arbetsgrupp koncentration är 5,5 x 10 4 schizontes per il (detta uppnås normalt genom att tillsätta 100-300 il till de insamlade parasiter). Om 20 | il av denna koncentration tillsätts till en slutlig volym av 100 | il blandning av media och erytrocyter, en parasitemi av ca 1% i en typisk 4% hematokrit kulturen kommer att erhållas. b) Räkning under hemocytometer måste vara snabb, eftersom erytrocyterna börjar lys som provtagningsfiltren torkar inuti kammaren. Infekterade erytrocyter, vilket borde vara en majoritet, kommer att visa en mörk fläck på insidan, vilket skiljer dem från icke-infekterade sådana.
- Utför en tunnskikts-Giemsa-färgning för att bedöma renheten av samlingen genom fastställande av objektglasen mycket snabbt i 10% metanol, torka dem, och nedsänkning tfåll i en 20% lösning av Giemsa fläck späds med destillerat vatten. Färga objektglasen under 10 min, varefter de kan torkas av luft och undersöktes under mikroskop. En parasitemi väl över 70% bör kunna uppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2, är kulturen som passerar genom den magnetiska kolonnen visas före (A) och efter förfarandet (B). En till två infekterade erytrocyter ses vanligen på en 100 gångers förstoring fält som visas i figur 2, med pilarna som pekar till infekterade erytrocyter i figur 2A. I ett typiskt förfarande, som börjar med en kultur vid 5% parasitemi (figur 2A), producerar utförandet av detta förfarande vanligen erytrocyter med en parasitemi av 97% -100% (Figur 2B). Anrikning av parasitemi i storleksordningen 20X är lätt att uppnå, och flera passager av kulturen genom kolonnen kan uppnå en hög avkastning av P. falciparum sena-infekterade erytrocyter, som behövs eller önskas.
Figur 1.
Figur 2. A) Typisk 5% osynkroniserad parasit innehållet innan berikning. En 1 pl prov av parasiterna som samlats in genom denna magnetiska förfarande Giemsa färgas och visas på 100 gångers förstoring. En till tre infekterade erytrocyter ses vanligen i en viss fråga om omfattning (markerade med pilar). B) Parasit innehåll efter anrikning. En 1 pl prov av de insamlade parasiterna genom detta magnetiska förfarande Giemsa färgas och visas på 100 gångers förstoring. Parasitemi är nu 99%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro kulturer av malariaparasiten P. falciparum uppvisar en begränsad parasitemi, med mer än hälften av de röda blodkropparna oinfekterade på den högsta spridning punkt kultur. För de flesta forskningsområden experiment, är det önskvärt att endast arbeta med de infekterade erytrocyter. För detta ändamål är en separationsteknik nödvändigt att dela kulturen enligt infektion. Användbara metoder innefattar användningen av streptolysin O att permeabilisera och Lyze de oinfekterade RBC 11 och en serie av variationer av differentiella centrifugeringar som utnyttjar den olika densiteten hos de två grupperna. Vissa av dessa metoder innefattar gelatin flotation 12 och användningen av Plasmion 13 men den vanligaste ämne som används för att skapa skikt av olika densiteter för att fånga de olika röda blodkroppar är densitetsgradient mediet Percoll, vilket kan utgöra en viss toxicitet för parasiter 14.
Vi hahar använt en teknik som först beskrivits av Paul och analyserades vidare genom Trang 15, 16, baserat på den paramagnetiska egenskapen haemozoin, en inert kristall som produceras genom nedbrytning av hemoglobin genom parasiten. Som rapporterats på annat håll av vår grupp, är denna metod icke-invasiv och verkar inte påverka parasiten, vilket framgår av den normala efterbehandling förmåga invasion av färska erytrocyter, jämfört med invasionen andelen parasiter utsätts för anrikning av Percoll gradientcentrifugering 10, 14, 17. Utöver denna fördel, om kulturen har ett stort antal infekterade erytrocyter, kan det vara mer än en samling steg, eftersom den bindande kapaciteten hos kolonnen kan vara inte tillräckligt för att hålla allt parasiten innehåll på en gång. Därför kan den uppsamlade kulturen passera genom kolonnen flera gånger tills tillräckligt parasiter samlas för en given efterföljande experiment.
Insamlingen av P. falciparum paraplatser med användning av magnetiska pärlor är enkel, snabb, och kräver endast en bordscentrifug, till skillnad från de tekniker differentiell centrifugering som behöver en stor och kostsam golv centrifug och som också kräver noggrann hantering av proverna.
Vissa tillämpningar av kultur anrikning är användningen av parasiterna i invasionen analyser där utgångs parasitemi är rigoröst kontrolleras i samtliga prover, användningen av de insamlade parasiterna att extrahera hemozoin, den inerta kristallen gemensam för Plasmodium familjen, användningen av en hög densitet av parasiter att förbereda för mikroskopi analys, och utvinning av DNA av endast parasiter när de blandas med andra blodceller. Denna sista programmet skulle kunna användas för att analysera kliniska prover genetiskt identifiera stam av malaria de är smittade med och fatta ett välgrundat terapeutisk plan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av bidrag PRB-009 till CS och en doktorsexamen stipendium till LC, från Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J.
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
