Summary
一个简单而可靠的可视化和量化技术，气道纤毛的蠕动和纤毛产生流量使用小鼠气管。这种技术可以被修改，以确定如何广泛的因素，包括药物制剂，遗传因素，环境暴露，和/或机械因素，如粘液负载影响纤毛运动。
Abstract
体外小鼠气道上皮细胞成像技术定量分析洞察黏液纤毛清除功能的重要运动纤毛功能已经确立。刚收获的小鼠气管，通过纵向切开气管肌肉和安装在浅壁室玻璃底的菜。其长轴沿气管样品趁气管肌肉纵向卷曲。这使得成像的纤毛运动，沿着整个气管长度在纵断面图。使用微分干涉显微镜和一个高速的数码相机得到允许纤毛摆动频率的定量分析和睫状波形画在200帧/秒。在成像过程中添加的荧光珠，纤毛产生的流体流动也可以被确定。协议时间跨越约30分钟，5分钟5-10分钟的样品制备室安装，和10-15分钟电视显微镜。
Introduction
阐明遗传和环境因素会影响粘液纤毛清除功能和肺的健康1，气道上皮细胞的运动纤毛功能分析实验是重要的。成像的小鼠气道上皮细胞的简单的协议，开发提供了一种有效的方法来审问呼吸道纤毛运动的突变体和基因敲除小鼠模型，并在小鼠气管组织解剖和体外成像与高清晰度电视显微镜，呼吸道纤毛蠕动只需要基本技能。此协议在建立和完善了大规模的鼠标诱变屏幕，运动纤毛功能允许快速评估（纤毛摆动频率，纤毛摆动形状，纤毛产生的流量）患有先天性心脏疾病的伴有内脏异位2-5的突变体。
目前的技 术，用于研究呼吸道纤毛蠕动，可以分组为急性体外类型或离子蒙古包长期在体外实验方法。急性实验包括人/鼻气道活检刷6,7 体外可视化和分析简单的横向气道第8。 在体外细胞培养方法利用各种技术，以产生分化的纤毛上皮细胞，如空气中的液体界面的文化或气悬浮培养9-11张。然而，这些气道上皮reciliation的技术要求非常显著的投资在时间和培训之前任何可用的纤毛上皮细胞的实验（4-6周9,10）。虽然通常用于人体临床研究急性呼吸道上皮刷活检体外分析，这种方法是不是可以使用小鼠的研究，由于加剧了机械组织损伤12。
在这个协议中所述的技术分析的谅解备忘录ê气管的气道上皮细胞不仅是简单的执行，但它不需要特殊的解剖技能，也没有任何专门的设备除了那些电视显微镜成像标准。这个简单的协议有许多优点。首先，小鼠气管组织收获是快速和容易执行，它允许大量的小鼠气道纤毛功能快速评估。这可以包括急性分析不同在体外治疗的短期效果。其次，作为体外技术，气道纤毛上皮细胞仍然连接到相关的支持组织和，从而保留相关的细胞信号通路。因此，在比较， 在体外 reciliated的气道上皮细胞，该制剂在体内的组织环境是一个更好的代表性的自然。第三，该协议允许收购了一些不同的量化参数，可以提供客观的评估运动纤毛f油膏。最后，在对比其他流动呼吸道纤毛可视化的方法，这个协议允许的纤毛纤毛摆动方向直角可视化，允许纵断面图中的纤毛，是最佳的高分辨率成像的纤毛摆动和metachronal的波代。
这个协议可以修改了一些方法来解决了广泛的实验需求等作用的药物制剂，遗传因素，环境暴露，和/或机械因素，如粘液负载上呼吸道纤毛功能和生成/维护呼吸道纤毛摆动和波传播metachronal。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。试剂设置
1.1解剖和成像介质
Leibovitz的L-15培养基（L15）补充有FBS（10％）和青霉素 - 链霉素（100单位/ ml青霉素G钠和100微克/毫升硫酸链霉素）气管样品收获和成像过程中使用的。
2。浅寨文化商会大会
图1所示的腔室用来装气管组织。室的地板是玻璃见底35毫米培养皿。通过为0.3mm厚的硅薄片的玻璃盘上方放置一小片产生的腔室的顶部和侧面。在片材的边缘切断，以适应的圆底盘和中心进一步修整，以形成一个浅的中央腔室（见步骤2.1-2.3）。除在此组件中，一个18毫米的圆形盖玻片下产生一个封闭的腔室，适合于成像。
- 完全覆盖了18毫米的圆形玻璃盖玻片0.3毫米厚的硅薄片的正方形。
- 随着标准的锐性剥离剪刀剪掉多余的矽胶片，从盖玻片的边缘，（矽胶片层在一个圆形的）。
- 随着锋利的手术刀切出来，取出矽胶片（约10平方毫米），从中间盖盖玻片（由此形成的顶部和两侧的成像室）中心广场。
3。气管收获和准备
- 安乐死小鼠根据本地机构动物保健和使用委员会和/或政府指引，并有足够的L15媒体，泅组织（作者只是在出生前在妊娠16.5天的小鼠，通过对去除气管成一个标准的塑料35毫米培养皿新生儿，新生儿和成人的动物2）。
- 删除非气管内有相关的组织附着到外的气管使用钝性分离。
- 取出喉与横向切割正下方的环状软骨使用微清扫剪刀（ 图2A中 ，第1行）。
- 拆下的左，右主支气管分支与的横向切割正上方的隆突使用微清扫剪刀（ 图2A中 ，第2行）。
- 轻轻握住气管用细镊子和冲洗管腔2-3次〜1毫升的沐浴L15介质与P1000和P1000的Pipetman尖清除粘液和血液。
- 切出3-4环段气管采用横向切割，微解剖剪刀（ 图2B，1号线）。
- 通过使用微解剖剪刀（ 图2B 2号线），这短短的气管段气管肌肉的中间纵向切开。
- 通过纵向切开气管软骨环的中间使用微解剖剪刀（ 图2C 如图2D所示的单节）。
4。纤毛成像
- 传输气管组织流明段，面朝下，到中间的L-15培养基100-200微升35毫米的玻璃底培养皿。
- 为了量化纤毛生成的流洗澡气管组织样品（〜1×10 11颗粒/ ml或20微升/毫升的Fluoresbrite 2.5％的微球悬浮液的水溶液）的L-15培养基中，添加少量荧光0.20微米的微球。
- 将预先制备的（见上述第1至第3步骤）上方的气管样品硅胶片的一面朝下的摄像室，位于浅的壁形成的腔室由窗口矽胶片切成在中间气管样品（ 图1 ）。
- 盖玻片上轻轻向下推以固定到位，并消除任何多余的L-15媒体从边缘全光照GA尖P1000和P1000的Pipetman。
- 安装35毫米的玻璃底培养皿和气管样本100X客观和DIC的光学显微镜上。
- 使用一个高速照相机和电影采集软件收集电影纤毛蠕动在200 +帧每秒沿气管纤毛上皮细胞的卷曲边缘气管肌肉（ 图2D概述箱，例如E：静止图像录制电影） （ 补充影片1）。
- 使用FITC啶成像和低光CCD摄像头（见上面的设备清单），收集荧光微球运动的电影，整个气管纤毛上皮表面的纤毛产生的流量（ 电影2）允许后定量。
5。定量纤毛运动
- 负载DIC成像ImageJ软件程序包，由I所描述的技术的电影转换成泉德拉蒙德13使用直线工具绘制光栅线穿越跳动的纤毛。 A“”这条线重新划分产生kymograph的跨线的纤毛运动产生波浪纹型图像。每个波峰之间的像素数是他们测量（一个像素的=一部电影帧），然后可以计算每分钟节拍数（ 即赫兹）。
- 为了测量纤毛产生的流量负荷荧光珠电影成的ImageJ软件包，并使用的MTrackJ插件14手动跟踪整个气管上皮细胞表面的荧光珠，并让软件生成钢丝速度和方向性跟踪的每个胎圈。
应小心，当使用荧光珠到量化流作为打浆纤毛的距离，可以强烈地影响测量流量的大小。珠补充运动电影2，这是一个很好的例子。在这个例子中的胎圈打浆纤毛的表面移动速度很快，并显着下降的有孔玻璃珠进一步相差在入浴媒体。为了控制这个问题，应该只收集珠描记在一个固定的距离，在所有样品中的纤毛上皮细胞，以允许正确地进行比较。最后，取得对流体流动的有代表性的数据，有孔玻璃珠应尽可能长的时间的跟踪，我们优选使用用于计算流体流动，覆盖10 +纤毛细胞的胎圈轨道。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
控制呼吸道纤毛应清晰可见，看到击败以协调的方式（ 补充电影1，电影播放放缓至15％的实际时间），纤毛摆动的方向（ 补充电影2，电影播放100％有明显的流实时）。定量的纤毛电影应该产生类似的结果如图3所示。未能收集高速DIC电影使纤毛摆动频率的定量分析（ 图3C），纤毛摆动形状的定性评估，并给出了良好的图象，而荧光珠的跟踪允许纤毛产生流速的测量（ 图3D）和方向性（ 图3E）。
我们使用的方向性的直线流，得到一个索引。方向性除以计算的总位移的荧光珠（ 即最短旅游之间的距离的跟踪的开始点和结束点的距离）由荧光珠在整个跟踪移动。因此，在一条直线上移动的荧光珠的一个有方向性的荧光珠蜿蜒广泛的直线路径，而将有一个方向性远小于1。
成像样品长达一个小时，没有任何明显的改变纤毛摆动功能。
图1。扩大培养皿设置和气管样品定位等角视图。注：盖玻片，硅胶板应装配之前把气管样品放入培养皿。
图2的小鼠气管夹层使用此协议，从一个完整的气管（A）到最终的成像结果（E）（见程序步骤3.2-3.8解释标签）为例。在AD中的比例尺为500微米。在E的比例尺为25μm。
图3。使用野生型小鼠气管样本编制由协议获得预期结果。（A）单帧从一个高速的DIC的电影（见补充对代表DIC电影的电影1）（B）的运动轨迹。四个横跨surfa荧光珠ce的气管上皮细胞样品（见补充电影2荧光电影为代表）（C）纤毛摆动频率量化高速DIC的纤毛蠕动电影组（n = 41随机点测量从6小鼠气管）（D）的流动速度（E）流动的方向性量化跟踪荧光珠运动在表面上的气管上皮细胞样本组（n = 31荧光珠描6小鼠气管）。数据平均值±SEM流离失所。比例尺为10μm。
补充 DIC电影动画1。纤毛摆动形状和纤毛产生流量观察使用一个野生型小鼠气管样品。收集电影200帧，播放时为30 fps。 点击这里观看电影 。
补充电影电影纤毛GEnerated流过一个野生型小鼠气管样本，采用0.20微米的荧光微球和落射荧光显微镜。收集和播放电影是每秒15帧。 点击这里观看电影 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
测量纤毛摆动频率（CBF）是比较容易的使用高倍显微镜的目标和快速的图像采集硬件13,15，并解释了为什么脑血流量测量形成的基础研究在健康和疾病中的黏液纤毛清除。然而，当脑血流量测量是必不可少的了解黏液纤毛清除，单独测量CBF睫状肌产生的流量和纤毛摆动波形，这两者都是比较难以衡量，往往被忽视的重要性，忽略了潜在的，可能没有相关的脑血流量。例如如何增加脑血流量增加睫状肌产生的流量可能不符合DNAH11突变在一些患者。 DNAH11轴丝动力蛋白重链蛋白质，在已经报道的同时引起运动机能亢进（较快）纤毛运动和的纤毛摆动异常波形，预计会导致粘液纤毛清除的问题，16突变。 significant的优点是，它允许我们的协议成直角的纤毛的纤毛摆动方向的方便的可视化，使产生的流体流过的表面的纵断面图，是最适合于高分辨率成像的纤毛摆动形状和纤毛的纤毛击败纤毛，从而使纤毛摆动波形和/或纤毛CBF与直接比较产生的流量在一个单一的样本。
这种技术的另一个优点是，纤毛新鲜收获的气管保留他们的能力，以协调的方式击败的呼吸道上皮细胞的整个表面，从而使之易于CBF和纤毛生成的流之间的相关性。这种协调纤毛运动中没有观察到reciliating小鼠气管上皮文化，往往不佳纤毛虫纤毛摆动，并显示在任意方向9,10。协调的纤毛摆动，观察气管上皮细胞技术在这里可以提供我的手段nterrogate机制调节纤毛摆动协调和黏液纤毛清除其潜在的作用。
研究此协议将是最具挑战性的部分气管准备，包括脂肪和结缔组织清除气管表面（ 图2a），通过中间的气管肌肉（ 图2b中 ，2号线）和纵向切割。我们发现，使用良好的微解剖剪刀组织结算及后续trachealisotomy的两个至关重要。此外，我们发现它更容易使用的下部气管前，气管隆突分叉成左，右主支气管气管肌肉是最广泛的。然而，有足够的经验，可以成功地使用任意长度的气管，或什至主支气管纤毛的蠕动和纤毛产生流量生成高品质的电影。
可能的技术与此协议相关的问题，包括在成像过程中和/或样品不能够被带入焦点移动气管样品。这两个问题可以出现如果使用过多的L-15溶液中加入与样品和/或成像室盖玻片没有牢固地压下，这导致样品内的盖玻片的导致样本移动的腔室或样品漂浮漂浮以上所述焦平面重点是不可能的。为了避免这种情况，重要的是要尝试用于装载每个气管样品的液体的量最小化。
这种技术是一种可能的限制，测量纤毛产生的流体流动可能无法完全匹配体内纤毛传输。我们发现，产生的纤毛〜10微米/秒的流量是显着小于100微米/秒纤毛传输报告使用在体内小鼠气管17。这种差异可能是由于被淹没在媒体作为奥普纤毛osed简单地移动跨越气 - 液界面的一层薄薄的粘液。然而，这种方法具有相对比较不同样本之间的纤毛运动的伟大事业。
应当指出，虽然这里介绍的实验技术和数据是在室温下进行，温度本身起到了显着的作用，在调节纤毛活动。 CBF在人类鼻腔和气管样本被认为是线性相关，随温度5-20°C之间，在20-45°C 18之间的CBF看到小幅增加。在小鼠呼吸道样本（未发表意见），我们看到了类似的温度和CBF之间的关系。因此，虽然我们记录纤毛活动在室温下快速评估可能存在的缺陷，纤毛运动的新的突变小鼠，我们也培育一些样品在37℃在生理条件下确定纤毛活动。要做到这一点的标准显微镜孵化CH琥珀可以被用来维持样品在37℃。
简单的修改，此协议将使一个强大的工具，以评估气道纤毛活动受到了广泛的因素，如药物制剂的作用，温度，遗传因素，环境暴露和/或机械因素，如粘液负载调节气道纤毛功能和呼吸道纤毛摆动的生成/维护。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
该项目是由NIH授予U01HL098180从支持国家心脏，肺和血液研究所。内容完全是作者的责任，并不一定代表官方意见，国家心脏，肺和血液研究所或国立卫生研究院
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I.
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
