Summary
Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.
Abstract
Mukosiliyer temizleme fonksiyonu içgörü için önemli hareketli kirpikler fonksiyonunun kantitatif analiz için görüntüleme fare havayolu epitel için bir ex vivo tekniği kurulmuştur. Taze hasat fare trakea trachealis kas ile uzunlamasına kesilir ve cam dipli çanak sığ bir duvarlı odasında monte edilir. Trakea örnek uzunlamasına kıvrılmasına trachealis kas yararlanmak için uzun ekseni boyunca konumlandırılmış. Bu tüm trakea uzunluğu boyunca profil görünümünde siliyer hareket görüntüleme sağlar. 200 kare / sn video kirpikler yendi frekans ve siliyer dalga kantitatif analiz sağlamak için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ve bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında floresan boncuk eklenmesiyle, kirpikler üretilen sıvı akışı da belirlenebilir. Protokol süresi odası hazırlanması için 5 dakika ile yaklaşık 30 dakika,, örnek için 5-10 dakika açıklıklımontaj ve videomikroskopi için 10-15 dk.
Introduction
Hava yolu epitel içinde hareketli kirpikler fonksiyon analizi mukosiliyer temizleme ve akciğer sağlığı 1 etkileyebilir genetik ve çevresel faktörlerin ortaya çıkması için deneysel önemlidir. Görüntüleme fare havayolu epitel için geliştirilen basit bir protokol mutant ve nakavt fare modellerinde hava yolu kirpikler motilite sorgulamak için etkili bir yöntem sağlar ve fare trakeal doku diseksiyonu ve yüksek çözünürlüklü videomikroskopi ile hava yolu kirpikler motilite ex vivo görüntüleme sadece temel becerileri gerektirir. Bu protokol heterotaksi 2-5 ile ilişkili konjenital kalp hastalığı olan mutantlar hareketli kirpikler fonksiyonunun hızlı değerlendirme (kirpikler yendi frekans, kirpikler yendi şekli, kirpikler oluşturulan akış) izin vermek için büyük çaplı bir fare mutagenez ekran sırasında kurulan ve rafine oldu.
Havayolu kirpikler hareketliliği incelemek için kullanılan mevcut tekniklerin akut ex vivo türü veya boylam ya toplanabilirin vitro deneysel yaklaşımlar ger terim. Akut deneyler ex vivo insan burun / hava yolu fırça biyopsi görselleştirme 6,7 ve basit enine havayolu bölüm 8 analizini içerir. In vitro yaklaşımlar, hava sıvı arayüzü kültürler ya da hava yolu süspansiyon kültürleri 9-11 gibi farklı siliyalı epitel yaprak oluşturmak için çeşitli hücre kültürü teknikleri kullanmaktadır. Herhangi bir kullanılabilir siliyalı epitel hücreleri deney (4-6 hafta 9,10) için üretilen önce Ancak, bu hava yolu epitel reciliation teknikleri zaman ve eğitim çok önemli bir yatırım gerektirir. Solunum yolu epitel fırça biyopsilerin akut ex vivo analiz yaygın insan klinik çalışmalar için kullanılır, bu yöntem şiddetlenir mekanik doku yaralanması 12 bağlı fare çalışmalarda kullanılabilir değildir.
Mutabakatnamelere analizi için bu protokolde belirtilen tekniğiE trakea hava yolu epitel çalıştırmak için sadece basit değildir, ama özel bir diseksiyon becerileri ne videomikroskopi tarafından görüntüleme için bu standart dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Bu protokol için pek çok avantajı vardır. Fare trakea doku hasat gerçekleştirmek için hızlı ve kolay olduğu gibi, önce, farelerin, çok sayıda hava yolu kirpikler fonksiyonu hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için izin verir. Bu in vitro tedavi farklı kısa vadeli etkileri akut analizi içerebilir. İkinci olarak, bir ex vivo tekniği olan, siliyalı hava yolu epitel bu destek dokularını altta yatan bağlı kalır ve böylece ilgili hücre sinyal yolları korumak. Bu nedenle in vitro reciliated solunum yolu epitel hücrelerinde ile karşılaştırıldığında, bu hazırlık vivo doku ortamda doğal daha iyi bir temsilidir. Üçüncü olarak, bu protokol sağlayan hareketli kirpikler f değerlendirilmesini sağlar farklı kantitatif bir dizi parametre edinimimerhem. Son olarak, havayolu kirpikler görselleştirme için diğer mevcut yöntemlerle aksine, bu protokol kirpikler yendi yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve metachronal dalga üretimi için en uygun olan kirpikler Profil görünümü sağlayan, kirpikler yendi yönüne dik açılarda kirpikler görselleştirme sağlar .
Bu protokol, farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya hava yolu kirpikler fonksiyonu ve üretim / bakım gibi mukus yük gibi mekanik faktörlerin rolü deneysel ihtiyaçlarını geniş bir yelpazede ele yolları bir dizi değiştirilebilir havayolu kirpikler yendi ve metachronal dalga yayılımı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktifler Kurulum
1.1 Diseksiyon ve Görüntüleme Orta
Leibovitz L-15 ortamına (L15) trakea örneklerin hasat hem de görüntüleme sırasında kullanılan FBS (% 10) ve Penisilin-Streptomisin (100 birim / penisilin G sodyum ve streptomisin sülfat, 100 mg / ml arasında mi) ile ilave edilir.
2. Sığ Kaleli Kültür Odası Meclis
Trakea doku tutmak için kullanılan haznesi Şekil 1 'de gösterilmiştir. Odanın zemini cam 35 mm kültür çanak dip olduğunu. Odasının üst ve yan cam tabak içinde 0.3 mm kalınlığında silikon kaplama küçük bir parça yerleştirilerek oluşturulur. Sayfanın kenarı yuvarlak alt çanak uyacak şekilde kesilir ve merkez daha (adım 2.1-2.3 bakınız) sığ bir merkezi oda oluşturmak için kesilir. Bu montaj üzerine, bir 18 mm yuvarlak cam kapak kayma görüntüleme için uygun bir kapalı odasına oluşturmak için yerleştirilir.
- Tamamen 0,3 mm kalınlığında silikon kaplama bir kare ile bir 18 mm yuvarlak cam kapak kayma kapsamaktadır.
- Standart keskin diseksiyon makas kapak kayma (silikon kaplama dairesel bir tabaka ile sonuçlanan) kenarında gelen aşırı silikon kaplama keserek ile.
- Keskin bir neşter kesip ve kapalı kapak kayma (böylece görüntüleme odasının üst ve yan oluşturan) ortasından silikon kaplama (yaklaşık 10 mm kare) merkezi bir kare kaldırmak ile.
3. Trakea Hasat ve Hazırlık
- Yerel kurumsal hayvan bakımı uygun olarak fareler Euthanize ve komite ve / veya hükümet yönergeleri izleyin ve batığın doku kadar L15 medya (yazar kadar, sadece gebelik gün 16,5 doğum önce fareler kullanmış olan standart bir plastik 35 mm kültür çanak içine trakea çıkarın , yeni doğan yenidoğan ve yetişkin hayvanların 2).
- Dış bağlı olmayan trakea ilişkili doku çıkarmakkünt diseksiyon kullanarak trakea.
- Sadece mikro diseksiyon makas (Şekil 2A, hat 1) kullanarak krikoid kıkırdak altında enine kesim ile gırtlak çıkarın.
- Mikro diseksiyon makas (Şekil 2A, hat 2) ile sadece karina üzerinde enine kesim ile sol ve sağ ana bronş dalları çıkarın.
- Yavaşça ince forseps ile trakea tutun ve herhangi bir mukus ve kan temizlemek için bir P1000 Pipetman ve P1000 ucu ile banyo L15 orta ~ 1 ml lümen 2-3 kez yıkayın.
- Mikro diseksiyon makas (Şekil 2B, hat 1) ile enine bir kesik ile trakea bir 3-4 halka kesimi kesin.
- Mikro diseksiyon makas (Şekil 2B, hat 2) kullanarak bu kısa trakea segmentinin trachealis kas ortasından uzunlamasına kesin.
- Mikro diseksiyon makas (Şekil 2C kullanarak trakea kıkırdak halkaları ortasından uzunlamasına kesilir Şekil 2B'de gösterildiği gibi) terk>, çizgi).
4. Kirpikler Görüntüleme
- Transferi trakea doku parçaları, L-15 orta 100-200 ul ile 35 mm cam alt kültür çanak ortasında üzerine aşağı lümen tarafı,.
- Kirpikler oluşturulan akış trakea doku örneği (1 x 10 ~ 11 partikül / ml ya da 2.5% sulu Fluoresbrite Mikro-kürecik süspansiyonu, 20 ul / ml), yıkanan L-15 ortamına floresan 0.20 um arasında bir miktar mikro eklemek ölçmek için kullanılabilir.
- Silikon kaplama oyulmuş pencere oluşturduğu sığ duvarlı odanın ortasında bulunan trakea örnek ile, görüntüleme odasının aşağı trakea örnek silikon levha tarafında üzerine (yukarıda 1-3 Usul bakınız) önceden hazırlanmış yerleştirin (Şekil 1 .)
- Yavaşça yerine sabitlemek için lamel aşağı doğru itin ve kenarları istimal emdiği L-15 ortamı çıkarınga P1000 ucu ve P1000 Pipetman.
- 100X objektif ve DIC optik ile bir ters mikroskop 35 mm cam alt kültür çanak ve trakea örnek monte edin.
- Yüksek hızlı bir kamera ve film satın alma yazılımı kullanarak 200 kirpikler motilite film toplamak + en siliyalı trakeal epitel boyunca saniye başına kare (Şekil 2D kutusu, E Outlined: Kayıtlı filmden örnek hareketsiz görüntü) trachealis kas kenarı kıvrılmış (Ek Film 1).
- FITC epifluorescent görüntüleme ve düşük ışık CCD kamera (Yukarıdaki donanım listesine bakın) kullanarak, kirpikler oluşturulan akış (Ek Movie 2) daha sonra miktar izin vermek için siliyalı trakeal epitel yüzeyi boyunca floresan mikro-hareketin film toplamak.
5. Cilia Motilite kantitasyonu
- ImageJ yazılım paketi içine DIC görüntülü film yüklemek ve I tarafından tarif edilen teknik takip edilmekain Drummond 13 yenerek kirpikler geçen bir raster çizgi çizmek için satırı aracını kullanın. Bu hattın bir "reslice" hat boyunca kirpikler hareketi bir dalga üreten bir kymograph tipi görüntü oluşturur. Her dalga tepe arasındaki piksel sayısı onları ölçülen (bir piksel = bir film karesini) dakikada atım (yani Hz) sayısı hesaplanabilir hangi değil.
- ImageJ yazılım paketi içine kirpikler oluşturulan akış yük floresan boncuk film ölçmek ve el trakea epitel yüzeyi boyunca floresan boncuk izlemek ve yazılım izlenen her boncuk için boncuk hız ve yön oluşturmak izin MTrackJ eklenti 14 kullanın.
Dayak kirpikler mesafe olarak akışını ölçmek için güçlü ölçülen akış büyüklüğü etkileyebilir floresan boncuk kullanırken dikkat edilmelidir. Ek Film 2 boncuk hareketi bu bir iyi bir örnektir. Bu örnekte boncuktahareket dayak kirpikler yüzeyinde hızlı ve önemli ölçüde daha uzakta banyo medyada boncuk için devre dışı bırakır. Bu kontrol etmek için, boncuk iz tek doğru karşılaştırma yapılmasına izin vermek için bütün örneklerde silli epitel üzerinde sabit bir mesafede toplanmalıdır. Son olarak, sıvı akışı temsil verilerini elde etmek, boncuk mümkün olduğunca uzun süre için takip edilmelidir, biz sıvı akışı hesaplamak için 10 + siliyalı hücreleri kapsayacak boncuk parça kullanmayı tercih.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Film oynatma% 100; kirpikler yendi (Ek Film 2 yönünde fark akışı ile; Kontrol havayolu kirpikler açıkça görülebilir ve koordineli bir şekilde (film oynatma 15% gerçek zamanlı için yavaşlar Ek Film 1) yenmek için görülen olmalıdır ) gerçek zamanlı. Kirpikler film kantitasyonu, Şekil 3'te görülen benzer sonuçlar vermesi gerekir. Floresan boncuk izleme kirpikler oluşturulan akış hızı ölçümü (Şekil 3D) sağlar ise yüksek hızlı DIC film toplanması, olası kirpikler yendi frekans (Şekil 3C) miktarının yapar ve kirpikler yendi şekli nitel değerlendirilmesi için iyi bir görüntü verir ve yön (Şekil 3E).
Biz lineer akışı bir dizin vermek için yön kullanın. Yönü bir floresan boncuk (yani en kısa tarafından katedilen toplam deplasman bölünmesiyle hesaplanırmesafe kadar izleme başlangıç ve bitiş noktaları) tüm iz üzerinde floresan boncuk hareket arasındaki mesafe. Düz yoldan yoğun kıvrımlı bir floresan boncuk 1 çok daha az bir yönü olacaktır Böylece, düz bir çizgide hareket eden bir floresan boncuk birinin bir yönü olurdu.
Biz kirpikler yendi fonksiyonu herhangi bir fark değişiklik dışarı ile bir saat için numune kadar görüntülü var.
Şekil 1. Kültür çanak kurulum ve trakea örnek konumlandırma Genişletilmiş izometrik görünümü. Not: lamel ve silikon tabaka kültür çanak içine trakea örnek koyarak önce monte edilmelidir.
Şekil 2. (Prosedüre bakın etiket açıklama için 3.2-3.8 adımları) nihai görüntülü sonuç (E) sağlam bir trakea (A) başlayarak, bu protokolü kullanarak bir fare trakea diseksiyon örneği. MS Ölçek bar 500 mikron temsil eder. E ölçek çubuğu 25 mikron temsil eder.
Şekil 3. Beklenen sonuçlar protokol tarafından hazırlanan vahşi bir fare trakea örnek kullanılarak elde Burada anlatılan. Yüksek hızlı DIC film (temsilci DIC film için ek film 1 bak) (A) Tek kare. (B) Hareket parça kaldırmak üzere, karşısında dört floresan boncukBir trakeal epitel örnek ce (temsilcisi floresan film için ek film 2). (C) Cilia yendi frekans yüksek hızlı DIC kirpikler motilite filmleri (6 fare tracheas gelen n = 41 rasgele bir nokta ölçüm) den sayılabilir. (D) Akış hızı ve (E) Akış yönü trakeal epitel örnekleri (6 fare tracheas gelen n = 31 floresan boncuk iz) yüzey üzerinde floresan boncuk hareket izlemesini sayılabilir. Veriler ortalama ± SEM olarak değiştirir. Ölçek çubukları 10 mm.
Ek Film 1. Kirpikler yendi şekil ve kirpikler oluşturulan akış gösteren DIC film wild tip fare trakea örnek kullanarak görülmektedir. Oynatma 30 fps iken film, 200 fps toplanmıştır. filmi görmek için buraya tıklayın .
Ek Movie 2. Kirpikler ge Moviefloresan mikroküreler ve epifluorescent mikroskopi 0.20 mikron kullanarak wild tip fare trakea örnek karşısında nerated akışı. Film koleksiyonu ve oyun geri 15 fps olduğunu. filmi görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kirpikler yendi frekans ölçümü (CBF) yüksek güç mikroskobu amaç ve hızlı görüntü elde etme donanım 13,15 kullanarak nispeten kolaydır, ve CBF ölçümleri sağlık ve hastalık sırasında mukosiliyer klerens araştıran en çalışmaların temelini oluşturan açıklıyor. CBF ölçüm tek başına CBF mukosiliyer temizleme, ölçüm anlamak için gereklidir Ancak, siliyer oluşturulan akış ve ölçmek için daha zor genellikle göz ardı edilir, her ikisi de kirpikler yendi dalga, hem de temel önemi yok sayar ve CBF ile ilişkili olmayabilir. Kan akımında artış siliyer oluşturulan akışı ile uygun olmayabilir artan bir örnek DNAH11 mutasyonları olan bazı hastalarda görülür. DNAH11 bir axonemal dynein ağır zincir protein, hem hiperkinetik (hızlı) siliyer yendi ve mukosiliyer mesafesi 16 ile sorunlara neden olduğu tahmin edilmektedir anormal kirpikler yendi dalga neden olduğu bildirilmiştir hangi mutasyonlar olduğunu. SignificaBizim protokol nt avantajı kirpikler yendi şekil ve kirpikler yüksek çözünürlüklü görüntüleme için en uygun kirpikler bir profil görünümü sağlayan, kirpikler yendi yönüne dik açılarda kirpikler kolay görselleştirme sağlar yüzeyi boyunca sıvı akışı oluşturulan olmasıdır böylece kirpikler yendi dalga formu ve / veya kirpikler ile CBF doğrudan karşılaştırmalı izin yenerek kirpikler, tek bir örnek içinde akış oluşturulur.
Bu tekniğin diğer bir avantajı bu kirpikler olan taze trakea böylece CBF ve kirpikler oluşturulan akış arasında kolay ilişki sağlayan, solunum epitel tüm yüzeyi boyunca koordineli bir şekilde yenmek için yeteneklerini korumak hasat. Bu koordineli siliyer hareket genellikle kötü silli ve rastgele yönlere 9,10 kirpikler yendi göstermek reciliating fare trakeal epitel kültür, görülmez. Trakeal epitel tekniği kullanılarak gözlenen koordineli siliyer yendi burada açıklanan i anlamına gelir sağlayabilirsiliyer yendi koordinasyon ve mukosiliyer klirensi potansiyel rolü düzenleyen mekanizmalar nterrogate.
Araştırmalar için bu protokolün en zor kısmı trakea yüzey (Şekil 2a) yağ ve bağ dokusu takas dahil olmak üzere, trakea hazırlık olması ve boyuna trachealis kas (Şekil 2b, hat 2) ortasından kesme olacaktır. Biz doku takas ve sonraki trachealisotomy her ikisi için gerekli iyi mikro diseksiyon makas kullanarak bulabilirsiniz. Ayrıca, burada trachealis kas geniş olduğu gibi daha kolay trakea sol ve sağ ana bronş üzere iki kola ayrılır karina sadece ön trakea alt bölümünü kullanmak için bulabilirsiniz. Ancak, yeterli deneyime sahip, trakea bir süre, ya da gerçekten birincil bronş kirpikler hareketliliği ve kirpikler akışı oluşturmak yüksek kaliteli filmler oluşturmak için başarılı bir şekilde kullanılabilir.
Teknik mümkünBu protokol ile ilgili sorunları görüntüleme ve / veya numune odak haline getirilmesi mümkün olmayan esnasında hareket trakea örnek içerir. L-15 çok fazla örnek ile birlikte ve / veya görüntüleme odasına kapak kayma güvenli basılı değildi ise bu sorunların her ikisi de ortaya çıkabilir, bu örnek örnek hareketi ile sonuçlanan kapak kayma odası veya yüzen örnek içinde dalgalanmaya neden olur Yukarıdaki odak düzlemi odak imkansız hale. Bunu önlemek için, her bir trakea örnek monte etmek için kullanılan sıvının miktarı denemek ve en aza indirmek için önemlidir.
Bu tekniğin olası bir sınırlama kirpikler üretilen sıvı akışı bu ölçüm tamamen in vivo mukosilier taşımacılığında uymayabilir olduğunu. ~ 10 mm / sn kirpikler elde akışının Bulgularımız in vivo fare trakea 17 kullanarak rapor 100 mm / sn mukosilier ulaşım çok daha azdır. Bu fark muhtemelen opp olarak medyada batık olan kirpikler nedeniylesadece hava-sıvı arayüzü üzerinden mukus ince bir tabaka hareketli osed. Bununla birlikte, bu yöntem, farklı numuneler arasında siliyer motilite göreceli bir karşılaştırma için büyük yararı vardır.
Burada sunulan deneysel teknik ve verileri oda sıcaklığında yürütülmüştür ise, kendi sıcaklığının kirpikler aktivitesi düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı unutulmamalıdır. Insan burun ve trakea örneklerinde CBF doğrusal 20-45 ° C 18 arasında görülen CBF küçük bir artış ile, 5-20 ° C arasındaki sıcaklık ile ilişkili görülmektedir. Biz fare havayolu örnekleri (yayınlanmamış gözlemler) sıcaklık ve CBF arasında benzer bir ilişki görüyoruz. Yeni mutant farelerde kirpikler motilite olası kusurları hızlı değerlendirilmesi için oda sıcaklığında kadar kayda kirpikler aktivitesi Böylece bir yandan, aynı zamanda, fizyolojik koşullar altında kirpikler aktivitesinin belirlenmesi için 37 ° C 'de bazı örnekler inkübe edin. Bu standart bir mikroskop kuluçka ch gerçekleştirmek içinAmber 37 numune korumak için kullanılabilir ° C
Bu protokole basit değişiklikler bu tür farmakolojik ajanların rolü, sıcaklık, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler gibi faktörler çok çeşitli tarafından hava yolu kirpikler aktivitesinin düzenlenmesi değerlendirmek için güçlü bir araç yapacak havayolu kirpikler fonksiyonu ve üretim / hava yolu kirpikler yendi bakım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Proje, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH hibe U01HL098180 tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kalp, Akciğer resmi görüşlerini temsil etmez, ve Kan Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I.
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
