RNAi-medierad Dubbel Gene Knockdown och Smaklig Perception Mätning honungsbin (<em> Apis mellifera</em>)
Summary
I detta protokoll, beskriver vi två strategier som samtidigt undertrycka två gener (dubbel gen knockdown) i honungsbin. Därefter presenterar vi hur man använder snabel förlängningen svar (PER) analys för att studera effekten av dubbla gen knockdown på honungsbiet smak uppfattning.
Abstract
Denna video demonstrerar nya tekniker för RNA-interferens (RNAi) som nedreglerar två gener samtidigt i honungsbin med dubbelsträngat RNA (dsRNA) injektioner. Den presenterar också ett protokoll om snabel förlängning svar (PER) analys för att mäta smak uppfattning.
RNAi-medierad gen knockdown är en effektiv teknik downregulating uttryck målgenen. Denna teknik används vanligtvis för enstaka genmanipulation, men det finns begränsningar för att upptäcka interaktioner och gemensamma effekter mellan gener. I den första delen av denna video presenterar vi två strategier för att samtidigt slå ner två gener (kallas dubbel gen knockdown). Vi visar båda strategierna har möjlighet att effektivt undertrycka två gener, vitellogenin (vg) och ultraspiracle (USP), som är i en reglerande återkopplingsslinga. Denna dubbla gen knockdown tillvägagångssätt kan användas för att dissekera sambanden mellan gener och kan lätt tillämpas iolika insektsarter.
Den andra delen av den här videon är en demonstration av snabel förlängning svar (PER) analys i honungsbin efter behandling av dubbel gen knockdown. Den per analys är ett standardtest för att mäta smak uppfattning i honungsbin, vilket är en viktig prediktor för hur snabbt en honungsbiet beteendemässiga mognad är. Större smak uppfattning om boet bin indikerar ökad beteendemässig utveckling som ofta förknippas med en tidigare ålder vid debut av födosök och födosök specialisering i pollen. Dessutom kan per analys tillämpas för att identifiera metabola tillstånd av mättnad eller hunger på honungsbin. Slutligen, per analys kombinerat med parning olika lukt stimuli för konditionering bina är också allmänt används för inlärning och studier minne i honungsbin.
Introduction
RNA-interferens (RNAi) är RNA-baserad posttranskriptionell geners uttryck, som förekommer i en mängd olika eukaryota organismer. Processen av RNAi utlöses av endogena eller exogena dubbelsträngade RNA (dsRNA) prekursorer. Den dsRNA aktiverar Dicer ribonukleas protein som binder och klyver dsRNA till små fragment (20-25 bp). Då de små fragment av dsRNA guiden ett erkännande och klyvning av komplementära mRNA genom argonaute proteiner, en katalytisk komponent av RNA-inducerad tysta komplex (RISC) 1. I däggdjur dsRNAs längre än 30 nt, aktivera en antiviral respons (interferon respons, IFN) vilket leder till ospecifik nedbrytning av RNA-transkript 2. Dock har långa dsRNAs visat sig vara effektiv och specifik i insekter eftersom det finns en brist på denna IFN 3.
Långa dsRNAs har använts för nedreglering av målgener i olika insektsarter. Honungsbin är en av pionEER insekt organismer i vilka funktioner många viktiga gener i utveckling och beteende har visat genom att använda dsRNA 4,5. Flera dsRNA leverans metoder har utförts på honungsbin: dsRNA utfodring effektivt nedreglerar uttryck målgenen i honungsbiet larver 6, medan dsRNA injektion är en effektiv metod för gen knockdown i embryon honungsbiet 4 och vuxna bin 7,8.
Gen knockdown effekter uppvisas med tillämpning dsRNA till insekter är övergående och lokaliserade. Studier har visat att både buk dsRNA injektioner och bröstkorg injektioner dsRNA effektivt undertrycka uttryck målgenen i bukfett kroppens celler av insekter 9,10. DsRNA injiceras i buken och bröstkorg håligheter och fettceller kroppen ska kunna ta upp dsRNA från hemolymph där cellerna badas 10. Emellertid kan gener i andra organ, såsom äggstockar och hjärnan, som inte riktas antingenbuken eller bröstkorg injektioner. För att rikta gener i honungsbiet hjärnan, har hjärna injektion av dsRNA också utförts, som effektivt påverkar uttryck målgenen i lokala områden i hjärnan 11. Här dokumenterar vi bara buken dsRNA injektion som är mer vanligt förekommande hos vuxna honungsbin.
RNAi har främst använts för att rikta en enda gen och har varit ett kraftfullt verktyg för att avslöja genfunktionen. Dock är varje gen inte isolerat från andra, är det i komplexa regulatoriska nätverk. En nyckel för att förstå en biologisk process är att dissekera hur gener samverkar med varandra, vilket kräver samtidiga manipulationer av flera gener snarare än en enda gen knockdown. I däggdjurscellinjer, har forskare lyckats samtidigt hämma två eller tre gener med hjälp av leveranssystem 12 eller multi-mikroRNA (miRNA) hårnål design 13. Men i insekter, multipla gener knockdowns är fortfarande oprövad. Här, presentation vit olika injektion strategier som kan uppnå en dubbel gen knockdown. Vi riktar två gener: vitellogenin (VG), som kodar för en äggula proteinprekursor och ultraspiracle (USP) som kodar för en förmodad receptor för juvenila hormon (JH) och kan fungera som en transkriptionsfaktor medla svar till JH 14 i honungsbin. Vg och JH reglerar varandra i en återkoppling 15 och är involverade i honungsbiet beteendevetenskaplig regel 9. Använda den dubbla gen knockdown, vi stör både Vg och JH vägar, och upptäck hur de gemensamt påverka beteendet honungsbiet och fysiologi och hur vg, USP och JH interagera 9.
Smak uppfattning är en beteendevetenskaplig prediktor för honungsbiet socialt beteende 16. I termer av beteendemässig utveckling, kapsla bin med hög smak uppfattning beteendemässigt mogna fort, och oftast foder tidigt i livet och föredrar att samla in pollen 16,17. Även om reglerande mechanisms underliggande smak uppfattning är fortfarande oklart, studier har visat att smak uppfattning är kopplad till inre energi metabolisms 9, hormonell utsöndring 18,19 och biogenetisk amin banorna 20. Både Vg och JH är viktiga hormonella regulatorer modulerar smak uppfattning 7,21. I laboratoriet kan en variation av smak uppfattning i honungsbin utvärderas genom att testa snabel förlängningen svar (PER) till olika sackaroslösningar. Varje bee testas genom att röra båda hennes antenner med en droppe av vatten följt av en stigande koncentration serie av 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sackaros. Ett positivt svar noterades om ett bi helt sträcker sina snabel när en vattendroppe eller sackaros vidrörs till varje antenn. Baserat på antalet positiva svar på de lösningar, kan den smak uppfattning för varje individ bestämmas 16. Dock är tillämpningen av PER ej begränsade till att mäta gustatory uppfattning. Den PER är också en effektiv metod för att testa metaboliskt tillstånd av bin såsom mättnad kontra hunger. Bina med större svar på sackaros är hungrigare i allmänhet (Wang och Amdam, opublicerade data). Vidare kan den PER paradigmet också användas i associativ inlärning och minne hos honungsbin. I detta fall bin kommer att utbildas för att associera närvaron av sackaros vatten med en lukt. När bina lär föreningen kan endast förekomsten av lukt framkalla en positiv snabel svar utan att belöna dem med sackaros 22,23. I den här videon visar vi hur du utför PER utvärdera smak uppfattning som har samband med VG och USP dubbel knockdown i en tidigare studie 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår studie är den första försök att samtidigt slå ner två gener hos vuxna insekter. Våra resultat visar att de två strategierna för dsRNA injektioner (enstaka injektion och två dagars injektion) är effektiva för dubbla gensuppression, och samtidig geners uttryck av VG och USP kan testas 6 dagar efter dsRNA injektioner i bin 8,9. Dock varierar gen knockdown effekt i olika insektsarter beroende på avskrift nivå målgen, protein klassar omsättning och dsRNA upptag effektivitet g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Erin Fennern för att hjälpa experiment. Detta arbete har finansierats av Vetenskapsrådet i Norge (180504, 185.306 och 191699), Pew Charitable Trust, och National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
References
- Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
- Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
- Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
- Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
- Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
- Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
- Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
- Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
- Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
- Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
- Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
- Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
- Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
- Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
- Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
- Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
- Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
- Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
- Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
- Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
- Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
- Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E., Pfaff, D., et al. . Hormones, Brain and Behavio. , (2009).
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
- Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
- Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
- Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
- Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
- Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
- Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
- Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).
