Summary
Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar marino
Abstract
El molusco gasterópodo marino Aplysia californica tiene una historia venerable como un modelo de funcionamiento del sistema nervioso, con especial importancia en los estudios sobre el aprendizaje y la memoria. Las preparaciones típicas para este tipo de estudios son aquellos en los que la sensorial y motoneuronas se dejan intactos en un animal disecado mínimamente, o neuronal de co-cultivo técnicamente elaborada de sensorial y motoneuronas individual. Menos común es la preparación neuronal aislado en el que pequeños grupos de neuronas nominalmente homogéneos se disocian en células individuales en cultivo a corto plazo. Tales células aisladas son útiles para la caracterización biofísica de las corrientes de iones utilizando técnicas de patch clamp, y la modulación selectiva de estos conductancias. Se describe un protocolo para la preparación de tales cultivos. El protocolo se aprovecha de los fácilmente identificables las neuronas sensoriales de los ganglios de la glutamatérgicas pleural y bucal, y describe su disociación y un mantenimiento mínimo in la cultura durante varios días sin suero.
Introduction
El molusco opistobranch marino Aplysia, ha sido un modelo neurobiológico útil para muchas décadas. Es mejor conocido como modelo de habituación y condicionamiento clásico 7, 8. Los estudios sobre el aprendizaje y la memoria en este modelo ganó el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2000 por Eric R. Kandel, en un premio que compartió con Arvid Carlsson y Paul Greengard 10. Los estudios que implican registros eléctricos a partir de preparaciones reducidas, en la que los elementos del sistema nervioso de este invertebrado se diseccionaron a partir del animal con los nervios y los músculos dejaron adjunta, han ayudado a aclarar los papeles de las neuronas individuales en Aplysia. Identificación de los mecanismos moleculares precisos que constituyen el aprendizaje en Aplysia sin embargo, a menudo empleado otra técnica, a largo plazo co-cultivos de una neurona sensorial y un motoneuronas, obtenido de uno en uno a partir de animales donantes individuales y se dejó formar una sinapsis en la placa de cultivo de 21 .
Nosotros y otros 1, 3, 6, 14, 15, 16 hemos explotado la facilidad con la que identifican las neuronas se pueden orientar en este modelo, así como su resistencia en experimentos a largo plazo para hacer cultivos a corto plazo disociados de grupos de neuronas nominalmente homogéneos en el que se estudian las corrientes iónicas bajo fijación de voltaje en la configuración de patch clamp. Muchas neuronas Aplysia se levantan a las reiteradas rondas de parche de sujeción para dar tiempo a las manipulaciones experimentales de larga duración. La técnica es útil para las neuronas como las células neurosecretoras bolsa del ganglio abdominal, y las neuronas sensoriales de los ganglios pleural y bucal cuya disociación como se describe aquí, pero no para las neuronas muy grandes> 60 m de diámetro, tales como L7 o R2 de el ganglio abdominal. No empleamos suero Aplysia en nuestras culturas, a diferencia de los senso-motoneuronas co-cultivos descritos en otro lugar. La mayoría de las neuronas obtenidas mediante este procedimiento no podrá contar con procesos para tél primero 48 h en cultivo, facilitando toda grabación de voltaje de la célula, pero entonces brotar y elaborar los axones y otros procesos durante aproximadamente 14 días antes de morir a causa de la falta de nutrientes y / o factores de crecimiento.
Esta técnica produce cultivos primarios de neuronas 50-100 por plato de regiones fisiológicamente documentados de los ganglios bucal y pleural. Este protocolo es útil para los investigadores que estudian aspectos de la fisiología de células individuales en experimentos que requieren numerosos experimental repeticiones por animal. Se produce un par coincidente de los cultivos debido a la separación anatómica de las células diana en hemiganglia izquierda y derecha, permitiendo estudios que se benefician del tratamiento combinado y los cultivos de control.
El protocolo se dirige bucales S racimo (BSC), las neuronas del ganglio vestibular, y ventrocaudal (PVC) pleurales neuronas del ganglio pleural. Estas células son de un tamaño apropiado para el conjunto de grabaciones de voltaje de la celda de visualización y Robust respuestas glutamatérgicas. La metodología discutida es apropiado para la mayoría de los ganglios en el sistema nervioso Aplysia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de células
- En el Día 1, pesar y anestesiar a los animales.
- Pesar unos 30 g, 1 kg animal. Se anestesia en animales 5-10 volúmenes de agua de mar 01:01: MgCl isotónica. 6H 2 0 durante 1 hora con aireación, tales como una bomba de aire de acuario eléctrico con piedra de aire adjunto.
- Prepare suministros de disección.
- Montar la bandeja de disección limpia con alfileres de acero inoxidable, tales como pasadores de tela. Montar varios platos de Petri que contenían agua de mar artificial (ASW; véanse las Tablas 1 y 3) + penicilina / estreptomicina (P / S).
- Tenga listo un microscopio de baja potencia. Tener instrumentos de disección limpias listas, como la nariz crucería y pinzas quirúrgicas finas y finas y grandes tijeras quirúrgicas. Rocíe los instrumentos con un 70% de alcohol isopropílico antes de su uso y deje secar.
- Posición animal en la bandeja de disección.
- Posición animales cara ventral hacia abajo en la bandeja de disección. Pin animalesa través de los bordes de la pared del cuerpo y las fronteras parapodiales, pero evite la cola y la cabeza, para exponer la superficie dorsal y la ranura genital
- Enjuague la superficie dorsal en el agua fría de la llave de ejecución lenta. Aplicar una corriente de luz de 70% de alcohol isopropílico a partir de una botella flexible a lo largo de la ranura genital y sobre la parte superior de la cabeza.
- Hacer la incisión inicial.
- El uso de un microscopio de baja potencia (véase la Tabla 2) y la luz reflejada para observar el punto en el que la ranura genital origina en el margen de cáscara anterior, mantener tensada con unas pinzas de punta acanalada un pliegue de tejido a la izquierda de este origen, mientras cortando un poco profunda el hoyo todo el camino a través del área lisa, plana de la pared del cuerpo justo a la derecha de la ranura genital con tijeras en ángulo finas.
- Hemolinfa deberá observarse para verter en el agujero, a veces llevando consigo el ganglio abdominal y el estómago.
- Ampliar la incisión.
- Use tijeras grandes para expandir ªe incisión anterior a un punto entre los rinóforos, mientras tira hacia arriba con la cuchilla inferior para evitar cortes en el intestino. Se observaron los órganos internos que se derrame fuera de la incisión.
- Retire los ganglios.
- Vuelva a colocar la bandeja y reorientar el microscopio en la región de la cabeza.
- Con unas pinzas limpias y tijeras finas, quitar la cabeza ganglios cortando en un momento los nervios que forman la cabeza de los ganglios en un anillo alrededor del esófago para eliminar pleural-pedal y cerebral ganglios como grupo.
- Retire el ganglio vestibular que se adhiere a la parte ventral del esófago.
- Retire el ganglio abdominal cortando los 4 grandes conectivas nerviosas que emiten desde este ganglio.
- Aislar los ganglios de interés.
- Recortar los ganglios de la cabeza aparte, dejando una longitud de conectores unidos a cada ganglio de interés que es igual a al menos el diámetro del ganglio; esto retardar enzima sobre-digestiónde las células de interés en el siguiente paso.
- Ponga cada ganglio objetivo a través de 2 enjuagues de ASW + P / S, moviéndose entre enjuagues con pinzas limpias.
- Si la orientación de las células de PVC, deje el hemiganglion pleural derecho accesorio a la hemiganglion pedal derecho, y del mismo modo dejar el hemiganglion pleural izquierdo conectado al hemiganglion pedal izquierdo.
- Desechar los ganglios no deseado y el resto del animal de acuerdo con la práctica aceptada la investigación.
- Digerir enzimáticamente los ganglios.
- Para cada ganglio, preparar 1 ml de solución de enzima que consiste en 3,75 mg dispasa, 1 mg de hialuronidasa y 0,3 g de colagenasa tipo XI por ml de ASW + P / S en un tubo cónico de 15 ml de polipropileno.
- Lugar enjuaga ganglios en la solución enzimática y coloque la tapa. Se coloca el tubo en posición horizontal sobre un agitador rotatorio (véase el cuadro 2) a baja velocidad durante 13-5 horas durante la noche a aproximadamente 23 ° C (temperatura ambiente).
- Prepare elplacas de cultivo.
- Antes de microdisección (Día 2), preparar poli-D-lisina (PDL) recubiertos con placas de cultivo en una campana de cultivo de tejido. Añadir ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml de agua estéril) para el centro de un plato de 35 mm para ~ 25 min.
- Enjuague PDL 3 veces con agua estéril. Deje que se seque. UV-esterilizar las placas.
- Día 2 Aislar las neuronas.
- Llene el centro de 35 mm platos que eran PDL-revestido y UV esterilizada con aproximadamente 0,5 ml de la ASW + P / S para crear una isla de los medios de comunicación en el interior del plato de otro modo seco. Esto se puede hacer en el banco, fuera de la campana de cultivo de tejido. Uno de los platos debe estar preparado para cada grupo de células procedentes de una hemiganglion.
- Tenga listo un plato de disección de 100 mm de diámetro hecha por Sylgard-recubrimiento y curado de un mm de la superficie de la disección profunda 5, equipado con pasadores de disección finas de varios tamaños para ser utilizados como alfileres y sondas (véase la Tabla 3). Enjuague este plato con un 70% de alcohol isopropílico y después con ASW + P / S, y finalmente fill con ASW + P / S.
- Prepare microdisección de los ganglios digerido.
- Verter la solución de enzima que contiene la pleural-pedal y bucal ganglios digerido en el plato de disección.
- Coloque el plato en la platina del microscopio sobre una superficie negro con luz reflejada.
- Utilizando el tejido conectivo adjunto, precisar cada pleural-pedal hemiganglion lado dorsal hacia arriba. Los tejidos deben ser suaves e intolerante de estiramiento.
- Microdissect neuronas PVC.
- Uso de 2 pares de pinzas finas limpias, y que sostiene un pasador de disección fina en un par de fórceps como una sonda, aislar las células de PVC a partir de una hemiganglion pleural. La digestión enzimática se han eliminado o roto aparte la vaina de tejido conectivo que cubre el clúster de PVC, sin embargo, las células se adhieren el uno al otro.
- Utilice la sonda para separar estas células desde el pedal de conjuntivo-pleural 18, a continuación, dejar que la caída grupo de células a la parte inferior de la disecciónplato.
- Transferir las neuronas a placa de cultivo.
- Transferir el grupo de células a un preparado 35 mm de placa de cultivo por succión suavemente el clúster en la punta de un poco pulida al fuego desechable de pipeta Pasteur de vidrio, a continuación, dispensación lentamente en la isla los medios de comunicación en una placa de cultivo, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire en la pipeta. Repita el aislamiento del grupo PVC de la otra hemiganglion y colocar en una placa de cultivo independientes.
- Microdissect y transferir las neuronas BSC.
- De clavijas de salida del lado ventral ganglio vestibular arriba, con cuidado de sobra las células de interés. Repita el paso 1.12, y los 2 grupos de células BSC del ganglio vestibular 10.
- Aislamiento de las neuronas de PVC y el BSC producirá 4 placas de cultivo que contienen grupos de neuronas: 2 platos que contienen grupos BSC y 2 platos que contienen grupos de PVC. Deseche el resto de los ganglios y dejar de lado el plato de 100 mm disección.
- DissocIATE los grupos de células.
- Coloque una placa de cultivo que contiene las células en la platina del microscopio de baja potencia y retire la cubierta.
- Disociar el clúster de PVC con un movimiento rápido suavemente la parte inferior de la placa de cultivo adyacente a la agrupación de células con un pasador de disección fina celebrada en fórceps. Sacudiendo está cavando la punta del alfiler en el plástico de la parte inferior del plato como si tratara de cavar una mota de plástico. Cuando la fricción con el plástico libera el punto de pin, una ola de percusión se produce a través del medio que se rompe la mata cerca de las células.
- Pueden ser necesarios 5-10 películas a casi disociar completamente las células, pero es mejor dejar pequeños grupos de células en lugar de a flick demasiado no sea que las células serán destruidas por pura mecánica.
- Colocar la tapa y repita con otras placas de cultivo.
- Almacenar los cultivos celulares.
- Coloque las placas de cultivo que contienen islas de medios en sus centros con células disociadas enun gran contenedor que permite la circulación de aire, tal como una x 25 mm ronda placa Petri de plástico 150, y colocar este plato en una incubadora a 17 ° C.
- Instalar en la cámara de un recipiente abierto de agua como una fuente de humedad. Dejar reposar durante la noche. Las células se adhieren al revestimiento de poli-D-lisina en el centro del plato.
- Placas de cultivo de inundación.
- El día 3, inundar suavemente los platos con 2,5 ml de ASW + P / S. Examinar y contar las células usando un microscopio invertido cultivo celular. Conservar en el 17 ° C incubadora.
2. Electrofisiología
El método es parche estándar de sujeción que se ha descrito en numerosos textos (por ejemplo, Sakmann y Neher, 1995) 16. Este protocolo funciona en células ≤ 100 pF de capacitancia o células <60 m de diámetro durante los días 3 y 4 del protocolo. Las células sin procesos son óptimas para la grabación. La siguiente EXAMEN especialiones se aplican:
- Las células más grandes pueden ser acomodados con la opción de configuración del amplificador 200B Axopatch establecido en β = 0,1. La activación de corrientes muy grandes puede causar que las células se escapen de fijación de voltaje. Soluciones ASW sustituido para el contenido de sal (por ejemplo, una fracción de la de NaCl sustituido con impermeable al cloruro de N-metil-D-glucamina) se puede usar para reducir la amplitud de corriente de la célula entera.
- Fibra llenos de borosilicato pipetas parche tirados en un extractor de pipeta y rellenada hasta la mitad con una solución intracelular (ICS) que consta de 450 mM KCl y otras sales (ver Tabla 1) son adecuados, y deben tener una resistencia de aproximadamente 0,5 a 1 MOhm. Si se desea el aislamiento de las corrientes iónicas específicas, por ejemplo, corrientes de Na + en la ausencia de corrientes de K, K + en esta solución puede ser sustituido por otros iones tales como Cs +. Cl - sustitución de ICS con un anión impermeant también se justifica si se desea un ICS más natural9.
- Las células son robustos con> 1 hr-largas grabaciones posibles a temperatura ambiente. La grabación es óptima en los días 3 y 4 del protocolo, correspondientes a 24-48 horas de cultivo. Después de 48 horas hay dificultades para formar sellos GigaOhm, quizás a causa de elaboración de un glicocálix sobre la superficie de la célula, y los problemas causados por la abrazadera espacio excrecencia proceso. Las células son útiles, sin embargo, para los estudios de clamp no parches, tales como la toxicología, que se pueden completar en <14 d.
- ASW y otras soluciones para ser dispensado desde el dispositivo de solución por gravedad, así como la solución intracelular, deben ser filtrados a través de una jeringa montada en un filtro de 0,2 micras Acrodisk (Tabla 3) para eliminar las partículas finas que interfieren con la formación de sello GigaOhm.
- La desensibilización se produce al utilizar agonistas tales como D-aspartato (D-Asp), por lo tanto, ~ 1-2 minutos entre las aplicaciones de los agonistas se recomienda. Por el contrario, la potenciación se observa a menudo con una rápida aplicación repetidacationes de agonistas tales como L-glutamato (L-Glu).
- Agonista de corrientes activadas tales como L-Glu pueden ser estudiadas mediante la aplicación de agonistas con la Picospritzer pipeta. Esta pipeta se tira de la misma como la pipeta de parche y contiene agonista en ASW. Cuando la punta de la pipeta se coloca por debajo de la tubería de salida del dispositivo de solución por gravedad, y en un ángulo de 45 ° respecto a la tubería de salida (Figura 2F), agonista se lavó rápidamente fuera de la celda, y la desensibilización se reducirá al mínimo. El agonista de la pipeta debe crear un ángulo de 90 ° o más en relación con la pipeta de parche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La ubicación de las neuronas sensoriales en los ganglios que están dirigidos en este protocolo, las neuronas BSC y PVC se muestran en la Figura 1. Las neuronas BSC están situados en 2 grupos ovales simétricas en el lado ventral del ganglio vestibular, la superficie que se enfrenta lejos de la masa en el ganglio vestibular intacta (Figura 1A). Las neuronas de PVC forman grupos bilaterales, en forma de V que se envuelven alrededor de la superficie dorsal del ganglio pleural hacia el eje central (Figura 1B). Estas neuronas sensoriales tienen la ventaja de una ubicación estereotipada dentro de los ganglios, aunque el grupo de la derecha o hacia la izquierda no se encuentra en los animales individuales en aproximadamente el 1% de las ocurrencias. El BSC y las agrupaciones de PVC neurona son identificables por el color naranja oscuro de la membrana de la célula y el tamaño relativamente pequeño en comparación con las células cercanas, como se muestra en el esquema de círculo grande de la Figura 1A.
En la cultura, éstasneuronas son a menudo sin procesos el día después de la siembra (Figura 2A) y son ideales para el parche de sujeción de ese día, y un día más tarde. A veces es posible lograr abrazadera espacio adecuado incluso cuando las células parecen tener excrecencia de proceso (Figura 2F), lo que sugiere que no todos los brotes que parece emanar desde el cuerpo de la célula es parte de la célula. Si el manejo después de la digestión enzimática ha sido amable, las células llegan a la cultura con algunos procesos intactos, y estos procesos crecen con el tiempo (Figuras 2B-2E). Tales células no son adecuados para el parche de fijación pero la grabación intracelular es posible.
Celulares corrientes pinzamiento zonal realizadas por el voltaje cerrado Na + y Ca 2 + se registran fácilmente a partir de neuronas de PVC y BSC en cultivo a corto plazo 6, y ambos tipos de células muestran una corriente de K mixta. Neuronas BSC también responden a la acetilcolina, la serotonina y NMDA 4 (Figura 3C) Con las corrientes excitadoras, mientras tanto BSC y las neuronas de PVC responden a L-Glu y Asp D-3 (Figuras 3A y 3B) con las corrientes excitatorias. Las características farmacológicas de L-Glu-y corrientes D-Asp-inducidos en estas neuronas se han descrito 4.
Figura 1. Microfotografías que muestran la posición de las neuronas sensoriales glutamatérgicas de los ganglios vestibular y pleural (círculos rojos). A. Las neuronas vestibulares S racimo (BSC), identificables por su color naranja oscuro (círculo grande en hemiganglion izquierda) y la posición correspondiente en la clúster hemiganglion derecha (círculos pequeños). en forma de V B., naranja oscuro pleural ventrocaudal (PVC) de células de la hemiganglion pleural derecho (hemiganglion izquierda no se muestra).
Figura 2. Las fotomicrografías de las neuronas sensoriales glutamatérgicas en cultivo de células de A. el clúster de 24 horas de PVC después de la siembra en placa de cultivo muestra 2 neuronas sensoriales y otras células;. Otras células de PVC de cultivos separados en 24 horas se muestran como inserciones B, C.. Un BSC neuronas en cultivo a 24 horas y la misma neurona a las 96 horas, respectivamente. D, E. Una neurona PVC en la cultura a las 24 horas y la misma neurona a las 96 horas, respectivamente. F. Una neurona PVC a las 48 horas en un patch clamp experimento. La pipeta de parche está en contacto con la célula desde el borde derecho, mientras que el Picospritzer pipeta es en la parte inferior. La gran sombra oscura visible a la izquierda de la celda es la apertura de la pipeta baño de fluido. Haz clic aquí para ver más grande la figura.
Figura 3. Glutamatérgicos corrientes de células enteras patch clamp grabaciones de las neuronas BSC y PVC. A. corriente en un BSC neuronas de células enteras en respuesta a la aplicación de presión de L-Glu (1 mM, 100 ms). B. Todo el actual celda de una neurona en PVC respuesta a la aplicación de presión de D-Asp (1 mM, 100 mseg). C. células enteras de NMDA actual en la misma célula BSC como en A (1 mM, 100 mseg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las técnicas de disociación describen aquí dió cultivos de neuronas sensoriales que contienen 50-100 neuronas aisladas intercalados con pequeños números de células gliales y otras células no identificados. Los pasos más críticos en el protocolo son el tiempo de los ganglios permanecen en solución de enzima, y agitando, la disociación de los grupos de células digeridas para romper el clúster en las células individuales. Digestión enzimática (paso 1.8) debe ser optimizado a la temperatura disponibles. A 23 ° C con agitación lenta, 13 horas es suficiente para la digestión de la BSC grupos while15 horas es óptimo para los clústeres de PVC. Rendimientos bajos de las células en la placa de cultivo se pueden atribuir a la falta de tiempo en la enzima, o el exceso de disrupción mecánica, ya sea durante la etapa de la transferencia de células (1,11 y 1,12) o durante la etapa de parpadeo (1,13). El fallo de las células a pegarse hacia abajo para el sustrato de cultivo, así como la breve supervivencia en cultivo es generalmente debido a un exceso de disrupción mecánica. La contaminación de la culturaras también pueden ocurrir, y es mejor dirigirse al asegurar que el animal anestesiado se enjuaga bien, que los instrumentos de disección están limpias, y que los ganglios de interés son sometidos a varios enjuagues en ASW + P / S. Puede ser necesario lavar y alcohol limpio instrumentos entre diferentes partes del procedimiento de disección, o tener suficientes instrumentos listos para que los limpios se pueden utilizar para cada paso.
Aplysia estudios neurobiológicos más a menudo se llevan a cabo los preparativos reducidas que conservan las conexiones nerviosas entre neuronas o entre neuronas y músculos 2, 18. Estas preparaciones facilitar la asignación de control de los procesos musculares a neuronas específicas y circuitos neuronales y también permiten que los estudios de la potenciación y la facilitación de los reflejos repetitivas. Preparaciones intactas no son adecuados para ciertos tipos de protocolos de fijación de voltaje y el estudio de los efectos de los agonistas que rápidamente desensibilizar los receptores.
El largo plazo neuronal co-cultura es una herramienta adicional para estudiar la potenciación y la facilitación en condiciones muy controladas. A largo plazo co-cultivos también se prestan a estudios bioquímicos en las neuronas individuales. El éxito de la preparación de co-cultivo se atribuye a menudo a la adición de hasta un 50% Aplysia hemolinfa a las culturas 17. Sin embargo, el éxito de este enfoque a menudo depende de la variabilidad de lote a lote de este hemolinfa.
La preparación de cultivo de células disociadas se describe aquí se expande el repertorio uso del modelo de Aplysia. Cultivos de células disociadas no son adecuados para deducir circuitos neurales o estudiando la sinapsis intactas como los métodos mencionados anteriormente hacer. La preparación de cultivo de células disociadas tiene su mayor utilidad en la confirmación de la existencia de las conductancias iónicas específicas y sus propiedades cinéticas y farmacológicas en experimentos de fijación de voltaje de células individuales. Sevcorrientes únicas rales se han descubierto el uso de preparaciones de células individuales, incluyendo una corriente en las células del bolso de cationes excitador 19 y la corriente del receptor D-Asp en neuronas BSC 4. Estudios sobre Aplysia rara vez se centran en las corrientes iónicas de las células individuales, en parte debido al tamaño a menudo difícil de manejar de tales células y la existencia de numerosos otros tipos de células modelo adecuado que se prestan bien para parchear las técnicas de sujeción. Como resultado de ello, la existencia de ciertas corrientes en Aplysia, tales como los activados por el ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiónico (AMPA) están por lo general inferirse a partir del bloque de putativo del receptor de AMPA (R) comportamientos relacionados por los antagonistas de AMPAR aplicadas a la preparación del nervio reducida, en lugar de directamente registrada. Por lo tanto la verificación de la existencia de ciertas corrientes es insuficiente. Aislamiento de las neuronas glutamatérgicas cultivadas y la metodología de fijación de voltaje de células individuales proporciona una prueba directa de la existencia dediferentes tipos de canales de L-GluR en este organismo modelo.
Otro uso de las neuronas Aplysia en experimentos de patch clamp de células individuales es en la disección de cascadas de segundo mensajero. Aplysia neuronas son particularmente muy adecuados para los estudios de la modulación inducida por segundo mensajero porque son estables durante largos períodos de grabación a temperatura ambiente 3, 12, 20, 21 , y son lo suficientemente robustos que las células individuales se pueden guardar después de la grabación y se registran de nuevo después de 24 horas 5. Estos grupos de neuronas sensoriales vestibulares y pleural convenientemente producen un par de culturas coincidentes de cada ganglio, de manera que un plato se puede designar un cultivo de control, mientras que su compañero recibe un tratamiento.
Una ventaja adicional de esta preparación es en los estudios del estado morfológico de las neuronas individuales. Por ejemplo, descubrimos que los cuerpos celulares de las neuronas Aplysia de animales senescentes fueron LARger que los de los animales más jóvenes, pero no dio más detalles procesos celulares después de varios días en cultivo 6. Estas preparaciones de neuronas aisladas también facilitan los estudios que utilizan colorantes vitales para evaluar los niveles de Ca intracelular 2, el pH, las especies reactivas de oxígeno, potencial de membrana mitocondrial y otros rasgos fisiológicos que puede compararse entonces con las características neurofisiológicas de las células individuales. Mientras que algunos de estos enfoques son aplicables en las preparaciones intactas o co-cultivo, recolección de datos es mucho más sencillo el uso de neuronas aisladas en este sistema de cultivo fácil. En el futuro esperamos utilizar estas células para un solo perfil molecular celular 13.
El cultivo disociado a corto plazo proporciona material ideal para la investigación de procesos neurofisiológicos fundamentales, y puede proporcionar una herramienta particularmente poderosa cuando se utiliza junto con los estudios que suponen una disminución o preparaciones de co-cultivo. El disociadoAplysia neuronas cultura se extiende la utilidad de este modelo animal venerado a nuevas e interesantes áreas de la neurociencia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Financiado por el NIH P40 OD010952, la Fundación Korein, de la Universidad de Miami Fellowship de SLC y una beca de Maytag para ATK. Los autores agradecen al personal de la Nacional de Recursos para la Aplysia, así como Lauren Simonitis y Hannah Peck, quien proporcionó micrografías de una figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
