우리는 장용 신경계의 신경 세포 및 교세포 구성 요소의 직접적인 연구를위한 세포 배양 프로토콜을 보여줍니다. coverslips는에 신경 / glia의 혼합 문화, 면역 전기 생리학, 개별 신경 세포와 아교 세포 기능을 검사 할 수있는 기능을 제공하는 성인 마우스 myenteric 신경 얼기에서 준비가되어 있습니다 등.
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이 논문에서
요약
초록
장용 신경계의 기능적 위장 운동성을 제어 위장관의 길이를 실행하는 뉴런과 교세포의 광대 한 네트워크입니다. myenteric 신경 얼기의 신경 세포와 교세포의 혼합 인구의 분리 및 문화에 대한 절차를 설명합니다. 차 문화는 뉴런과 교세포 사이에 개발 연결을 7 일 이상 유지 될 수 있습니다. 첨부 myenteric 신경 얼기와 세로 근육의 스트립 마우스 회장 또는 결장의 기본 원형 근육에서 제거하고 소화 효소를 받게됩니다. 무균 조건에서 분리 된 신경 세포 및 교세포 인구는 펠릿 다음 원심 분리 내에 보존되어 coverslips를에 도금. 24-48 시간 내, 신경 돌기의 가지가 발생하고 신경이 팬의 연결을 마커로 식별 할 수 있습니다. 문화 이틀, 고립 된 뉴런 화재 활동 전위는 패치 클램프 연구에 의해 관찰했다. 또한, 장내 아교 세포는 지문을 확인해 될 수 있습니다GFAP 염색에 의해 IED. 가까운 동격의 뉴런과 교세포의 네트워크는 5 일 안에 형성 - 뛰기. 장내 뉴런은 개별적이어야하며 직접적 면역, 전기 생리학, 칼슘 이미징, 및 단일 세포 PCR 등의 방법을 사용하여 연구 할 수 있습니다. 또한이 절차는 유전자 변형 동물에서 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 수행하는 간단하고 저렴합니다. 우리는 더 나은 정상과 질병 상태에있는 ENS의 기능을 발견 할 수 있도록 전반적으로,이 프로토콜은 쉽게 조작 방식 장용 신경계의 구성 요소를 노출합니다.
서론
장용 신경계 (ENS)는 신경 및 위장 (GI) 요로의 전체 길이를 실행하는 아교 세포의 광대 한 네트워크이다. ENS는 기능적으로 연동, 액체 흡수 / 분비, 자극의 감각 등 (검토를 위해 1 참조) 등의 소화의 모든 측면을 제어합니다. 그것은 척수에있는 이상 만 500 개 이상의 뉴런을 포함하고 뇌에서 발견 된 모든 신경 전달 물질의 클래스가 포함되어 있습니다. 또한, ENS는 중추 신경계 2에서 입력없이 반사적으로 작동 할 수 있다는 점에서 독특합니다. ENS의 이해는 정상적인 생리적 역할을 이해하지만, (의 히 르츠 프룽 질환), 인수 (샤 가스), 질병 상태 (당뇨병 위 마비)에 보조 약 선천성 할 수 있습니다 신경 병증의 다양한의 참여를 이해하기 위해뿐만 아니라 중요하다 유도 (아편 대장 증후군), 부상 (수술 후 장폐색) 1 때문이다. 또한, 장내 뉴런은 다시 할 수 있습니다바이러스 감염 (수두 대상 포진) 3 servoir. 때문에 뇌와 창자에있는 세로토닌의 높은 수준의 유사성, 중추 신경 계통의 결함을 치료 목적으로 약물은 종종 ENS 2 원치 않는 부작용이 있습니다. 그것은 알츠하이머 질환과 파킨슨 병 등 많은 신경 병증은 ENS 이러한 질병 4의
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프로토콜
모든 동물 관리 및 실험 절차에 따라이었고, 버지니아 커먼 웰스 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인.
1. 24 잘 접시에 무균 폴리-D-라이신과 라미닌 코팅 유리 coverslips를 준비
- 1 단계의 모든 절차는 무균 조건에서 수행되며, 후드, 멸균 시약. 유리 coverslips를 두 번 탈 이온수 (DDH 2 O)은 사전에 소독해야한다. 접시의 준비는 신경 세포의 분리 2 주 전에까지 수행 할 수 있습니다.
- 후드 아래, 24 - 웰 플레이트의 12 우물 멸균 유리 coverslips는을 배치 멸균 집게를 사용합니다.
- 미리 폴리 - D - 라이신 재고를 준비합니다. 5 MG 폴리 - D - 라이신에 멸균 ddH2O의 50 ML을 추가합니다. -20 ° C.에 소용돌이 3 ML의 분주에 저장 사용하기 전에 분주 해동.
- 피펫 80 μL : 25cm 2 당 1 ML 폴리 - D - 라이신 주식의 최종 농도에 대한각 유리 coverslip을 (2cm 2)의 위에 폴리 - D - 라이신 주식. 솔루션은 10 분 동안 정착하자.
- 폴리 - D - 라이신 사용하여 진공을 제거하고 살균....
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결과
LMMP - 유래 세포, 뉴런과 다른 세포 유형의 직후 격리 쉽게 분명하지 않습니다. 생활은 불명료 한 표현형의 원형 세포뿐만 아니라 불완전하게 소화 조직 조각과 결합 조직에서 조직 암성로 볼 수 있습니다. 이 표류가없는 관심과 크게 이틀 첫 번째 미디어의 변화와 함께 제거됩니다. 건강한, 생존 세포도 제거되므로이 전에 슬라이드를 청소하지 마십시오.
문화 한 하루 후, 뉴런은 신경 돌기 가지를 표시하기 시작합니다. 뉴런의 특정 식별 여전히이 시간에 불명료 할 수 있습니다. 세포 실험 챔버로 전송하기에 충분한 접착을 제공, 그들은 문화 중 하나 하루 전기 생리학 연구를위한 준비가 될 것입니다. 5 - 그러나, 세포는 약 일 2 ~ 문화와 기능 연구를위한 이상적인 (전기 생리학, 칼슘 이미징)의 두 일 후에 더 자기편이다.
ENT "> 신경 세포의 형태 학적 특징은 문화에서 약 일주일 (그림 1) 이후 뚜렷한됩니다. .......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
사용 동물
이 프로토콜은 스위스 웹스터 마우스에 최적화되어 있습니다. 그러나,이 방법은 쥐와 같은 다른 작은 포유 동물과 생쥐의 다른 변종에 쉽게 적응할 수있다. 우리는 성공적으로 C57 마우스 및 μ-아편 수용체 녹아웃으로 예비 고립감을 수행했습니다. 그러나 생쥐의 다른 변종 GI 기관의 형태 학적 변화로 인해 문제가 될 수있는 것도 가능하다. 또한, 최종 분리의 뉴런의 결과 혼합에 영향을 미칠 수 LMMP 준비 13 일의 신경 회로에서 마우스 변종 사이의 알려진 차이 (대 글루 Balb / C C57BL / 6)가있다. 또한, 연령이 방법을 사용하면 연령과 관련된 신경 세포의 손실은 콜린성 뉴런과 해당 아교 세포에 특정한 myenteric 신경 얼기에서 발생, 고려되어야하며, 14 세 12 개월 빠르면 볼 수 있습니다. 마지막으로, 다른 시험편이 프로토콜을 채택 할 때동물의 ES는주의 myenteric 신경 얼기 오히려 원형 근육에 붙어 .......
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공개 사항
저자는 더 큰 경쟁 관심이 없는지 선언합니다.
감사의 글
건강 그랜트 DA024009의 국립 연구소, DK046367 및 T32DA007027.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 폴리-D-라이신 | 시그마 | P6407- 5 mg | |
| 24-웰 세포 배양 플레이트 | CELLTREAT | 229124 | 어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다 |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | 실험실에서 준비할 수 있습니다 | ||
| 15 ml 멸균 원심분리기 튜브 | Greiner Bio-one | 188261 | 모든 브랜드 |
| 50 ml 멸균 원심분리기 튜브 | Greiner Bio-one | 227261 | 모든 브랜드 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| 포도당 | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 미디어 | Gibco | 11330 | |
| 태아 소 혈청 | 품질 생물학 Inc. | 110-001-101HI | 어떤 브랜드의 |
| 항생제/항진균제를 사용할 수 있습니다. 100x 액체 | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A 매체 | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-글루타민 | Gibco | 25030164 | |
| 신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF) | 신경학 | PR27022 | |
| Sharp-Pointed 해부 가위 | Fisher Scientific | 8940 | |
| 부 조직 집게 | Fisher Scientific | 13-812-41 | 어떤 브랜드의 |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | 어떤 브랜드도 사용할 수 있습니다 |
| 250 ml 졸업 유리 비커 | Fisher Scientific | FB-100-250 | 어떤 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| 2 L 유리 Erlenmyer 플라스크 | Fisher Scientific | FB-500-2000 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| 플라스틱 막대 (어린이용 페인트 브러시) | Crayola | 05 3516 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| >10 ml Leur-lock 주사기 | Becton Dickinson | 309604 | 모든 브랜드를 사용할 수 |
| 있습니다. 21 G x 1 1/2 in. 하이포더믹 니들 | Becton Dickinson | 305167 | 어떤 브랜드든지 사용할 수 있습니다 |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| 소 혈청 알부민 | 미국 생물 분석 | AB00440 | |
| 2 ml 마이크로 원심분리기 Eppendorf 튜브 | Fisher Scientific | 13-864-252 | |
| Nitrex Mesh 500 µ M | Elko Filtering Co | 100560 | 모든 브랜드를 사용할 수 |
| 피펫 세트 | Fisher Scientific | 21-377-328 | 모든 브랜드를 사용할 수 |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | 모든 브랜드를 |
| Equipment | |||
| >LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 브랜드 |
| 10 L 쉐이킹 워터배스 | Edvotek | 5027 | 어떤 브랜드의 |
| 마이크로센트리퓨즈를 사용할 수 있습니다. 5417R | Eppendorf | 5417R | 크기의 어댑터를 가진 단일 대형 원심분리기를 사용할 수 있습니다 |
| Allegra 6 시리즈 원심분리기 | Beckman Coulter | 366816 | 어떤 브랜드의 |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | 를 |
| AutoFlow 워터 재킷 CO2 인큐베이터 | Nuiare | NU-4750 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| 분석 저울 | 저울 Mettler Toledo | XS104 | 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
참고문헌
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., C....
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재인쇄 및 허가
