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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Imagerie RICL sécrétion d'enquêter sur l'infection cellulaire par le pathogène bactérien Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène à Gram positif fréquemment utilisé comme un modèle important pour l'étude du parasitisme intracellulaire. Imagerie fin L. monocytogenes stades d'infection dans le contexte de petits écrans ARN interférant permet l'étude globale des voies cellulaires nécessaires à l'infection bactérienne de cellules hôtes cibles.

Abstract

Pathogènes intracellulaires bactériennes peuvent être conçus comme des outils moléculaires pour disséquer les cascades de signalisation cellulaire en raison de leur capacité à manipuler exquise et subvertir les fonctions cellulaires qui sont nécessaires pour l'infection des tissus cibles de l'hôte. Parmi ces bactéries pathogènes, Listeria monocytogenes est un micro-organisme à Gram positif qui a été utilisé comme un paradigme pour parasitisme intracellulaire dans la caractérisation des réponses immunitaires cellulaires, et qui a joué un rôle instrumental dans la découverte des voies moléculaires contrôlant cytosquelette et la membrane dynamique de la traite. Dans cet article, on décrit un test microscopique robuste pour la détection des stades de l'infection cellulaire L. fin monocytogenes basées sur le marquage fluorescent de RICL, une protéine bactérienne sécrétée qui s'accumule dans le cytoplasme des cellules infectées, ce dosage peut être couplé à de petits écrans d'ARN automatisées à haut débit interférant de manière à carboniseracterize voies de signalisation cellulaires impliqués dans la hausse ou à la régulation à la baisse de l'infection.

Introduction

La bactérie à Gram positif Listeria monocytogenes est un agent pathogène d'origine alimentaire qui envahit les cellules de l'hôte, perturbe sa vacuole d'internalisation et se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes 1. L. monocytogenes facilité de manipulation dans le contexte de laboratoire (d'une croissance rapide, une faible toxicité pour les individus en bonne santé) associée à la persistance de caractéristiques de virulence bactériennes observées dans des modèles cellulaires et animaux (l'activité hémolytique, leucocytose) a permis son utilisation initiale dans les années 1960 comme un modèle majeur pour l'étude du parasitisme intracellulaire et pour la mise en place des fondements théoriques de l'immunité cellulaire contre l'infection 2. À la fin des années 1980 et au début des années 1990, la dissection du cycle intracellulaire bactérienne 3 ainsi que la caractérisation moléculaire de la virulence bactérienne la plus importante facteurs 4-7 favorisé l'utilisation de L. monocytogenes comme un outil moléculaire clé pour la manipulation et le goujony des fonctions de la cellule hôte. La présence de non virulente (L. innocua) et (L. monocytogenes) espèces virulentes dans le genre Listeria ont ouvert la voie à des études génomiques comparatives 8 qui, avec la création récente de la L. complète monocytogenes transcriptome 9, ont accru notre compréhension de l'évolution de L. monocytogenes comme un agent pathogène humain et en tant que système modèle pour l'infection études de 10.

L. monocytogenes induit son internalisation dans les cellules hôtes lors de l'interaction des protéines de surface bactériennes INLA et INLB avec leurs récepteurs de la cellule hôte E-cadhérine et Met, respectivement 11-12. Études sur la base de candidats initiaux ont conduit à l'identification de l'α / β caténines-actine lien comme une composante importante de la voie InlA-invasion 13 et de la phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) comme un effecteur critique de la InlB- dépendant invasion cascade 14 à 15. Analyses protéomiques et base fonctionnelle suite ont permis d'identifier de nouveaux éléments du cytosquelette et 16 seconds messagers lipidiques 17 requis pour l'invasion de la cellule hôte. Études de la transcription 18 et protéomique de masse basé spectrométrie de 19 quantitatives ont récemment jeté un nouvel éclairage sur l'activation de la signalisation accueil cascades et la répression de la réponse immunitaire au cours de L. monocytogenes infection. Biologie systémique basée sur l'inactivation des grands ensembles de gènes (kinomes, génomes complets) par petits ARN interférents (siRNA) silencieux ont récemment ouvert de nouvelles voies pour l'analyse de l'hôte mondiale cascades de signalisation dans le cadre des fonctions cellulaires spécifiques, y compris la phagocytose et pathogène internalisation 20. Écrans de siRNA du génome entier ont déjà été menées pour examiner cascades cellulaires nécessaires pour l'infection de L. monocytogenes dans phagocytaire Drosophila 21-22, mais ce type d'analyse n'a pas été réalisée dans des cellules non-phagocytaires, qui représentent des cibles importantes pour l'infection in vivo.

Nous avons optimisé un protocole pour la détection microscopique des stades tardifs de l'infection par L. monocytogenes qui est adapté pour les études à haut débit siARN d'entrée bactérienne dans les cellules épithéliales. Notre essai tire parti d'un L. hautement invasive monocytogenes souche qui présente une mutation ponctuelle dans PrfA, le régulateur transcriptionnel majeur de L. monocytogenes facteurs de virulence 6: cette mutation (nommé PrfA *) rend PrfA constitutivement active 23 et conduit à une augmentation de l'expression des protéines d'invasion de l'INLA et INLB, favorisant ainsi l'entrée des bactéries dans les cellules non-phagocytaires sinon mal infectés. Notre lecture de l'infection est basé sur la détection de l'accumulation cytosolique de la sécrétée de la protéine bactérienne RICL: cette molécule estun effecteur pleiotrope qui s'exprime préférentiellement par voie intra-cytoplasmique L. 9 monocytogenes et qui participe non seulement à la cellule-cellule au-bactérien réparties 24 mais qui modulent également les réponses immunitaires de l'hôte 25. Le marquage fluorescent des RICL la sécrétion par les bactéries intracellulaires non seulement permet de distinguer clairement infectée à partir de cellules non infectées, mais représente également une lecture du point final qui peut être utilisé par la suite pour disséquer infection dans ses différentes étapes: d'entrée, évasion vacuolaire, bactérienne cytosolique la prolifération et la propagation de cellule à cellule. Ce protocole basé sur la microscopie peut être couplé à écrans siARN donc d'étudier les voies cellulaires impliquées dans l'infection des cellules hôtes par L. monocytogenes.

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Protocol

Une. Préparation des cultures cellulaires et bactériennes, transfection Outils et anticorps primaires

  1. Préparer une plaque de gélose frais d'isoler individuelle L. monocytogenes colonies à partir d'un stock de glycérol bactérienne (50% glycerol/50% saturé culture de la nuit liquide bactérienne) conservé à -80 ° C.
    1. L'utilisation d'un rack en aluminium (conservé à -80 ° C) pour transporter un bactérienne glycérol d'surgelés, les bactéries à balayage sur un coeur cervelle (BHI) de plaque de gélose.
    2. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 48 h (ou jusqu'à ce que des colonies bactériennes individuelles peuvent être isolés).
    3. Conservez cette plaque travailler ensuite à 4 ° C pendant une durée maximale de 1 mois (elle sera utilisée pour ensemencer des cultures liquides).
    4. Dans notre protocole, nous utilisons le L. monocytogenes sérotype 1/2a EGDe.PrfA * souche, mais comme cela est illustré sur la figure 1, le L. monocytogenes sérotype 4b P14.PrfA * souche donne des résultats similaires.
  2. IlCellules de CCL2 La ATCC sont cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) en l'absence d'antibiotiques.
  3. Pools indépendants de brouillés (contrôle) et des anti-Met siRNAs sont chargés dans 384 puits de plaques de culture cellulaire par microscopie noirs.
    1. Diluer 160 pmol de siRNA dans 500 pi d'eau sans RNase et ajouter 5 ul de cette solution par puits (concentration finale: 1,6 pmol).
    2. Conservez cette plaque à -20 ° C pour une période maximale de 1 an.
  4. Des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéine bactérienne RICL ont été obtenus par immunisation à l'aide d'une protéine recombinante RICL-GST comme décrit précédemment 25.

2. Inverser siRNA Transfection cellulaire

  1. 72 heures avant l'infection amener à la température ambiante, une plaque 384 puits de culture cellulaire de microscopie noir contenant 1,6 pmol siRNA dans 5 pi d'eau sans RNase dans chaque puits.
  2. Centrifuger la plaque pendant 3 min à 300rcf à la température ambiante pour faire baisser siRNA qui aurait pu être déposé dans les parois des puits.
  3. Préparer à manger DMEM de température complété avec 0,4% Lipofectamine RNAiMAX.
  4. Ajouter 25 ul du milieu de transfection DMEM / RNAiMAX à chaque puits (ne pas laisser incuber le milieu de transfection plus de 20 minutes avant de l'ajouter à la siRNA).
  5. Déplacer la plaque avant et en arrière de mélanger le siRNA avec la solution de transfection, puis garder la plaque pendant 1 heure à température ambiante pour permettre complexes siARN-Lipofectamine pour former.
  6. Laver les cellules HeLa à partir d'un flacon-confluente ou une culture de cellules sous-confluentes une fois avec 10 ml 37 ° C préchauffé PBS.
  7. Détacher les cellules HeLa par addition de 1 ml à 37 ° C préchauffé trypsine dans la fiole de culture de cellules et incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C.
  8. Re-suspendre les cellules dans 10 ml 37 ° C préchauffé DMEM supplémenté avec 16% de FBS.
  9. Compter les cellules et à préparer une suspension cellulaire de 12 000 cellules par ml dans du DMEM supplémenté avec16% de FBS.
  10. Ajouter 50 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de 384 puits.
  11. Déplacer la plaque rapidement d'avant en arrière pour répartir les cellules et les cellules laisser s'installer pendant 10 min à température ambiante.
  12. Sceller la plaque avec du Parafilm et garder pendant 72 heures dans un contenant du CO 2 atmosphère humidifiée de 5% à 37 ° C.

3. Infection cellulaire et coloration

  1. Le jour avant l'infection, prendre une seule colonie de L. monocytogenes dans la plaque de gélose BHI et remettre en suspension dans 5 ml de milieu de BHI de liquide dans un tube de 15 ml en polystyrène.
  2. Incuber pendant une nuit à 37 ° C dans un dispositif de Shacking pour permettre la croissance bactérienne.
  3. Le jour de l'infection, se laver 1 ml de la L. nuit monocytogenes culture par centrifugation 2 min à 10600 rcf sur une centrifugeuse de table.
  4. Jeter le surnageant (qui contient le sécrétée cytotoxine listériolysine O) et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS (REPEAt l'étape de lavage 3 fois plus).
  5. Lire la densité optique à 600 nm bactérienne et estimer le nombre de bactéries (OD = 1 est équivalent à 1E9 bactéries / ml).
  6. Préparer le L. adéquate monocytogenes dilution dans du DMEM supplémenté avec 1% de FBS: en utilisant des souches hautement invasives comme EGDe.PrfA *, nous suggérons l'utilisation de bactéries 5E4 dans 30 pi de milieu par puits (la multiplicité d'infection est estimé à 25 pour 2000 cellules).
  7. Retirer le milieu de culture de cellules dans chaque puits (80 ul) et de la remplacer par l'ajout de 30 ul de la L. monocytogenes milieu contenant.
  8. Centrifuger la plaque à 200 rcf pendant 5 min à température ambiante pour synchroniser le processus d'infection.
  9. Incuber la plaque pendant 1 heure dans un CO 2-atmosphère humidifiée contenant 5% à 37 ° C sur un bloc d'aluminium préchauffé.
  10. Retirez le L. monocytogenes contenant du milieu de chaque puits et ajouter 30 ul de DMEM préchauffé additionné de 10% de FBS et40 pg / ml de gentamicine de tuer extracellulaire L. monocytogenes.
  11. Incuber pendant 4 heures dans un CO 2-atmosphère contenant 5% à 37 ° C sur un bloc de métal préchauffée.
  12. Préparer une solution de PBS supplémenté avec 8% de formaldehyde (cette solution doit être préparé de telle sorte que les monomères de formaldéhyde, de préférence aux polymères de paraformaldéhyde, sont utilisés).
  13. Sans écarter le milieu de culture de cellules, ajouter 30 ul de PBS supplémenté avec 8% de formaldéhyde (concentration finale: 4%) et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  14. Retirer le fixateur et de lavage des cellules trois fois avec 80 ul de PBS par puits (maintenir les cellules dans un volume final de 80 ul de PBS par puits).
  15. Préparer une dilution 1:250 du lapin anti-RICL sérum dans du PBS additionné de 0,2% de saponine.
  16. Ajouter 10 ul de la solution d'anticorps primaire à chaque puits après avoir enlevé le PBS et incuber pendant 30 min à température ambiante.
  17. Jeter le primairesolution d'anticorps et laver quatre fois avec 40 pl de PBS par puits.
  18. Diluer l'anticorps secondaire Alexa Fluor 546 à couplage anti-lapin (1:250), la solution de DAPI (1:1500) et phalloïdine-DY647 (1:150) dans du PBS supplémenté avec 0,2% de saponine.
  19. Ajouter 10 ul de cette solution de coloration secondaire pour chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante.
  20. Jeter la solution de coloration secondaire et laver quatre fois avec 40 pl de PBS par puits (laisser un volume final de 40 ul dans chaque puits et sceller la plaque).
  21. La plaque peut être reproduite immédiatement ou peut être conservé à 4 ° C à l'abri de la lumière (couvrir de papier d'aluminium) pour une analyse ultérieure.

4. Acquisition et analyse d'images

  1. Acquérir des images en trois canaux différents (350 nm, 546 nm et 647 nm) en utilisant un objectif 10X monté sur un microscope automatisé (acquérir préférentiellement 9 images par puits).
  2. Le signal RICL peut être mesurée en utilisant l'imagelogiciel d'analyse comme CellProfiler qui permet la segmentation automatique des noyaux et des corps cellulaires utilisant le DAPI et la coloration de phalloidin, respectivement.

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Representative Results

Marquage fluorescent cytoplasmique RICL fournit une lecture robuste pour l'infection des cellules par L. monocytogenes, comme illustré sur la figure 1: la cellule centrale dans la micrographie est fortement infectées par la souche P14.PrfA * 23 comme cela peut être observé dans l'image à contraste de phase (pointes de flèches, figure 1A) et il est confirmé par le signal DAPI où bactéries individuelles peuvent être clairement distingués (figure 1B). La coloration RICL (superposée à la coloration DAPI à la figure 1C) montre comment cette protéine sécrétée s'accumule à forte densité dans le cytosol des cellules infectées et permet une détection sans ambiguïté de la morphologie de la cellule hôte infectée. La coloration du cytosquelette d'actine avec phalloidin fluorescent (figure 1D) fournit des informations sur la morphologie de la monocouche cellulaire inoculée complète et illustre en outre comment voisins non-infecté des cellules (noyaux cellulaires marqués d'un astérisque) do ne pas afficher tout étiquetage RICL. Il est intéressant de mentionner que, depuis les niveaux cytosoliques RICL dépendent du nombre de bactéries cytoplasmiques, nous avons noté une corrélation entre le signal détecté par immunofluorescence RICL et le nombre de L. monocytogenes par cellule: comme on l'observe sur la figure 1, les cellules voisines infectées par le faible nombre de bactéries présentent une coloration RICL réduit qui peut être quantifiée. Fait intéressant, il est également possible d'observer que RICL est facilement détectée dans les saillies formées par les bactéries capturés dans le procédé de propagation de cellule à cellule (Figure 1C) comme on l'observe également avec la coloration de l'actine (Figure 1D). Il faut noter que les bactéries ne sont pas directement colorées dans notre protocole, mais étant donné que le canal 488 nm n'est pas utilisé, L. monocytogenes peuvent être marquées en utilisant un sérum anti-bactérienne spécifique, sinon, les bactéries exprimant la GFP peuvent être utilisés en variante.

L'utilisation d'outils d'analyse d'imagerie tels que tCellProfiler il logicielle publique (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), il est possible de cellules de segment et pour mesurer le signal RICL individuels dans les cellules infectées, qui peut être utilisée pour estimer un indice d'infection pour une condition expérimentale spécifique. Comme le montre la figure 2, l'étiquetage des noyaux avec DAPI (figure 2A) et le cytosquelette d'actine avec phalloidin (figure 2C) fournissent les informations nécessaires à la segmentation cellulaire: les noyaux sont utilisés comme objets de référence pour l'identification des cellules individuelles (Figure 2B) et le cytoplasme est ensuite identifié en utilisant une fonction d'étalement à partir des noyaux qui prend en compte le signal du cytosquelette (figure 2D). Enfin, l'intensité du signal RICL peut être quantifiée pour chaque objet cellulaire identifiée (figures 2E et 2F) pour estimer le nombre d'des cellules infectées par la fixation d'un seuil pour l'intensité RICL que nous considérons comme négatif. L'indice d'infection est calculé comme le nombre de cellules infectées, divisé par le nombre total de cellules dans la population.

Notre protocole peut être couplé à des écrans de siRNA pour étudier la fonction de grands panneaux de molécules cibles dans l'infection des cellules hôtes de L. monocytogenes. Des contrôles sont nécessaires afin de valider l'efficacité de la transfection: par exemple, les siRNA ciblant KIF11 est une commande utilisée pour la transfection qui mène à la mort cellulaire, et donc l'absence de cellules à la fin de l'essai est une indication que la transfection a procédé de manière efficace. Pour répondre spécifiquement le L. monocytogenes processus d'invasion, siRNA inactivation du récepteur cellulaire Met dans les cellules HeLa conduit à une inhibition importante de l'entrée des bactéries dans les cellules hôtes et conduit à de très faibles niveaux de cellules RICL-positifs dans une monocouche cellulaire inoculée (figure3A) par rapport aux cellules traitées avec un siRNA contrôle brouillé (Figure 3B). La fonction de candidats molécules inconnues peut être étudiée avec notre test utilisant cette molécule cellulaire connu en tant que norme.

Figure 1
Figure 1. La détection de l'étiquetage RICL dans des cellules HeLa infectées avec L. monocytogenes souche P14.PrfA *. cellules HeLa CCL2 ont été infectées comme décrit dans notre protocole, transformés pour l'immunofluorescence et imagé à l'aide d'un objectif 63X. (A) image en contraste de phase, plusieurs P14.PrfA * bactéries sont indiqués par des flèches. (B) coloration DAPI (bleu), les mêmes bactéries individuelles que dans (A) sont marqués par des flèches. (C) Superposition de la coloration au DAPI (bleu) et l'RICL coloration (rouge), les noyaux des cellules non infectées sont marqués par un astérisque. (D) Superposition de la RICL (rouge) et l'actine signaux (en vert). Bar:. 5 pm Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. analyse de la segmentation des cellules HeLa infectées par L. monocytogenes souche EGDe.PrfA *. cellules HeLa ont été infectées CCL2 comme décrit dans notre protocole, transformés pour l'immunofluorescence et imagé à l'aide d'un objectif 10X. (A) signal de DAPI. (B) Superposition du signal DAPI (bleu) affiché dans (A) et le signal de l'actine (rouge) affiché dans (C) représentant la segmentation des noyaux (view encart élargie). (C) signal de l'actine. (D) de la même image (B) indiquant la segmentation des cellules. (E) Signal RICL. (F) de la même image en tant que (D) avec la superposition de la coloration RICL (en jaune). Bar:. 50 pm Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. . Variation de l'étiquetage RICL entre les cellules inactivées pour Met et les cellules de contrôle des cellules HeLa CCL2 ont d'abord inverser transfectées avec un pool de quatre siRNA ciblant le récepteur de la cellule hôte Met; 72 heures après transfection, les cellules ont été infectées comme décrit, traitées pour immunofluorescence et imagée en utilisant un objet 10xive. (A) Superposition du DAPI (bleu), actine (rouge) et RICL (jaune) dans des cellules inactivées pour Met. (B) des mêmes canaux que dans (A) concernant les cellules traitées avec un siRNA contrôle brouillé. Bar:. 50 pm Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Plusieurs paramètres sont essentiels pour le succès de notre protocole RICL de détection, y compris l'utilisation de lignées de cellules saines présentant un assez grand cytoplasme pour permettre une détection sans ambiguïté du signal RICL. Dans l'analyse que nous présentons dans cet article, nous proposons l'utilisation de cellules HeLa CCL2, qui sont particulièrement bien adapté à notre analyse en raison de l'extension de leur espace cytosolique; autres clones HeLa comme les cellules HeLa Kyoto affichent un cytoplasme plus petit, mais peuvent être utilisés avec notre protocole d'infection (cellules HeLa Kyoto sont particulièrement bien adaptées pour l'analyse de la segmentation puisque les cellules ne se chevauchent pas avec les cellules voisines, ce qui est souvent le cas pour les cellules HeLa CCL2). Les cellules présentant un très faible cytoplasme comme les polynucléaires ou les macrophages ne sont pas recommandés à utiliser en combinaison avec notre protocole.

Une limitation d'un protocole d'imagerie selon l'une nous présentons ici est le fait qu'une quantité minimale de cellules doit être infeDECT, dans une monocouche donnée dans des conditions de contrôle, afin de fournir le système avec suffisamment de puissance résolutoire: sinon, si quelques cellules sont infectées, il devient difficile de déterminer les changements dans les taux d'infection, en particulier lorsqu'il examine la fonction de candidats moléculaires potentielles qui sont devrait permettre de réduire l'infection. Cette limitation constitue un véritable problème lors de l'utilisation des cellules HeLa, qui expriment rencontré comme le seul récepteur de surface pour le L. monocytogenes protéine InlB et sont donc peu envahi par la plupart L. monocytogenes. Une alternative est d'utiliser une multiplicité très élevé d'infection (MOI> 100) qui peut augmenter le nombre de bactéries invasives, mais augmente le risque de dommages cellulaires liés à des niveaux plus élevés dans le milieu de culture cellulaire du pore bactérienne formant toxine listériolysine (également LLO), qui présente une activité cytotoxique très puissant. Autre alternative est l'utilisation de souches super-invasives telles que la souche EGDe.PrfA * présentée dans notre protocole, Ce qui permet l'utilisation d'une faible MOI (<25) et réduit la quantité d'effets cytotoxiques dépendant LLO; résultats obtenus avec un L. monocytogenes souche super-invasive peut être subséquemment validé en utilisant d'autres souches bactériennes moins virulentes dans d'autres types d'essais (voir ci-dessous). Une troisième alternative est d'utiliser une lignée cellulaire différente qui exprime à la fois la E-cadhérine et Met: c'est le cas pour les lignées cellulaires comme les JEG3 ou BeWo cellules trophoblastiques-comme, ou les cellules LoVo de carcinome du côlon, qui peut être envahi à la fois par l'INLA et les voies d'entrée InlB-charge; dans ces lignées cellulaires, des taux plus élevés d'infection de cellules peut être atteint en utilisant L. monocytogenes souches telles que EGDe, la souche parentale de EGDe.PrfA *. Il doit être pris en compte, cependant, que la redondance de fonctions dans les deux voies peut conduire à des effets de compensation dans une voie où un effecteur est inactivé dans l'autre voie, ce qui rend l'analyse des résultats difficile. Il est également important de mentionner thales cellules T ne doivent pas être sur-infecté afin de fournir le système avec une bonne gamme dynamique permettant la détection d'événements qui augmentent l'infection: dans notre protocole particulier, notre MOI conduit à un taux d'infection optimale de 30%.

Des méthodes alternatives pour étudier l'invasion des cellules hôtes par L. monocytogenes incluent l'invasion gentamicine dosage classique 26 qui est basé sur la mise à mort des bactéries extracellulaires par l'addition de gentamicine dans le milieu de culture de cellules après une période initiale de l'infection bactérienne (similaire à la procédure présentée dans la première partie de notre protocole de l'infection) et invasion est reçu par le plaquage des bactéries intracellulaires survivants sur des plaques de gélose et en comptant le nombre d'unités formant des colonies (UFC) qui croissent sur ces plaques. Cette méthode présente l'avantage d'utiliser la lecture la plus directe de l'infection, ce qui est le nombre précis de bactéries invasives qui sont effectivement protégée contre la gentamicine treatment dans l'espace cytoplasmique de cellules hôtes, mais cette méthode présente un seul afficheur pour une infection et une fois que les cellules hôtes sont lysées pour libérer UFC intracellulaires, il n'y a plus un enregistrement pour obtenir des informations concernant l'état réel de cellules au niveau du point d'extrémité de l'expérience. Notre protocole est basé sur une méthode indirecte, la détection de la protéine sécrétée RICL, mais comme mentionné précédemment, les niveaux d'cytoplasmique RICL en corrélation avec le nombre de cytosolique L. monocytogenes (Figure 1). En outre, la nature intrinsèque de notre essai de microscopie permet d'établir clairement le statut exact de cellules à la fin de l'infection: on peut donc extraire des informations concernant la morphologie cellulaire globale, la répartition du cytosquelette d'actine, de la phase du cycle cellulaire, etc, et effectuer une teneur élevée analyse de l'infection. Une caractéristique importante qui peut être extraite de ce type d'analyse est le contexte de la population et de son influence sur l'infection: En effet, des travaux récents de Pelkmans et collaborateurs 27 ont démontré que le contexte particulier de la population d'une cellule donnée (par exemple, la position de la périphérie à l'intérieur d'un groupe de cellules dans un îlot) affecte plusieurs fonctions cellulaires, y compris l'endocytose et la susceptibilité à l'infection par le virus. Notre analyse présente donc le potentiel pour l'extraction de ces informations.

Notre méthode présente un avantage supplémentaire: depuis RICL est une lecture tardive de l'infection due à sa sécrétion par des bactéries cytoplasmiques, signalisation accueil voies affectant les niveaux d'accumulation RICL dans des cellules hôtes pourraient affectent non seulement l'entrée des bactéries mais aussi évasion vacuolaire, la prolifération cytosolique et éventuellement la cellule à la propagation de la cellule. Par conséquent, notre procédé peut être utilisé en tant que primaire pour un affichage infection global et peut être couplé à des dosages secondaires pour disséquer l'étape d'infection spécifique qui a été perturbée par la frappe identifiée primaire à travers les écrans de siARN. Enfin, il est important de mentionner que notre méthode peut être upscalé et entièrement automatisé utilisant des dispositifs plaque de lave-glace, augmentant ainsi le nombre d'échantillons analysés dans une expérience unique tout en diminuant le niveau des résultats variation par rapport aux expériences réalisées manuellement.

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Disclosures

Nous n'avons rien à communiquer.

Acknowledgments

La recherche en laboratoire P. Cossart est soutenu par l'Institut Pasteur, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l'Institut National de la Recherche Agronomique, ERC avancée Grant (233348), l'Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), la Fondation Louis-Jeantet et la Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK est récipiendaire d'une bourse de l'Université Paris-Pasteur Programme Doctoral International / Institut Carnot Maladies Infectieuses. Nous remercions Jason Mercer pour optimiser le protocole de transfection cellulaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie Numéro 79 les cellules HeLa Listeria monocytogenes Infections bactériennes Gram-positives fluorescence Criblage à haut débit dosages l'ARN interférence Listeria monocytogenes l'infection la microscopie des petits ARN interférents

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Imagerie RICL sécrétion d&#39;enquêter sur l&#39;infection cellulaire par le pathogène bactérien<em&gt; Listeria monocytogenes</em
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Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

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