Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imaging inlc Secretion å etterforske Cellular Infeksjon av Bakteriell Patogen Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes er en Gram-positiv bakteriell patogen ofte brukt som en stor modell, for studier av intracellulære parasitt. Imaging sent L. monocytogenes infeksjon stadier innenfor rammen av små-interfererende RNA skjermer muliggjør global studie av mobilnettet veier som kreves for bakteriell infeksjon av målet vertsceller.

Abstract

Bakteriell intracellulære patogener kan bli oppfattet som molekylære verktøy for å dissekere cellulære signal kaskader på grunn av deres evne til å utsøkt manipulere og styrte celle funksjoner som er nødvendige for infeksjon av verts målet vev. Blant disse bakterielle patogener, Listeria monocytogenes er en Gram-positiv mikroorganisme som har vært brukt som et paradigme for intracellulær parasitt i karakterisering av cellulære immunresponser, og som har spilt instrument roller i oppdagelsen av molekylære veier kontrollerende cytoskeletal og membransmugler dynamikk. I denne artikkelen beskriver vi en robust mikroskopiske analyse for påvisning av sen cellular infeksjon stadier av L. monocytogenes basert på det fluorescerende merking av inlc, en utskilt bakterielt protein som akkumuleres i cytoplasma i infiserte celler, og dette assay kan bli koblet til automatiserte high-throughput små interfererende RNA-skjermer for å forkulleacterize cellulære signalveier involvert i opp-eller nedregulering av infeksjon.

Introduction

Den Gram positive bakterien Listeria monocytogenes er en matbåren patogen som invaderer vertsceller, forstyrrer dens intern vacuole og replikerer i cytoplasma av vertsceller en. L. monocytogenes enkel manipulasjon i laboratoriet sammenheng (rask vekst, lav toksisitet for friske individer) forbundet med utholdenhet av bakterielle virulens trekk observert i cellulære og dyremodeller (hemolytisk aktivitet, leukocytose) tillot sin opprinnelige bruk i 1960 som en viktig modell for studiet av intracellulære snylting og for etableringen av det teoretiske grunnlaget for cellulær immunitet mot infeksjon to. I slutten av 1980 og begynnelsen av 1990-tallet, disseksjon av bakterie intracellulær syklus 3 samt molekylær karakterisering av de viktigste bakteriell virulens faktorer 4-7 favoriserte bruk av L. monocytogenes som en nøkkel molekylære verktøy for manipulasjon og study av vertcellefunksjonene. Tilstedeværelsen av avirulent (L. innocua) og virulente (L. monocytogenes) arter i Listeria slekten banet vei for komparative genomiske studiene åtte som sammen med den nylige etableringen av komplett V. monocytogenes transcriptome 9, har økt vår forståelse av utviklingen av L. monocytogenes som et menneskelig patogen og som et modellsystem for infeksjonsstudier 10.

L. monocytogenes induserer sin internalisering i vertsceller på samspillet mellom bakterielle overflateproteiner INLA og InlB med sine vertscellereseptorer E-cadherin og møtte henholdsvis 11-12. Innledende kandidatbaserte undersøkelser førte til identifikasjon av α / β catenins-aktin kobling som en vesentlig komponent i INLA-invasjon veien 13 og for phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) som en kritisk effektor av InlB- avhengig invasjon cascade 14-15. Proteomic og funksjonell-baserte analyser senere tillot identifisering av nye cytoskeletal elementene 16 og lipid andre budbringere 17 som kreves for vertscellen invasjon. Transkripsjons studier 18 og massespektrometri-baserte kvantitative proteomikk 19 har nylig kaste nytt lys om aktivering av verts signaliserer kaskader og undertrykkelse av immunresponser under L. monocytogenes infeksjon. Systembiologi tilnærminger basert på inaktivering av store sett av gener (kinomes, komplette genomer) av små interfererende RNA (siRNA) stanse har nylig åpnet nye veier for analyse av globale vert signale kaskader i sammenheng med spesifikke cellulære funksjoner, inkludert fagocytose og patogen intern 20. Genome-wide siRNA-skjermer har tidligere blitt utført for å undersøke cellulære kaskader som kreves for infeksjon i L. monocytogenes i fagocyttisk Drosophila 21-22, men denne typen analyser er ikke utført i ikke-fagocytiske celler, som representerer viktige mål for infeksjon in vivo.

Vi har optimalisert en protokoll for den mikroskopiske påvisning av sene stadier av infeksjon med L. monocytogenes som er egnet for high-throughput siRNA studier av bakteriell oppføring i epitelceller. Vår analyse tar nytte av en meget inngripende L. monocytogenes belastningen som presenterer et punkt mutasjon i PrfA, de store transcriptional regulator av L. monocytogenes virulens faktorer 6: denne mutasjonen (oppkalt PrfA *) gjengir PrfA konstitutivt aktiv 23 og fører til økt uttrykk av invasjonen proteiner INLA og InlB, derfor favorisere bakterie oppføring i ellers dårlig infiserte ikke-fagocyttiske celler. Vår avlesning for infeksjon er basert på påvisning av den cytosoliske oppsamling av det utskilte bakterieprotein inlc: dette molekylet eren pleiotropisk effector som uttrykkes fortrinnsvis ved intra-cytoplasmatisk L. monocytogenes 9 og som deltar ikke bare i bakteriell celle-til-celle spre 24, men som også modulerer vert immunresponser 25. Den fluorescerende merking av inlc sekresjon av intracellulære bakterier ikke bare gjør det mulig å klart skille infiserte fra ikke-infiserte celler, men representerer også et ende-punkt avlesning som kan benyttes til senere å dissekere infeksjon i sine forskjellige trinn: registrering, vacuolar flukt, cytosoliske bakteriell spredning og celle-til-celle-spredning. Denne mikros-basert protokoll kan bli koblet til siRNA skjermer således å studere cellulære baner som er involvert i infeksjonen av vertsceller av L. monocytogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Forberedelse av Cellular og bakteriekulturer, Transfeksjonspartikler Transfeksjonspartikler Verktøy og primære antistoffer

  1. Forbered en frisk agar plate til å isolere enkelte L. monocytogenes kolonier fra en bakteriell glycerol lager (50% glycerol/50% mettet bakteriell væske over natten kultur) holdt ved -80 ° C.
    1. Ved hjelp av en aluminiumbeholder (oppbevart ved -80 ° C) for å transportere en frosne bakterie glycerol arkiv, stripe bakterier på et hjerne-hjerte-infusjon (BHI) agar plate.
    2. Inkuber platen ved 37 ° C i løpet av 48 timer (eller til individuelle bakteriekolonier kan isoleres).
    3. Hold denne arbeids plate etterpå ved 4 ° C i løpet av en maksimumstid på en måned (det vil bli brukt til frø flytende kulturer).
    4. I vår protokoll, bruker vi L. monocytogenes serotype 1/2a EGDe.PrfA * belastning, men som illustrert i figur 1, er L. monocytogenes serotype 4b P14.PrfA * belastning gir lignende resultater.
  2. HanLa ATCC CCL2 celler ble dyrket i Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i fravær av antibiotika.
  3. Uavhengige bassenger av egge (kontroll) og anti-MET sirnas er lagt i svarte 384-brønners mikroscellekultur plater.
    1. Fortynn 160 pmol av siRNA i 500 mL av RNase-fritt vann og tilsett 5 mL av denne løsningen per brønn (endelig konsentrasjon: 1,6 pmol).
    2. Hold denne platen ved -20 ° C i en periode på maksimum ett år.
  4. Polyklonale kanin-antistoffer mot den bakterielle protein inlc ha blitt oppnådd ved immunisering ved bruk av en inlc-GST rekombinant protein som beskrevet tidligere 25.

2. Omvendt siRNA Cell Transfection

  1. 72 timer før infeksjon føre til romtemperatur en svart 384-brønns mikroscellekulturplate inneholdende 1,6 pmol siRNA i 5 pl RNase-fritt vann i hver brønn.
  2. Sentrifuger plate i 3 min ved 300RCF ved romtemperatur for å få ned siRNA som kunne ha blitt avsatt på veggene i brønnene.
  3. Forbered romtemperatur DMEM supplert med 0,4% Lipofectamine RNAiMAX.
  4. Legg 25 mL av DMEM / RNAiMAX transfeksjon medium til hver brønn (ikke ruge transfeksjon medium lenger enn 20 min før du legger den til siRNA).
  5. Beveg plate frem og tilbake for å blande siRNA med transfeksjon løsning, og deretter holde platen i 1 time ved romtemperatur for å tillate siRNA-Lipofectamine-komplekser for å danne.
  6. Vask HeLa-celler fra en sammenflytende-eller sub-konfluent cellekulturkolbe én gang med 10 ml 37 ° C forvarmet PBS.
  7. Ta HeLa-celler ved å tilsette 1 ml 37 ° C forvarmet trypsin til cellekulturkolbe og inkuber i 3 til 5 minutter ved 37 ° C.
  8. Re-suspendere celler i 10 ml 37 ° C forvarmet DMEM supplert med 16% FBS.
  9. Telle celler og forberede en celle suspensjon av 12 000 celler per ml i DMEM supplert med16% FBS.
  10. Tilsett 50 ul av cellesuspensjon til hver brønn i 384-brønn plate.
  11. Beveg plate hurtig frem og tilbake for å fordele cellene og la cellene slå seg ned i 10 minutter ved romtemperatur.
  12. Forsegl plate med Parafilm og holde det i 72 timer i en fuktet 5% CO2-holdig atmosfære ved 37 ° C.

Tre. Cellular Infeksjon og Farging

  1. Dagen før infeksjon, ta en enkelt koloni av L. monocytogenes fra BHI agarplate og resuspender den i 5 ml flytende BHI-medium i en 15 ml polystyren-røret.
  2. Inkuber over natten ved 37 ° C i en shacking enhet for å muliggjøre bakteriell vekst.
  3. Dagen for infeksjon, vaskes 1 ml av over natten L. monocytogenes kultur ved sentrifuge 2 min ved 10 600 RCF på en table-top sentrifuge.
  4. Kast supernatanten (som inneholder utskilt cytotoxin Listeriolysin O) og re-suspendere pellet i 1 ml PBS (repeat vaske trinn 3 flere ganger).
  5. Les bakterielle optisk tetthet ved 600 nm og beregne antall bakterier (OD = 1 tilsvarer 1E9 bakterier / ml).
  6. Klargjør tilstrekkelig L. monocytogenes fortynning i DMEM supplert med 1% FBS: ved hjelp av svært invasive stammer som EGDe.PrfA *, foreslår vi at du bruker 5E4 bakterier i 30 mL av medium per brønn (mangfaldet av infeksjon er beregnet til 25 for 2000 celler).
  7. Fjern cellekulturmediet i hver brønn (80 ul) og erstatte den ved tilsetning av 30 pl av den L. monocytogenes-holdig medium.
  8. Sentrifuger plate ved 200 RCF i 5 min ved romtemperatur for å synkronisere infeksjonsprosessen.
  9. Inkuber platen i 1 time i en fuktet 5% CO2-holdig atmosfære ved 37 ° C på et forvarmet aluminiumblokk.
  10. Fjern L. monocytogenes holdig medium fra hver brønn og tilsett 30 pl av forvarmet DMEM supplert med 10% FBS og40 pg / ml gentamicin å drepe ekstracellulære L. monocytogenes.
  11. Inkuber i 4 timer i en 5% CO2-holdig atmosfære ved 37 ° C på et forvarmet metallblokk.
  12. Tilbered en løsning av PBS supplert med 8% formaldehyd (denne oppløsningen bør fremstilles frisk, slik at det formaldehyd-monomerer, i stedet for den para-formaldehyd-polymerer, blir brukt).
  13. Uten å forkaste cellekulturmedium, tilsett 30 pl av PBS supplert med 8% formaldehyd (endelig konsentrasjon: 4%) og inkuberes i 15 min ved romtemperatur.
  14. Fjern fiksativ-og vaske cellene tre ganger med 80 mL PBS per brønn (holde cellene i et sluttvolum på 80 pl av PBS per brønn).
  15. Forbered en 1:250 fortynning av kanin anti-inlc serum i PBS supplert med 0,2% saponin.
  16. Tilsett 10 pl av den primære antistoff-løsning til hver brønn etter fjerning av PBS og inkuberes i 30 min ved romtemperatur.
  17. Kast den primæreantistoff-oppløsning og vaske fire ganger med 40 ul PBS per brønn.
  18. Spe den sekundære Alexa Fluor 546-kombinert anti-kanin antistoff (1:250), den DAPI løsning (1:1,500) og phalloidin-Dy647 (1:150) i PBS supplert med 0,2% saponin.
  19. Tilsett 10 pl av denne sekundære flekker løsning til hver brønn og inkuber i 30 min ved romtemperatur.
  20. Kast den sekundære flekker løsningen og vask fire ganger med 40 ul PBS per brønn (la et sluttvolum på 40 ul i hver brønn, og forsegle plate).
  21. Platen kan avbildes umiddelbart eller kan lagres ved 4 ° C beskyttet mot lys (dekkes med aluminiumsfolie) for etterfølgende analyse.

4. Image Acquisition and Analysis

  1. Hente bilder i tre ulike kanaler (350 nm, 546 nm og 647 nm) ved hjelp av en 10X objektiv montert på en automatisert mikroskop (erverve fortrinnsvis 9 bilder per brønn).
  2. Den inlc signal kan måles ved hjelp av imageanalyse programvare som CellProfiler som tillater automatisert segmentering av atomkjerner og celle organer ved hjelp av DAPI og phalloidin farging, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorescerende merking av cytoplasmatisk inlc gir en robust avlesning for celle infeksjon av L. monocytogenes, som illustrert i Figur 1: den sentrale celle i mikrografi er sterkt infisert av belastningen P14.PrfA * 23 som det kan observeres i fasekontrastbilde (pilspisser, Figur 1A), og det bekreftes av DAPI signal hvor enkelte bakterier kan tydelig skilles (Figur 1B). Den inlc farging (overlagret på DAPI farging i figur 1C) viser hvordan dette utskilt protein tett akkumuleres i cytosol av infiserte celler og muliggjør en entydig deteksjon av den infiserte vert cellemorfologi. Farging av aktin cytoskjelettet med fluorescerende phalloidin (figur 1D) gir opplysninger om morfologi av hele inokulerte cellemonolayer og ytterligere illustrerer hvordan nabo ikke-infiserte celler (cellekjerner som er merket med en stjerne) do ikke vise noen inlc merking. Det er verdt å nevne at siden inlc cytosoliske nivåer er avhengig av antallet av cytoplasmiske bakterier, har vi registrert en korrelasjon mellom inlc signal detekteres av immunfluorescens og antallet L. monocytogenes per celle: som observert i figur 1, nabocellene infisert med lave bakterietall viser en redusert inlc flekker som kan kvantifiseres. Interessant nok er det også mulig å observere at inlc er lett oppdages i fremspringene som dannes av bakterier som er fanget i ferd med celle-til-celle-spredning (fig. 1C) som observert også med aktin farging (fig. 1D). Av notatet, er bakterier som ikke er direkte beiset i vår protokoll, men siden den 488 nm kanalen ikke brukes, L. monocytogenes kan merkes ved hjelp av et spesifikt anti-bakterielle serum, ellers kan GFP-uttrykkende bakterier alternativt brukes.

Bruk av verktøy bildeanalyse som tHan public programvare CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), er det mulig å segmentere celler og for å måle inlc signal i individuelle infiserte celler, noe som kan brukes til å estimere en infeksjon indeksen for en bestemt eksperimentell tilstand. Som vist i figur 2, merkingen av atomkjerner med DAPI (figur 2A), og aktin cytoskjelettet med phalloidin (figur 2C) gi den informasjon som er nødvendig for cellulær segmentering: kjernene blir brukt som referanseobjekter for identifikasjon av individuelle celler (figur 2B) og cytoplasma er senere identifisert ved hjelp av en spredning funksjon fra kjernene som tar hensyn til cytoskeletal signal (figur 2D). Til slutt, kan intensiteten av inlc signal bli kvantifisert for hver identifiserte cellulære gjenstand (figurene 2E og 2F) for å anslå antalletinfiserte celler ved å sette en terskel for inlc intensitet som vi anser som negativt. Infeksjonen Indeksen beregnes som antall infiserte celler dividert med det totale antall av celler i populasjonen.

Vår protokollen kan bli koblet til siRNA skjermer for å undersøke funksjonen av store paneler av målmolekyler i infeksjon av vertsceller av L. monocytogenes. Kontrollene er nødvendig for å bekrefte effektiviteten av transfeksjon, for eksempel siRNA målretting Kif11 en vanlig kontroll for transfeksjon som fører til celledød, og således fravær av celler ved slutten av analysen er en indikasjon på at transfeksjon satte effektivt. Å spesielt adressere L. monocytogenes invasjonsprosessen, siRNA inaktivering av den cellulære reseptor Met i HeLa-celler fører til en betydelig hemming av bakteriell inntreden i vertsceller og fører til svært lave nivåer av inlc-positive celler i en inokulerte cellulære monolag (fig.3A) sammenlignet med celler behandlet med en kodet siRNA-kontroll (figur 3B). Funksjonen av kandidat ukjente molekyler kan undersøkes med vår analyse ved bruk av denne kjente cellemolekyl som standard.

Figur 1
Figur 1. Påvisning av inlc merking i HeLa celler infisert med L. monocytogenes belastning P14.PrfA *. HeLa CCL2 cellene er blitt infisert som beskrevet i vår protokoll, bearbeidet for immunfluorescens og avbildes ved hjelp av en 63X objektiv. (A) Fase kontrast, er flere P14.PrfA * bakterier indikert av pilspisser. (B) DAPI farging (blå), er de samme enkelte bakterier som i (A) som er merket med pilspisser. (C) overlagring av DAPI farging (blått) og denInlc farging (rød), er kjernen av ikke-infiserte celler som er merket med en stjerne. (D) overlagring av inlc (rød) og aktin (grønne) signaler. Bar:. 5 mikrometer Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. Segmentering analyse av HeLa celler infisert med L. monocytogenes belastning EGDe.PrfA *. HeLa CCL2 celler ble infisert som beskrevet i vår protokoll, bearbeidet for immunfluorescens og avbildes ved hjelp av en 10X objektiv. (A) DAPI signal. (B) overlagring av DAPI-signalet (blå) som vist i (A) og aktin signal (rødt) som vises i (C) som viser segmentering av kjernen (view forstørret innfelt). (C) Actin-signal. (D) Samme bilde som (B) viser segmenteringen av cellene. (E) inlc signal. (F) har samme trykk som (D) med overlagring av den inlc farging (gul). Bar:. 50 mikrometer Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. . Variant av inlc merking mellom celler inaktivert for Met-og kontrollceller HeLa CCL2 celler ble opprinnelig reverse-transfektert med en pool av fire siRNAs rettet verten celle reseptor Met, 72 timer etter transfeksjon ble cellene infisert som beskrevet, bearbeidet for immunfluorescens og avbildes med et 10x objektive. (A) overlagring av DAPI (blå), aktin (rød) og inlc (gul) i celler inaktivert for Met. (B) De samme kanaler som i (a) om-celler som ble behandlet med en kodet siRNA kontroll. Bar:. 50 mikrometer Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere parametere er kritiske for hvor vellykket inlc-deteksjon protokollen, herunder bruk av friske cellelinjer som viser en tilstrekkelig stor cytoplasma til å tillate en utvetydig påvisning av inlc signal. I analysen presenteres i denne artikkelen man foreslår derfor bruken av HeLa-celler CCL2, noe som er spesielt godt egnet for vår analyse på grunn av forlengelsen av de cytosoliske plass, andre HeLa-kloner som HeLa-celler Kyoto vise et mindre cytoplasma men kan benyttes med vår infeksjon protokollen (HeLa Kyoto celler er spesielt godt tilrettelagt for segmentering analyse siden cellene ikke overlapper med nabocellene, noe som ofte er tilfelle for HeLa CCL2 celler). Celler som presenterer en svært liten cytoplasma som polymorfnukleære celler eller makrofager er ikke anbefalt å bruke i kombinasjon med vår protokoll.

En begrensning av en avbildningsprotokoll som den vi presenterer her er at en minimal mengde av celler som skal Infected, i en gitt monolag i kontrollbetingelser, for å gi systemet med tilstrekkelig resolutive strøm: ellers, hvis noen celler er infisert, blir det vanskelig å bestemme endringer i infeksjonstilfeller, spesielt når undersøke funksjonen av potensielle kandidater molekylære som befinner forventes å redusere infeksjon. Denne begrensningen representerer et virkelig problem ved bruk av HeLa-celler, som uttrykker Met som det eneste overflatereseptoren for L. monocytogenes protein InlB og er derfor dårlig invadert av de fleste L. monocytogenes. Et alternativ er å bruke en meget høy multiplisitet av infeksjon (MOI> 100) som kan øke antallet av invasive bakterier, men også øke risikoen for celleskader på grunn av høyere nivåer i cellekulturmedium av den bakterielle poredannende toksiner Listeriolysin O ( LLO), som viser en svært potent cytotoksisk aktivitet. Annet alternativ er bruk av super-invasive stammer slik som EGDe.PrfA * belastningen presentert i vår protokollen, Noe som tillater bruk av en lav MOI (<25), og reduserer mengden av LLO-avhengige cytotoksiske effekter; resultater oppnådd med en L. monocytogenes super-invasiv belastningen kan deretter bli validert ved å bruke andre mindre virulente bakteriestammer i andre typer analyser (se nedenfor). Et tredje alternativ er å bruke en annen cellelinje som uttrykker både E-cadherin og Met: det er tilfelle for cellelinjer som trophoblast lignende Jeg3 eller BeWo celler, eller tykktarmskreft LoVo celler, som kan bli invadert av både den INLA-og InlB-avhengige oppføring trasé, i disse cellelinjer, høyere forekomst av celle infeksjon kan nås ved hjelp av L. monocytogenes som EGDE, foreldre stamme av EGDe.PrfA *. Det bør tas i betraktning, kan imidlertid at redundans av funksjoner i begge veier fører til kompensasjon av effekter i en bane ved en effektor inaktiveres i den andre bane, slik at analyse av resultater vanskelig. Det er også viktig å nevne thaT-cellene bør ikke være over-infisert for å gi systemet med et godt dynamisk område som tillater deteksjon av hendelser som øker infeksjon: i våre bestemt protokoll, fører vår MOI til en optimal infeksjonsgrad på 30%.

Alternative metoder for å studere invasjonen av vertsceller av L. monocytogenes omfatter den klassiske gentamicin invasjon assay 26 som er basert på å drepe ekstracellulære bakterier ved tilsetning av gentamicin til cellekulturmediet etter en innledende periode av bakteriell infeksjon (tilsvarende den fremgangsmåte som er presentert i den første del av infeksjon protokoll) og invasjon lages av platekledning de overlevende intracellulære bakterier på agarplater, og telling av antallet av kolonidannende enheter (CFUs) som vokser på disse platene. Denne fremgangsmåte viser fordelen av å bruke den mest direkte avlesning for infeksjon, som er den nøyaktige antall invasive bakterier som faktisk er beskyttet fra gentamicin treatment i det cytoplasmiske plass av vertsceller, men viser denne metoden en enkelt avlesning for smitte og når vertscellene blir lysert for å frigi intracellulære CFUs, er det ikke lenger er en registrering for å motta informasjon vedrørende den nåværende status for celler ved endepunktet av eksperimentet. Vår protokollen er basert på en indirekte metode, påvisning av det utskilte inlc protein, men som nevnt tidligere, er nivået av cytoplasmisk inlc korrelerer med antallet cytosoliske L. monocytogenes (Figur 1). Videre tillater den iboende natur vår mikros assay for å etablere tydelig den nøyaktige stilling av cellene ved slutten av infeksjonen: Vi kan derfor trekke ut informasjon vedrørende global cellulær morfologi, aktin cytoskjelettet fordeling, cellesyklusfase, etc. og utføre høyt innhold Analysen av infeksjonen. En viktig funksjon som kan utvinnes fra denne typen analyse er befolkningen kontekst og dens innflytelse på infeksjon: Faktisk nylig arbeid fra Pelkmans og medarbeidere 27 demonstrerte at den aktuelle befolkning sammenheng med en gitt celle (for eksempel, dets posisjon fra periferien i en gruppe celler i en holme) påvirker flere cellulære funksjoner inkludert endocytose og mottakelighet for virusinfeksjon. Vår analyse presenterer derfor et potensial for utvinning av denne informasjonen.

Vår metode presenterer en ekstra fordel: Siden inlc er en sen avlesning av infeksjon på grunn av sin sekresjon av cytoplasmatiske bakterier, kunne vert signalveier som påvirker nivåene av inlc opphopning i vertsceller potensielt påvirke ikke bare bakterie oppføring, men også vacuolar flukt, cytosolic spredning og etter hvert celle-til celle spredning. Derfor kan foreliggende fremgangsmåte anvendes som en primær avlesning for global infeksjon og kan kobles til sekundær assays for å dissekere spesifikk infeksjon trinn som er bestemt av det primære hit identifisert ved siRNA skjermer. Til slutt er det viktig å nevne at foreliggende fremgangsmåte kan bygges opp og helautomatisk ved hjelp av platevasker enheter, øker dermed antall prøver som ble analysert i et enkelt eksperiment samtidig redusere nivået av resultatene variasjon i forhold til eksperimenter utført manuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning i P. COSSART laboratorium støttes av Pasteur Institute, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233 348), den Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), Louis-JEANTET Foundation og Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK er en mottaker av et stipend fra Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot sykdommer Infectieuses. Vi takker Jason Mercer for optimalisering av mobilnettet transfeksjon protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Tags

Immunologi HeLa celler Listeria monocytogenes gram-positive bakterielle infeksjoner fluorescens high-throughput screening-analyser RNA interferens Listeria monocytogenes Infeksjon mikroskopi små interfererende RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Imaging inlc Secretion å etterforske Cellular Infeksjon av Bakteriell Patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter