Summary
Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.
Abstract
A pesar de la disponibilidad de terapia y vacuna, la tuberculosis (TB) sigue siendo una de las infecciones bacterianas más mortales y extendidas del mundo. Desde hace varias décadas, la explosión repentina de cepas multirresistentes y ampliamente resistentes a los medicamentos es una grave amenaza para el control de la tuberculosis. Por lo tanto, es esencial identificar nuevas dianas y vías críticas para el agente causal de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)y buscar nuevos productos químicos que podrían convertirse en fármacos contra la tuberculosis. Un enfoque es establecer métodos adecuados para las pantallas genéticas y químicas de bibliotecas a gran escala que permitan la búsqueda de una aguja en un pajar. Con este fin, desarrollamos un ensayo fenotípico que se basa en la detección de Mtb marcado fluorescentemente dentro de las células huésped etiquetadas fluorescentemente utilizando microscopía confocal automatizada. Este ensayo in vitro permite una cuantificación basada en imágenes del proceso de colonización de Mtb en el huésped y se optimizó para el formato de microplaca de 384 pozos, que es adecuado para pantallas de bibliotecas de mutantes de siRNA, compuestos químicos o Mtb. Las imágenes se procesan entonces para el análisis multiparamétrico, que proporciona la lectura hacia fuera que infiere en la patogenesia del Mtb dentro de las células huesped.
Introduction
Entre los patógenos infecciosos emergentes y reemergentes reportados durante los últimos años, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)ocupa un lugar destacado siendo responsable de 1,4 millones de muertes y 8,7 millones de nuevas infecciones en 2011 (Informe Mundial de Tuberculosis 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). A pesar de la disponibilidad de terapias multidrogas, el número de personas infectadas sigue en aumento y el Mtb multirresistente (MDR) y ampliamente farmacorresistente (XDR) se está extendiendo rápidamente por todo el mundo1. Por otra parte, si se tiene en cuenta la presencia de antígenos mtb, es evidente que un tercio de la población mundial se considera que está infectada latentemente por mtb. Estadísticamente, en un caso de cada diez, hay evolución hacia la forma activa de la enfermedad con síntomas clínicos posteriores2. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevos medios para luchar contra el Mtb. En este contexto, desarrollamos un ensayo fenotípico visual in vitro basado en el seguimiento de la invasión de Mtb y la multiplicación en las células huésped mediante microscopía de fluorescencia confocal automatizada3. La adaptación del ensayo en placas de microtíter de 384 pozos en combinación con la adquisición y el análisis automatizados de imágenes, permitió la detección de alto contenido / alto rendimiento (HC / HTS) de bibliotecas de escala media de compuestos, siRNAs y mutantes bacterianos. La investigación de una biblioteca amplia del genoma RNAi en este análisis fenotípico permitió así la identificación de los anfitrión-factores dominantes implicados en tráfico de Mtb y la réplica intracelular pero también la aclaración de los anfitrión-caminos explotados por el bacilo del tubérculo. Otra adaptación de este análisis fenotípico particular estaba para la identificación de los factores bacterianos esenciales a la persistencia intraphagosomal del Mtb. Por ejemplo, la detención de la maduración del fagosoma se considera como uno de los principales mecanismos que facilita la supervivencia y replicación de Mtb en los macrófagos. El monitoreo de la localización subcelular de mutantes knock-out mtb en compartimentos fluorescentemente etiquetados como ácidos permitió la identificación de genes bacterianos involucrados en el proceso de supervivencia4. Finalmente, la imagen de alto contenido de Mtb también ofrece un excelente método para cuantificar la eficiencia de los fármacos para inhibir diversos fenómenos como el crecimiento bacteriano intracelular3. En conjunto, este tipo de ensayo fenotípico de alto rendimiento permite acelerar el descubrimiento de fármacos contra la TB y los datos recogidos por estos diferentes enfoques contribuyen a una mejor comprensión de la manipulación del huésped ejercida por Mtb.
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Protocol
1. Detección de siRNA en todo el genoma de alto rendimiento
La investigación realizada en un tipo humano de los pneumocytes del tipo II modelo A549 la línea de células sobre la infección con mtb H37Rv que expresa la proteína fluorescente verde (GFP). Este procedimiento se describe en la Figura 1A.
- Resuspend la biblioteca de siRNA seca que se almacena en placas madre (placas de 96 pozos) con 1x tampón de siRNA para alcanzar una concentración de 4 μM, luego transfiera 10 μl de la mezcla en una placa hija de 384 pozos (placa hija 1).
- Añadir 10 μl de 1x tampón de siRNA en la placa hija 1 para diluir el siRNA por 2 veces. Después de la resuspensión de siRNA, las placas se sellan con sello de aluminio pelable y se pueden almacenar a -20 ° C al menos 6 meses y hasta 2-3 años, pero el tiempo de almacenamiento puede variar dependiendo de las recomendaciones del fabricante de la biblioteca de siRNA.
- Diluir los siRNAs en la placa hija 1 en la placa hija 2 para alcanzar una concentración de 500 nM. Después de la resuspensión de siRNA, las placas se sellan con sello de aluminio pelable y se pueden almacenar a -20 ° C al menos 6 meses y hasta 2-3 años, pero el tiempo de almacenamiento puede variar dependiendo de las recomendaciones del fabricante de la biblioteca de siRNA.
- Antes de su uso, descongelar la placa hija 2 a temperatura ambiente.
- Tome 2,5 μl de siRNA de la placa hija 2 y colóquelos en una placa de ensayo de 384 pozos.
- En la misma placa de ensayo de 384 pozos en el paso 1.5, agregue 2.5 μl de siRNA de control negativo y positivo a sus respectivos pozos.
- Diluya el reactivo de transfección en 1x D-PBS para producir suficiente solución para proporcionar un reactivo de transfección de 0,1 μl en cada pozo y preincuba la solución de transfección diluida a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir 7,5 μl de la mezcla de reactivo de transfección/solución de PBS a cada pozo de la placa de ensayo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Añadir 40 μl de células A549 (1.500 células/pozo) suspendidas en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS). Mantener las células durante un período de incubación de 3 días a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2. Estas células se dividen cada 24 horas, por lo que unas 12.000 células están en los pozos tres días después de la transfección.
- Lave un cultivo de Mtb H37Rv que exprese GFP de dos semanas de edad con D-PBS (libre de MgCl2 y CaCl2)por centrifugación a 4,000 x g durante 5 min y deseche los lavados. Repita este paso 3x. (Para las condiciones de cultivoGFP-Mtb H37Rv, consulte el Protocolo 3).
- Suspender el pellet bacteriano en 10 ml de RPMI 1640 medio suplementados con 10% de FBS y decantar durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que los agregados bacterianos se sedimenten.
- Recoger el sobrenadante bacteriano y medir OD600 (OD600 debe estar entre 0.6-0.8) y GFP-fluorescencia (valor de RFU) utilizando un lector de microplacas para determinar la concentración bacteriana. Calcule el título de la suspensión utilizando una línea de regresión de referencia que muestre el valor de RFU = f (valor de CFU) que se había generado antes del experimento en otro cultivo que se había preparado en las mismas condiciones. Preparar suspensión bacteriana que contenga 2,4 x 106 bacterias/ml, que corresponde a una multiplicidad de infección (MOI) de 5.
- Retire el medio en la placa de ensayo de 384 pozos y agregue 25 μl de suspensión bacteriana recién preparada.
- Incubar la placa de ensayo de 384 pozos a 37 °C durante 5 horas en una atmósfera que contenga un 5% de CO2.
- Retire el medio y lave suavemente las células con el medio RPMI complementado con 10% FBS 3x.
- Para matar las bacterias extracelulares restantes, trate las células con 50 μl de medio RPMI-FBS fresco que contenga 50 μg/ml de amikacina a 37 °C durante 1 hora en una atmósfera que contenga 5% de CO2.
- Retire la amikacina que contiene el medio y agregue 50 μl de medio RPMI fresco complementado con 10% de FBS. Incubar la placa de ensayo de 384 pozos a 37 °C durante 5 días en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.
- Antes de la adquisición de la imagen, añadir 10 μl de 30 μg/ml de DAPI recién preparados en PBS (concentración final de 5 μg/ml) e incubar durante 10 min a 37 °C.
- Cargue la placa en un microscopio confocal automatizado.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Establezca los parámetros de exposición. Registre la fluorescencia DAPI utilizando láser de excitación de 405 nm con filtro de emisión de 450 nm y fluorescencia GFP utilizando láser de excitación de 488 nm con filtro de emisión de 520 nm.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Seleccione los pozos y los campos en cada pozo que se va a adquirir, que luego se conoce como parámetros de diseño y subdiseño.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Genere el archivo de experimento utilizando los parámetros de los pasos 1.20 y 1.21 y ejecute la adquisición automática.
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Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Transferir imágenes al servidor remoto.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Evalúe las imágenes utilizando el software de análisis de imágenes. Detectar núcleos celulares del canal DAPI utilizando el algoritmo de detección de núcleos y el área bacteriana del canal GFP utilizando el algoritmo de propiedades de intensidad de píxeles (Figura 4A).
Nota: Este protocolo está optimizado para estudiar el efecto del silenciamiento génico sobre el crecimiento intracelular de Mtb. Mtb es una bacteria de crecimiento lento que se divide cada 20 horas en condiciones óptimas. Después de 5 días después de la infección, la cantidad de Mtb extracelular sigue siendo baja en ausencia de lisis celular y no afectó la calidad del análisis. Este protocolo debe optimizarse en términos de duración del tratamiento con antibióticos y tiempo de incubación para adaptarse a las pantallas de siRNA utilizando bacterias de crecimiento rápido como Mycobacteria smegmatis y Escherichia coli que se liberan ampliamente y pueden infectar nuevas células.
2. Cribado de compuestos de alto rendimiento
La investigación realizada en las células huésped infectadas mtb H37Rv. Este procedimiento se describe en la Figura 1B.
- Descongelar las placas madre de 384 pozos que contienen la biblioteca compuesta solubilizada en DMSO al 100%. Transferir 0,5 μl de los compuestos en placas hijas de 384 pozos que contienen 10 μl de medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10%.
- Lave un cultivo de Mtb H37Rv que exprese GFP de dos semanas de edad con D-PBS (libre de MgCl2 y CaCl2)por centrifugación a 4,000 x g durante 5 min y deseche los lavados. Repita este paso 3x (para las condiciones de cultivoGFP-Mtb H37Rv, consulte el Protocolo 3).
- Suspender el pellet bacteriano en 10 ml de RPMI 1640 medio suplementados con 10% de FBS y decantar durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que los agregados bacterianos se sedimenten.
- Recoger el sobrenadante bacteriano y medir OD600 (OD600 debe estar entre 0.6-0.8) y GFP-fluorescencia (valor de RFU) utilizando un lector de microplacas. Calcule el título de la suspensión utilizando una línea de regresión de referencia que muestre el valor de RFU = f (valor de CFU) que se había generado antes del experimento. La concentración típica es de 1 x 108 bacterias/ml.
- Cosechar 6 días de edad de macrófagos humanos primarios a 4 x 105 células/ml en rpmi 1640 medio complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 50 ng/ml M-CSF humano recombinante (Para la purificación de células de monocitos de sangre periférica humana y la diferenciación de macrófagos ver Protocolo 4).
- Incubar las células primarias diluidas con bacilos a diferentes MOI, variando de 1-5, en suspensión con temblor leve a 90 rpm durante 2 horas a 37 °C.
- Lave las células infectadas por centrifugación a 350 x g para eliminar las bacterias extracelulares. Después de cada paso de centrifugación, resuspend el pellet en rpmi 1640 medio complementado con 10% FBS. Repita este paso 2x.
- Suspender las células infectadas en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% y amikacina a 50 μg/ml e incubar la suspensión con temblores leves durante 1 hora a 37 °C.
- Retire el medio de cultivo celular que contiene amikacina por centrifugación a 350 x g y lave las células infectadas con un medio RPMI 1640 completo complementado con 10% de FBS y 50 ng/ml de M-CSF humano recombinante. Repita una vez.
- Añadir 40 μl de la suspensión de macrófagos infectados en la misma placa de ensayo en el paso 2.1, que ya contiene 10 μl de las diluciones compuestas. La concentración final de DMSO en cada pozo ha alcanzado ahora el 1%.
- Incubar las placas de ensayo durante 5 días a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.
- Manche las células vivas con el tinte fluorescente lejano-rojo célula-permeante.
- Cargue la placa en un microscopio confocal automatizado.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Establezca los parámetros de exposición. Registre la fluorescencia de color rojo lejano utilizando láser de excitación de 640 nm con filtro de emisión de 690 nm y fluorescencia GFP utilizando láser de excitación de 488 nm con filtro de emisión de 520 nm.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Seleccione los pozos y los campos en cada pozo que se va a adquirir, que luego se conoce como parámetros de diseño y subdiseño.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Genere el archivo de experimento utilizando los parámetros de los pasos 2.14 y 2.15 y ejecute la adquisición automática.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Transferir imágenes al servidor remoto.
Haga clic aquí para ver la imagen más grande. - Evalúe las imágenes utilizando el software de análisis de imágenes. Detecte el área celular del canal rojo lejano utilizando el algoritmo de propiedades de intensidad de píxeles y el área bacteriana del canal GFP utilizando el algoritmo de propiedades de intensidad de píxeles (Figura 4B).
Nota: Este protocolo se puede adaptar para la detección de la biblioteca de mutantes Mtb mediante la sustitución de compuestos por mutantes que expresan una proteína fluorescente (un pozo / un mutante) (Figura 1C, véase también Brodin et al. 4). Los mutantes fluorescentes se siembran por primera vez en pozos (20 μl de suspensión bacteriana por pozo). Las bacterias se recuperan entonces por 30 μl de suspensión celular. Después de la centrifugación a 350 x g durante 1 min, la placa se incuba a 37 °C en una atmósfera que contiene un 5% deCO2. El tiempo de incubación y el MOI dependen del ensayo. Como ejemplo, para la visualización de eventos celulares tempranos como la acidificación del fagosoma, las células pueden infectarse durante 2 horas con MOI que van desde 1-20. Los lisosomas se tiñen con tinte Lysotracker a 2 μM durante 1,5 horas a 37 °C en una atmósfera que contiene 5% de CO2 y luego se fijan con formol al 10% o al 4% de paraformadehído (PFA). Las imágenes confocales se adquieren y finalmente se analizan utilizando scripts de análisis de imágenes con algoritmos apropiados para la detección de lisosomas y la localización subcelular4.
3. Proteína fluorescente verde que expresa mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Condiciones de cultivo
Para el almacenamiento a largo plazo, GFP-H37Rv se congelaron en D-PBS (alrededor de 1 x 108 micobacterias por vial).
- Resuspend un vial de GFP-H37Rv congelado en un matraz Erlenmeyer que contenga 50 ml de medio caldo 7H9 complementado con enriquecimiento de Middlebrook OADC al 10%, glicerol al 0,5%, tween-80 al 0,05% e higromicina B (50 μg/ml).
- Incubar 8 días a 37 °C.
- Mida OD600 de la cultura GFP-H37Rv.
- Diluir el cultivo de GFP-H37Rv para obtener OD600= 0,1 en medio caldo fresco 7H9 suplementado con enriquecimiento de Middlebrook OADC al 10%, Glicerol al 0,5%, Tween-80 al 0,05% e Higromicina B (50 μg/ml).
- Incubar el GFP-H37Rv a 37 °C durante 8 días más antes de usarlo para el ensayo.
4. Purificación de células de monocitos de sangre periférica humana de sangre entera o preparación de capa de Buffy
- Diluir la bolsa de sangre 2x en 1x D-PBS (libre de MgCl2 y CaCl2)que contiene 1% de FBS.
- Aislar los monocitos por Centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll a 400 x g durante 20 min.
- Recoger los monocitos aislados.
- Lavar los monocitos 3x con 1x D-PBS (libre de MgCl2 y CaCl2)que contiene 1% de FBS por centrifugación a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Concentrar las células hasta 1 x 107 células/ml.
- Purificar monocitos usando perlas magnéticas CD14 de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Materiales).
- Después de la purificación de los monocitos CD14, sembraron las células a 1,5 x10 6 células/ml en RPMI 1640 complementadas con 10% de FBS y 40 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (hM-CSF) e incubadas durante 4 días a 37 °C en una atmósfera que contiene 5% de CO2.
- Después de 4 días sustituir el medio por RPMI 1640 fresco complementado con 10% de FBS y 40 ng/ml de hM-CSF e incubado durante 2 días a 37 °C en una atmósfera que contiene un 5% deCO2.
- Después de 6 días, las células se pueden utilizar para el ensayo.
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Representative Results
Detección de siRNA en todo el genoma de alto rendimiento
Mtb es capaz de colonizar las células inmunes in vitro, así como varias otras células epiteliales pulmonares. Por ejemplo, Mtbes capaz de infectar y dañar las células epiteliales A549 que se utilizan comúnmente como modelo para los neumocitos humanos tipo II5-7. La dectina-1 fue reportada como un receptor de células huésped implicado en la captación de Mtb, la respuesta proinflamatoria y el efecto antibacteriano sobre el crecimiento micobacteriano intracelular en las células A5498. La condición del siRNA descrita en el protocolo 1 llevó al 85% de eficacia de silenciamiento (datos no mostrados). El silenciamiento de la expresión de Dectin-1 con siRNA llevó a una disminución de la cantidad intracelular de las micobacterias en las células A549. De hecho, después de 3 días de silenciamiento y 5 días de infección, el porcentaje de células infectadas se reduce dos veces en las células A549 silenciadas de Dectin-1 en comparación con las células transfectadas con siRNA de lucha no objetivo(Figuras 2A y 2B). Se aplicó la normalización basada en muestras de siRNA dirigido Dectin-1 en comparación con scramble para definir la puntuación Z. Como se muestra en la Figura 2C,obtuvimos un promedio de puntuación Z alrededor de -15 para el siRNA dirigido a Dectin-1. Dectin-1 se puede utilizar como control positivo para la pantalla del siRNA para descubrir otro factor nuevo del anfitrión implicado en la colonización de Mtb en pneumocytes que podrían tener el mismo fenotipo que ése con el siRNA de Dectin. El uso de un siRNA impactante en el fenotipo como control en cada microplaca durante la pantalla permite la normalización de cada placa, lo que es útil cuando se quiere realizar un análisis de pantalla del genoma completo. El parámetro estadístico Z' fue de 0,1 utilizando la normalización basada en el control en scramble y siRNA dirigido a Dectin1, que es un valor aceptable para la validación de los datos de cribado de siRNA.
Cribado compuesto de alto contenido
La eficiencia del compuesto en el crecimiento bacteriano intracelular se evalúa estableciendo una curva de dosis-respuesta (DRC) y se normaliza a los controles de referencia de compuestos positivos y disolventes compuestos negativos. La RDC representativa de dos compuestos de referencia, la isoniazida (INH) y la rifampicina (RIF), activos contra el crecimiento de Mtb, se muestran en la Figura 3. Estas curvas se obtienen en macrófagos primarios humanos infectados por una cepa de Mtb H37Rv que expresa GFP, con lectura después de 5 días después de la infección. DMSO e INH a una concentración final de 1% y 0,1 μg/ml respectivamente se utilizan comúnmente como controles negativos y positivos, proporcionando niveles basales de eficiencia (0 y 100%) (Figura 3A). Siguiendo el proceso de análisis de imágenes detallado en la Figura 4B,se extraen datos multiparamétricos de imágenes de fluorescencia confocal de macrófagos humanos infectados tomadas por microscopio confocal automatizado. Los compuestos activos que impactan en la replicación intracelular de Mtb en células huésped llevaron a una disminución de la carga de micobacterias, que corresponde al área de la señal de GFP en las células en imágenes (Figura 3B). La relación entre el área bacteriana intracelular y el área celular total, calculada utilizando un software de análisis basado en imágenes, se traza en función de la concentración de compuestos, lo que genera la DRC (Figura 3B). Estas curvas permiten determinar tanto la concentración necesaria para disminuir la carga bacteriana en un 50% (IC50)como la concentración mínima requerida para inhibir el 99% de la replicación bacteriana (MIC99)(Figura 3C). Z' basado en el control DMSO 1% y el control INH 0,1 μg/ml fue de 0,49. Esta Z', muy cerca de 0,5, es aceptable para validar este ensayo.
Figura 1. Enfoques de detección visual de alto contenido. Representación esquemática del sistema modelo de infección por Mtb utilizado para las pantallas de siRNA(A),compuestos químicos(B)y mutantes mtb (C). (A)pantalla de la biblioteca del siRNA: las células fueron transfectadas con el siRNA por 3 días en las placas de 384 pozos usando método reverso de la transfección. Las células transfectadas de siRNA fueron infectadas conGFP-Mtb e incubadas durante 5 días a 37 °C en una atmósfera que contenía un 5% deCO2. Las células entonces fueron manchadas y las imágenes fueron recogidas usando un microscopio confocal automatizado. (B)Pantalla de biblioteca de compuestos: los compuestos se distribuyeron en placas de 384 pozos. La suspensión celular y GFP-Mtb se incubaron juntas durante 2 horas a 37 °C. Las células infectadas se sembraron en las placas y se incubaron durante 5 días a 37 °C en una atmósfera que contenía un 5% deCO2. Las células entonces fueron manchadas y las imágenes fueron recogidas usando un microscopio confocal automatizado. (C)Biblioteca de mutantes fluorescentes deMtb: los mutantes fluorescentes de Mtb se sembraron en placas de 384 pozos y se distribuyó la suspensión de la célula huésped. El tiempo de incubación varió dependiendo del ensayo. Las células o las vesículas celulares fueron manchadas antes de la adquisición automatizada de la imagen. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. El silenciamiento de Dectin-1 impacta en la colonización de Mtb en células A549. (A)Imágenes confocales representativas (lente de aire 10X) de células A549 transfectadas con siRNA no objetivo (scramble) o con siRNA específico para Dectin-1 e infectadas con GFP-Mtb H37Rv (MOI5) durante 5 días. La barra de escala representa 200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv se visualizaron en verde y las células en rojo. El número de células(A. Detección celular) y la carga intracelular de GFP-Mtb H37Rv(A. Área bacteriana) se determinaron utilizando software de análisis basado en imágenes. (B)Representación gráfica del porcentaje de células A549 infectadas en 5 réplicas (w1 a w5) de Scramble siRNA (círculos azules) y Dectin-1 siRNA (círculos rojos). (C)Representación gráfica del promedio de la puntuación Z de Scramble siRNA y Dectin-1 siRNA. (*** valor p < 0.0001). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Curva de respuesta a la dosis de compuestos de referencia activos contra Mtb en macrófagos humanos. (A y B)Imágenes confocales representativas (lente de agua 20X) de macrófagos humanos (rojos, células etiquetadas con colorante fluorescente rojo) infectados con GFP-Mtb H37Rv (verde) con un MOI1 durante 5 días. La barra de escala representa 50 μm. (A)Imágenes de células infectadas incubadas con DMSO al 1% utilizadas como control negativo en el ensayo. (B)Imágenes de células infectadas incubadas con concentración creciente de dos compuestos de referencia isonazida (INH) y rifampicina (RIF). (C) Curvas dosis-respuesta (RDC) de INH y RIF. El análisis basado en imágenes permitió la determinación de la DRC para cada compuesto probado. Drc representa la relación entre el área intracelular GFP-bacteriana y el área celular total (eje Y), en función de la concentración compuesta (escala logarítmica, eje x). En cada gráfica, la RDC del compuesto se normalizó a la del control negativo DMSO al 1% (0% de inhibición) y el control positivo inh a una concentración de 0,1 μg/ml (100% de inhibición). Para cada compuesto, la concentración requerida para inhibir el 50% de la colonización bacteriana (IC50)y la concentración inhibitoria mínima (MIC99)se calcularon a partir de la RDC. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 4. Análisis estándar basado en imágenes para determinar micobacterias intracelulares fluorescentes. Las imágenes a partir de las placas de 384 pozos fueron adquiridas usando un microscopio confocal automatizado. En este caso, se registraron 4 imágenes diferentes del mismo pozo (campos). A continuación, se analizó cada campo utilizando el software de análisis basado en imágenes Acapella 2.6 (Perkin Elmer). (A)Cada campo contenía dos canales (dos colores), uno para las bacterias (verde) y otro para los núcleos celulares (canal azul), que se segmentaron utilizando el siguiente algoritmo: i)detección de núcleos mediante un procedimiento de Acapella incorporado, ii)detección de citoplasma, basado en la población de núcleos, utilizando un procedimiento de Acapella incorporado, iii)detección de bacterias manteniendo solo píxeles cuya intensidad es superior a un umbral definido manualmente, iv)fusión de la posición de las células con la posición de las bacterias para identificar las células infectadas. Los resultados finales, expresados como un promedio de los cuatro campos, son el área bacteriana total, el número total de células, el porcentaje de células infectadas y el área bacteriana por célula (promedio de todas las células infectadas). (B)Cada campo contenía dos canales, uno para las bacterias (canal verde) y otro para los núcleos celulares y el citoplasma (canal rojo lejano), que se segmentaban utilizando el siguiente algoritmo: i)filtrando el canal original utilizando un filtro anti-mediana, ii)manteniendo solo los píxeles cuya intensidad es superior a un umbral definido manualmente (cada canal tiene su propio umbral), iii)contando el número restante de píxeles para cada canal, iv)fusionando canales y contando el número de píxeles compartidos por bacterias y núcleos para cuantificar las bacterias intracelulares. Los resultados finales, expresados como un promedio de los cuatro campos, son el área bacteriana total, el área celular total, el área total de bacterias intracelulares y la relación entre el área bacteriana intracelular y el área total de células. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Se describen aquí los métodos necesarios para un ensayo fenotípico utilizando una cepa de Mtb H37Rv que expresa GFP para infectar las células huésped etiquetadas fluorescentemente, lo que lo hace apropiado para pantallas de alto contenido / alto rendimiento. Este protocolo podría aplicarse a una amplia gama de compuestos, sondas fluorescentes y mutantes mtb. Para cada protocolo descrito anteriormente, se podrían realizar pasos de fijación e inmunoetiquetado antes de la adquisición de imágenes. Utilizamos un microscopio confocal fluorescente automatizado equipado con una lente de agua 20X (NA 0.70) o 60X (NA 1.2) para adquirir imágenes. El microscopio confocal está equipado con láseres de excitación de 405, 488, 561 y 640 nm. La fluorescencia emitida se captura utilizando 3 cámaras asociadas a un conjunto de filtros que cubren una longitud de onda de detección que oscila entre 450-690 nm. Es importante tener en cuenta que el ajuste de la excitación del microscopio y los ajustes de emisión depende del tipo de colorantes o fluorocromos utilizados en cada experimento. Para los ensayos fenotípicos, DAPI o Hoechst se utilizan comúnmente a 5 μg/ml durante 10 min para teñir los núcleos. Sin embargo, las células también se pueden teñir con diferentes colorantes fluorescentes específicos para la detección de citoplasma, membrana o citoesqueleto. Después de la adquisición de imágenes, las imágenes deben analizarse utilizando un software de análisis basado en imágenes. Los algoritmos de segmentación de células basados en la intensidad de cada píxel deben utilizarse para determinar respectivamente el número de células o el área bacteriana intracelular (ver Figura 4). Los datos generados deben sopesarse con respecto a un criterio de aceptación basado en estadísticas para validar la robustez y la precisión del ensayo.
Las pantallas de alto rendimiento a gran escala son experimentos que consumen tiempo y recursos. Por lo tanto, es de suma importancia evaluar de antemano la idoneidad del ensayo. Los datos recogidos de las pantallas fenotípicas se visualizaron utilizando software de hoja de cálculo como Excel y generalmente se normalizaron por placa. Las métricas de calidad más comunes utilizadas tanto para las pantallas de siRNA como para las de moléculas pequeñas es la Z. La Z se define con media y desviación estándar de controles positivos y negativos9. La Z cuantifica si la respuesta del ensayo es lo suficientemente grande como para validar su aplicación para una pantalla de muestras a gran escala. El rango de la Z es infinito negativo a 1, con >0.5 como un ensayo muy bueno, >0 un ensayo aceptable y <0 un ensayo inaceptable. En comparación con las pantallas de moléculas pequeñas para las que la fuerza de los controles permite la validación del ensayo con Z > 0,5, la variabilidad de las pantallas de siRNA afecta a la Z que tienden a ser menores (frecuentemente entre 0,0-0,5)10. De hecho, el éxito de las pantallas de siRNA depende de la optimización de i)la eficiencia de la entrega de siRNA en las células, ii)la citotoxicidad inducida por la transfección y iii)la condición de ensayo para la eficiencia del silenciamiento génico. El siRNA se puede transfectar fácilmente en varias variedades de células, tales como HeLa, siguiendo el protocolo de la transfección del fabricante, pero la transfección eficiente del siRNA en algunas variedades de células incluyendo macrófagos sigue siendo un desafío. Sin embargo, la expresión viral mediada por vectores de ARN de horquilla corta (SHRNA) podría representar una buena alternativa11. Para escapar a la dificultad de interpretación, los datos recogidos de las pantallas de siRNA se normalizan con frecuencia en relación con la distribución estándar normal para definir la puntuación Z (también llamada valor Z) para cada punto10,12. Luego, las muestras de aciertos se clasificaron de acuerdo con la puntuación Z, que normalmente pertenece a menos de -2 o más de +2. Finalmente, los golpes seleccionados en la pantalla primaria fueron retestados en una pantalla secundaria incluyendo más réplicas para confirmar el fenotipo observado en la pantalla primaria.
Nuestro protocolo podría aplicarse fácilmente para pantallas de pequeña escala con equipos. Para lograr esto, se necesita la miniaturización de ensayo en las placas de micro-título y la manipulación de la biblioteca de moléculas para optimizar el proceso de conservación, dispensación y mezcla13. Además, se recomienda utilizar una plataforma robótica automatizada, incluidos los dispensadores, para controlar de forma precisa y reproducible las condiciones de ensayo en las placas de micro-título. La enorme cantidad de datos producidos por el cribado de alto rendimiento (HTS) también debe ser gestionado por la base de datos y una canalización adaptada para el análisis de imágenes de la imagen confocal, el almacenamiento de datos y la transferencia. Los ensayos presentados en este informe se realizaron en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad (BSL3). El estricto cumplimiento de la seguridad en BSL3 aumenta la dificultad de las pantallas. De hecho, muchos equipos necesarios para las pantallas deben estar disponibles en BSL3 y aislados para proteger al trabajador y al medio ambiente de la contaminación. Por lo tanto, la instalación de la tubería adaptada en BSL3 requirió mucho espacio. Por esta razón, nuestro protocolo fue desarrollado para tener un máximo de pasos realizados hacia fuera el BSL3 como la transfección del siRNA y la transferencia compuesta a las placas. La infección de la célula con pasos de la adquisición de la imagen fue realizada en condiciones BSL3. Las imágenes se transfirieron en un servidor dedicado y se analizaron fuera del BSL3.
El ensayo fenotípico aquí descrito se basó en dos métodos de análisis de imágenes (Figura 4). El primer método, utilizado para la detección de siRNA, fue diseñado para dar el número de células infectadas. Este parámetro fue encontrado para comparar eficientemente el efecto del silenciamiento del gen sobre la réplica intracelular del Mtb. Sin embargo, al examinar los compuestos, una lectura más básica basada en el área total de las células fue suficiente para identificar claramente los compuestos activos. Como este segundo método es más rápido y fácil de implementar, se prefirió para el análisis de imágenes derivadas del cribado de compuestos. Para ir más allá, se podrían añadir más colorantes fluorescentes y/o sondas de etiquetado y se podrían optimizar los scripts de análisis de imágenes para generar datos multiparamétricos como colocalización, morfología de núcleos y células, muerte celular, agregación bacteriana, así como tráfico intracelular de las bacterias. Es importante tener en cuenta que para los ensayos de tráfico intracelular o colocalización, es esencial obtener Z-stacks para aplicar una evaluación acumulativa.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la Comunidad Europea (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), la Agence Nationale de Recherche, el Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) y la Region Nord Pas de Calais. Agradecemos la asistencia técnica de Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni y Frank Lafont de la plataforma BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
