Summary
Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.
Abstract
Nonostante la disponibilità di terapia e vaccino, la tubercolosi (TB) rimane una delle infezioni batteriche più mortali e diffuse al mondo. Da diversi decenni, l'improvvisa esplosione di ceppi multi- ed estesamente resistenti ai farmaci è una seria minaccia per il controllo della tubercolosi. Pertanto, è essenziale identificare nuovi obiettivi e percorsi critici per l'agente causale della tubercolosi, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)e cercare nuove sostanze chimiche che potrebbero diventare farmaci per la tubercolosi. Un approccio è quello di mettere a punto metodi adatti agli schermi genetici e chimici delle biblioteche su larga scala che consentano la ricerca di un ago in un pagliaio. A tal fine, abbiamo sviluppato un saggio fenotipico basato sul rilevamento di Mtb etichettate fluorescentmente all'interno di cellule ospiti etichettate fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata. Questo saggio in vitro consente una quantificazione basata sull'immagine del processo di colonizzazione della Mtb nell'ospite ed è stato ottimizzato per il formato micropiatta 384-well, che è corretto per schermi di siRNA-, composto chimico- o mtb mutante-librerie. Le immagini vengono quindi elaborate per l'analisi multiparametrica, che fornisce l'inferenza di lettura sulla patogenesi della Mtb all'interno delle cellule ospiti.
Introduction
Tra gli agenti patogeni infettivi emergenti e riemergendo segnalati negli ultimi anni, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) occupa un posto di primo piano essendo responsabile di 1,4 milioni di morti e 8,7 milioni di nuove infezioni nel 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Nonostante la disponibilità di terapie multifarmaco, il numero di persone infette è ancora in aumento e la mtb multifarmaco resistente (MDR) e ampiamente resistente ai farmaci (XDR) si sta rapidamente diffondendo in tutto ilmondo 1. Inoltre, quando si prende in considerazione la presenza di antigeni mtb, è evidente che un terzo della popolazione globale è considerato latentemente infettato dalla Mtb. Statisticamente, in un caso su dieci, vi è evoluzione verso la forma attiva della malattia con successivi sintomi clinici2. Pertanto, sono urgentemente necessari nuovi mezzi per combattere la Mtb. In questo contesto, abbiamo sviluppato un saggio fenotipico visivo in vitro basato sul monitoraggio dell'invasione e della moltiplicazione delle Mtb nelle cellule ospiti mediante microscopia a fluorescenza confocale automatizzata3. L'adattamento del saggio in piastre microtiter a 384 pozzi in combinazione con l'acquisizione e l'analisi automatizzate delle immagini, ha permesso lo screening ad alto contenuto / alta produttività (HC / HTS) di librerie su scala media di composti, siRNA e mutanti batterici. Lo screening di una libreria RNAi a livello genomico su questo saggio fenotipico ha quindi permesso l'identificazione dei principali fattori ospiti coinvolti nel traffico di Mtb e nella replicazione intracellulare, ma anche la spiegazione delle vie ospiti sfruttate dal bacillo tubercolare. Un altro adattamento di questo particolare saggio fenotipico è stato per l'identificazione di fattori batterici essenziali per la persistenza intrafagosomale della Mtb. Ad esempio, l'arresto della maturazione fagoma è considerato uno dei principali meccanismi che facilita la sopravvivenza e la replicazione della Mtb nel macrofago. Il monitoraggio della localizzazione subcellulare dei mutanti knock-out mtb in compartimenti acido-etichettati fluorescentmente ha permesso l'identificazione di geni batterici coinvolti nel processo di sopravvivenza4. Infine, l'imaging ad alto contenuto di Mtb offre anche un metodo eccellente per quantificare l'efficienza del farmaco per inibire vari fenomeni come la crescita batterica intracellulare3. Complessivamente, questo tipo di saggio fenotipico ad alta produttività consente di accelerare la scoperta di farmaci contro la TBC e i dati raccolti da questi diversi approcci contribuiscono a una migliore comprensione della manipolazione dell'ospite esercitata da Mtb.
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Protocol
1. Screening del siRNA a livello genomico ad alta produttività
Screening eseguito in una linea cellulare umana di pneumociti di tipo II modello A549 in caso di infezione da Mtb H37Rv che esprime proteine fluorescenti verdi (GFP). Questa procedura è descritta nella figura 1A.
- Rimostrare la libreria di siRNA essiccata che viene conservata in piastre madre (piastre a 96 pozzoli) con tampone di siRNA 1x per raggiungere una concentrazione di 4 μM, quindi trasferire 10 μl della miscela in una piastra figlia di 384 po '(piastra figlia 1).
- Aggiungere 10 μl di tampone di siRNA 1x nella piastra figlia 1 per diluire il siRNA di 2 volte. Dopo la resopensione del siRNA, le piastre sono sigillate con guarnizione in alluminio sbucciabile e possono essere conservate a -20 °C almeno 6 mesi e fino a 2-3 anni, ma il tempo di conservazione può variare a seconda delle raccomandazioni del produttore della libreria siRNA.
- Diluire i siRNA nella piastra figlia 1 nella piastra figlia 2 per raggiungere una concentrazione di 500 nM. Dopo la resopensione del siRNA, le piastre sono sigillate con guarnizione in alluminio sbucciabile e possono essere conservate a -20 °C almeno 6 mesi e fino a 2-3 anni, ma il tempo di conservazione può variare a seconda delle raccomandazioni del produttore della libreria siRNA.
- Prima dell'uso, scongelare la piastra figlia 2 a temperatura ambiente.
- Prendere 2,5 μl di siRNA dalla piastra figlia 2 e posizionare in una piastra di dosaggio di 384.
- Nella stessa piastra di dosaggio di 384 pozzi nel passaggio 1.5, aggiungere 2,5 μl di siRNA di controllo negativo e positivo ai rispettivi pozzi.
- Diluire il reagente di trasfezione in 1x D-PBS per produrre una soluzione sufficiente a fornire un reagente di trasfezione da 0,1 μl in ogni pozzo e preincubare la soluzione di trasfezione diluita a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Aggiungere 7,5 μl della miscela di soluzione reagente di trasfezione/PBS ad ogni pozzo nella piastra di dosaggio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 40 μl di cellule A549 (1.500 cellule/pozzo) sospese in mezzo RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Mantenere le cellule per un periodo di incubazione di 3 giorni a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2. Queste cellule si dividono ogni 24 ore, quindi circa 12.000 cellule si trovano nei pozzi tre giorni dopo la trasfezione.
- Lavare una coltura mtb H37Rv di due settimane con D-PBS (privo di MgCl2 e CaCl2)con centrifugazione a 4.000 x g per 5 minuti e scartare i lavaggi. Ripetere questo passaggio 3x. (Per le condizioni di coltura GFP-Mtb H37Rv vedere protocollo 3).
- Sospendere il pellet batterico in 10 ml di mezzo RPMI 1640 integrato con FBS al 10% e decantare per 1 ora a temperatura ambiente per consentire aggregati batterici ai sedimenti.
- Raccogliere il supernatante batterico e misurare OD600 (OD600 deve essere compreso tra 0,6-0,8) e GFP-fluorescenza (valore RFU) utilizzando un lettore di micropiacche per determinare la concentrazione batterica. Calcolare il carattere della sospensione utilizzando una linea di regressione di riferimento che mostra il valore RFU = f (valore CFU) generato prima dell'esperimento su un'altra coltura preparata nelle stesse condizioni. Preparare sospensioni batteriche contenenti 2,4 x 106 batteri/ml, che corrisponde a una molteplicità di infezione (MOI) di 5.
- Rimuovere il mezzo nella piastra di dosaggio da 384 e aggiungere 25 μl di sospensione batterica preparata al momento.
- Incubare la piastra di dosaggio a 384°C a 37 °C per 5 ore in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
- Rimuovere il mezzo e lavare delicatamente le celle con mezzo RPMI integrato con 10% FBS 3x.
- Per uccidere i restanti batteri extracellulari, trattare le cellule con 50 μl di mezzo RPMI-FBS fresco contenente 50 μg/ml di aikacina a 37 °C per 1 ora in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
- Rimuovere l'amikacina contenente mezzo e aggiungere 50 μl di mezzo RPMI fresco integrato con FBS al 10%. Incubare la piastra di dosaggio a 384°C a 37 °C per 5 giorni in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
- Prima dell'acquisizione dell'immagine, aggiungere 10 μl di 30 μg/ml di DAPI appena preparati in PBS (concentrazione finale 5 μg/ml) e incubare per 10 min a 37 °C.
- Caricare la piastra nel microscopio confocale automatizzato.
Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Impostare i parametri di esposizione. Registrare la fluorescenza DAPI utilizzando il laser di eccitazione 405 nm con filtro di emissione 450 nm e fluorescenza GFP utilizzando laser di eccitazione 488 nm con filtro di emissione 520 nm.
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Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Selezionare i pozzi e i campi in ogni pozzo da acquisire, che viene quindi definito parametri di layout e sottolayout.
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Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Generare il file di esperimento utilizzando i parametri dei passaggi 1.20 e 1.21 ed eseguire l'acquisizione automatica.
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Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Trasferire immagini su un server remoto.
Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Valutare le immagini utilizzando il software di analisi delle immagini. Rilevare i nuclei cellulari dal canale DAPI utilizzando l'algoritmo di rilevamento dei nuclei e l'area batterica dal canale GFP utilizzando l'algoritmo delle proprietà di intensità dei pixel (Figura 4A).
Nota: Questo protocollo è ottimizzato per studiare l'effetto del silenziamento genico sulla crescita intracellulare della Mtb. Mtb è un batterio a crescita lenta che si divide ogni 20 ore in condizioni ottimali. Dopo 5 giorni dopo l'infezione la quantità di Mtb extracellulare è ancora bassa in assenza di lisi cellulare e non ha influito sulla qualità dell'analisi. Questo protocollo deve essere ottimizzato in termini di durata del trattamento antibiotico e tempo di incubazione da adattare per gli schermi siRNA utilizzando batteri a crescita rapida come Mycobacteria smegmatis ed Escherichia coli che vengono ampiamente rilasciati e possono infettare nuove cellule.
2. Screening composto ad alta produttività
Screening eseguito su cellule ospiti infette mtb H37Rv. Questa procedura è descritta nella figura 1B.
- Scongelare le piastre materne da 384 pozzi contenenti la libreria composta solubilizzata in DMSO al 100%. Trasferire 0,5 μl dei composti in piastre figlie da 384 pozzi contenenti 10 μl di mezzo RPMI 1640 integrato con FBS al 10%.
- Lavare una coltura mtb H37Rv di due settimane con D-PBS (privo di MgCl2 e CaCl2)con centrifugazione a 4.000 x g per 5 minuti e scartare i lavaggi. Ripetere questo passaggio 3x (per le condizioni di colturaGFP- Mtb H37Rv vedere protocollo 3).
- Sospendere il pellet batterico in 10 ml di mezzo RPMI 1640 integrato con FBS al 10% e decantare per 1 ora a temperatura ambiente per consentire aggregati batterici ai sedimenti.
- Raccogliere il supernatante batterico e misurare OD600 (OD600 deve essere compreso tra 0,6-0,8) e GFP-fluorescenza (valore RFU) utilizzando un lettore di micropiatta. Calcolare il carattere della sospensione utilizzando una linea di regressione di riferimento che visualizza il valore RFU = f (valore CFU) generato prima dell'esperimento. La concentrazione tipica è di 1 x 108 batteri/ml.
- Raccogliere macrofagi umani primari di 6 giorni a 4 x 105 cellule/ml in mezzo RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e M-CSF umano ricombinante da 50 ng/ml (per la purificazione delle cellule monocite del sangue periferico umano e differenziazione dei macrofagi vedi protocollo 4).
- Incubare le cellule primarie diluite con bacilli a diversi MOI, che vanno da 1 a 5, in sospensione con lievi scosse a 90 giri/min per 2 ore a 37 °C.
- Lavare le cellule infette per centrifugazione a 350 x g per rimuovere i batteri extracellulari. Dopo ogni fase di centrifugazione, rimorsi il pellet in mezzo RPMI 1640 integrato con FBS al 10%. Ripetere questo passaggio 2x.
- Sospendere le cellule infette in mezzo RPMI 1640 integrato con FBS al 10% e amikacina a 50 μg/ml e incubare la sospensione con lievi scosse per 1 ora a 37 °C.
- Rimuovere il mezzo di coltura cellulare contenente amikacina mediante centrifugazione a 350 x g e lavare le cellule infette con un mezzo RPMI 1640 completo integrato con FBS al 10% e M-CSF umano ricombinante da 50 ng/ml. Ripeti una volta.
- Aggiungere 40 μl della sospensione dei macrofagi infetti nella stessa piastra di dosaggio nel passaggio 2.1, che contiene già 10 μl delle diluizioni composte. La concentrazione finale di DMSO in ogni pozzo ha ora raggiunto l'1%.
- Incubare le piastre di dosaggio per 5 giorni a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
- Macchiare le cellule vive con colorante fluorescente far-red permeante alle cellule.
- Caricare la piastra nel microscopio confocale automatizzato.
Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Impostare i parametri di esposizione. Registrare la fluorescenza far-red utilizzando il laser di eccitazione 640 nm con filtro di emissione 690 nm e fluorescenza GFP utilizzando laser di eccitazione 488 nm con filtro di emissione 520 nm.
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Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Selezionare i pozzi e i campi in ogni pozzo da acquisire, che viene quindi definito parametri di layout e sottolayout.
Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Generare il file di esperimento utilizzando i parametri dei passaggi 2.14 e 2.15 ed eseguire l'acquisizione automatica.
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Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Trasferire immagini su un server remoto.
Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande. - Valutare le immagini utilizzando il software di analisi delle immagini. Rilevare l'area cellulare dal canale rosso lontano utilizzando l'algoritmo delle proprietà dell'intensità dei pixel e l'area batterica dal canale GFP utilizzando l'algoritmo delle proprietà di intensità dei pixel (Figura 4B).
Nota: Questo protocollo può essere adattato per lo screening della libreria mutante mtb sostituendo i composti con mutanti che esprimono una proteina fluorescente (un mutante bene/uno) (Figura 1C, vedi anche Brodin et al. 4). I mutanti fluorescenti vengono seminati per la prima volta in pozzi (20 μl di sospensione batterica per pozzo). I batteri vengono quindi recuperati di 30 μl di sospensione cellulare. Dopo la centrifugazione a 350 x g per 1 min, la piastra viene incubata a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2. Il tempo di incubazione e il MOI dipendono dal saggio. Ad esempio, per la visualizzazione dei primi eventi cellulari come l'acidificazione fagosoma, le cellule possono essere infettate per 2 ore con MOI che vanno da 1 a 20. I lisosomi sono macchiati usando colorante Lysotracker a 2 μM per 1,5 ore a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2 e quindi fissati con formalina al 10% o paraformaldeide al 4% (PFA). Le immagini confocali vengono acquisite e infine analizzate utilizzando script di analisi delle immagini con algoritmi appropriati per il rilevamento dei lisosomi e la localizzazione subcellulare4.
3. Proteina fluorescente verde che esprime mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Condizioni di coltura
Per la conservazione a lungo termine, GFP-H37Rv è stato congelato in D-PBS (circa 1 x 108 micobatteri per flaconcino).
- Resuspend una fiala congelata di GFP-H37Rv in un matraccio Erlenmeyer contenente 50 ml di mezzo brodo 7H9 integrato con arricchimento Middlebrook OADC 10%, Glicerolo 0,5%, Tween-80 0,05% e Igromicina B (50 μg/ml).
- Incubare 8 giorni a 37 °C.
- Misurare l'OD600 della cultura GFP-H37Rv.
- Diluire la coltura GFP-H37Rv per ottenere OD600 = 0,1 in mezzo brodo fresco 7H9 integrato con arricchimento Middlebrook OADC 10%, glicerolo 0,5%, Tween-80 0,05% e igromicina B (50 μg/ml).
- Incubare il GFP-H37Rv a 37 °C per altri 8 giorni prima dell'uso per il saggio.
4. Purificazione umana delle cellule monocite del sangue periferico dall'intero sangue o dalla preparazione del mantello di buffy
- Diluire la busta di sangue 2x in 1x D-PBS (privo di MgCl2 e CaCl2) contenente 1% FBS.
- Isolare i monociti per centrifugazione gradiente densità Ficoll a 400 x g per 20 min.
- Raccogli i monociti isolati.
- Lavare i monociti 3x con 1x D-PBS (privo di MgCl2 e CaCl2)contenente 1% FBS per centrifugazione a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente.
- Concentrare le cellule fino a 1 x 107 cellule/ml.
- Purificare i monociti utilizzando perline magnetiche CD14 secondo il protocollo del produttore (vedi Materiali).
- Dopo la purificazione dei monociti CD14, seminare le cellule a 1,5 x10 6 cellule/ml in RPMI 1640 integrate con FBS al 10% e 40 ng/ml di fattore stimolante della colonia di macrofagi umani (hM-CSF) e incubate per 4 giorni a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
- Dopo 4 giorni sostituire il mezzo con RPMI fresco 1640 completato con FBS al 10% e 40 ng/ml di hM-CSF e incubato per 2 giorni a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
- Dopo 6 giorni, le cellule possono essere utilizzate per il saggio.
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Representative Results
Screening del siRNA a livello genomico ad alta produttività
Mtb è in grado di colonizzare le cellule immunitarie in vitro così come molte altre cellule epiteliali polmonari. Ad esempio, Mtb èin grado di infettare e danneggiare le cellule epiteliali A549 che sono comunemente utilizzate come modello per gli pneumociti di tipo IIumano 5-7. La dectina-1 è stata segnalata come recettore delle cellule ospiti coinvolto nell'assorbimento della mtb, nella risposta proinflammatoria e nell'effetto antibatterico sulla crescita micobatterica intracellulare nelle cellule A5498. la condizione di siRNA descritta nel protocollo 1 ha portato all'85% dell'efficienza di silenziamento (dati non mostrati). Silenziare l'espressione di Dectin-1 con siRNA ha portato a una diminuzione della quantità di micobatteri intracellulari nelle cellule A549. Infatti, dopo 3 giorni di silenziamento e 5 giorni di infezione, la percentuale di cellule infette viene ridotta due volte nelle cellule A549 silenziate dectin-1 rispetto alle cellule trasfette da siRNA scramble non bersaglio (Figure 2A e 2B). Abbiamo applicato la normalizzazione basata su campioni del dectin-1 mirato al siRNA rispetto alla scramble per definire z-score. Come mostrato nella figura 2C, abbiamo ottenuto una media del punteggio Z intorno a -15 per il siRNA mirato dectin-1. La dectina-1 può essere usata come controllo positivo per lo schermo del siRNA per scoprire altri nuovi fattori ospiti coinvolti nella colonizzazione della Mtb negli pneumociti che potrebbero avere lo stesso fenotipo di quello con il siRNA dectin. L'uso di un siRNA che impreca sul fenotipo come controllo su ogni micropiastra durante lo schermo consente la normalizzazione di ogni piastra, che è utile quando si desidera eseguire l'analisi dello schermo dell'intero genoma. Il parametro statistico Z' era 0.1 usando la normalizzazione basata sul controllo su scramble e siRNA mirati Dectin1, che è un valore accettabile per la convalida dei dati di screening del siRNA.
Screening composto ad alto contenuto
L'efficienza composta sulla crescita batterica intracellulare viene valutata stabilendo una curva di risposta alla dose (RDC) e normalizzata ai controlli del composto positivo di riferimento e del solvente composto negativo. La RDC rappresentativa di due composti di riferimento, isoniazide (INH) e rifampicina (RIF), attivi contro la crescita delle mtb, è illustrata nella figura 3. Queste curve sono ottenute nei macrofagi primari umani infettati da un ceppo mtb H37Rv che esprime la GFP, con lettura dopo 5 giorni dopo l'infezione. DMSO e INH ad una concentrazione finale rispettivamente dell'1% e dello 0,1 μg/ml sono comunemente usati come controlli negativi e positivi, fornendo livelli basali di efficienza (0 e 100%) (Figura 3A). Seguendo il processo di analisi delle immagini descritto nella figura 4B, i dati multiparametrici vengono estratti da immagini a fluorescenza confocale di macrofagi infetti-umani scattate dal microscopio confocale automatizzato. I composti attivi che hanno avuto un impatto sulla replicazione intracellulare della Mtb nelle cellule ospiti hanno portato a una diminuzione della carica micobatterica, che corrisponde all'area del segnale GFP nelle cellule nelle immagini(Figura 3B). Il rapporto tra area batterica intracellulare e area cellulare totale, calcolato utilizzando un software di analisi basato su immagini, viene tracciato in funzione della concentrazione composta, che genera la RDC (Figura 3B). Queste curve consentono di determinare sia la concentrazione necessaria per ridurre la carica batterica del 50% (IC50)sia la concentrazione minima necessaria per inibire il 99% della replicazione batterica (MIC99) (Figura 3C). Z' basato sul controllo DMSO 1% e il controllo INH 0,1 μg/ml era di 0,49. Questa Z', molto vicina a 0,5, è accettabile per convalidare questo saggio.
Figura 1. Approcci di screening visiva ad alto contenuto. Rappresentazione schematica del sistema di modello di infezione da Mtb utilizzato per gli schermi siRNA (A),composti chimici( B ) e mutanti Mtb (C). (A) schermo libreria siRNA: le cellule sono state trasfette con siRNA per 3 giorni in piastre da 384 potte utilizzando il metodo di trasfezione inversa. le cellule trasfette da siRNA sono state infettate da GFP-Mtb e incubate per 5 giorni a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2. Le celle sono state poi macchiate e le immagini sono state raccolte utilizzando un microscopio confocale automatizzato. (B) Schermo libreria composti: i composti sono stati distribuiti in piastre da 384 pozzi. Sospensione cellulare e GFP-Mtb sono stati incubati insieme per 2 ore a 37 °C. Le cellule infette sono state sementi nelle piastre e incubate per 5 giorni a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2. Le celle sono state poi macchiate e le immagini sono state raccolte utilizzando un microscopio confocale automatizzato. (C) Libreria mutantefluorescente mtb: i mutanti mtb fluorescenti sono stati seminati in piastre da 384 pozzi e la sospensione della cellula ospite è stata distribuita. Il tempo di incubazione variava a seconda del saggio. Le cellule o le vescicole cellulari sono state macchiate prima dell'acquisizione automatica delle immagini. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 2. Il silenziamento della dectina-1 influisce sulla colonizzazione della Mtb nelle cellule A549. (A) Immagini confocali rappresentative (lente d'aria 10X) di cellule A549 trasfette da siRNA non bersaglio (scramble) o con siRNA specifico per Dectin-1 e infettate da GFP-Mtb H37Rv (MOI5) per 5 giorni. La barra di scala rappresenta 200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv sono stati visualizzati in verde e le cellule in rosso. Il numero di cellule(A. Cell detection) e il carico intracellulare GFP-Mtb H37Rv (areabatterica A.) sono stati determinati utilizzando un software di analisi basato su immagini. (B) Rappresentazione grafica della percentuale di cellule A549 infette in 5 repliche (da w1 a w5) di Scramble siRNA (cerchi blu) e SiRNA Dectin-1 (cerchi rossi). (C) Rappresentazione grafica della media z-score del siRNA scramble e del siRNA Dectin-1. (*** valore p < 0,0001). Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 3. Curva di risposta alla dose di composti di riferimento attivi contro mtb nei macrofagi umani. (A e B) Immagini confocali rappresentative (lente d'acqua 20X) di macrofagi umani (rosso, cella etichettata con colorante fluorescente rosso) infettati da GFP-Mtb H37Rv (verde) con moi1 per 5 giorni. La barra di scala rappresenta 50 μm. (A) Immagini di cellule infette incubate con DMSO 1% utilizzate come controllo negativo nel saggio. (B) Immagini di cellule infette incubate con crescente concentrazione di due composti di riferimento isonazide (INH) e rifampicina (RIF). (C) Curve dose-risposta (RDC) di INH e RIF. L'analisi basata su immagini ha permesso la determinazione della RDC per ogni composto testato. DRC rappresenta il rapporto tra area batterica GFP intracellulare e area cellulare totale (asse Y), in funzione della concentrazione composta (scala log, asse x). In ogni grafico, la RDC del composto è stata normalizzata a quella del controllo negativo DMSO 1% (inibizione dello 0%) e del controllo positivo INH ad una concentrazione di 0,1 μg/ml (inibizione al 100%). Per ogni composto, la concentrazione necessaria per inibire il 50% della colonizzazione batterica (IC50)e la concentrazione inibitoria minima (MIC99)sono state calcolate dalla RDC. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 4. Analisi standard basata su immagini per determinare i micobatteri intracellulari fluorescenti. Le immagini di lastre da 384 pozzi sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale automatizzato. In questo caso, sono state registrate 4 immagini diverse dello stesso pozzo (campi). Ogni campo è stato quindi analizzato utilizzando il software di analisi basato su immagini Acapella 2.6 (Perkin Elmer). (A) Ogni campo conteneva due canali (due colori), uno per i batteri (verde) e uno per i nuclei cellulari (canale blu), che sono stati segmentati utilizzando ilseguente algoritmo: i ) rilevamento dei nuclei utilizzando una procedura Acapella integrata, ii)rilevamento del citoplasma, basato sulla popolazione dei nuclei, mediante una procedura integrata di Acapella, iii)rilevamento di batteri mantenendo solo i pixel che l'intensità è superiore a una soglia definita manualmente, iv ) fondendola posizione delle cellule con la posizione dei batteri per identificare le cellule infette. I risultati finali, espressi in media nei quattro campi, sono l'area batterica totale, il numero totale di cellule, la percentuale di cellule infette e l'area batterica per cellula (media di tutte le cellule infette). (B) Ogni campo conteneva due canali, uno per i batteri (canale verde) e uno per i nuclei cellulari e il citoplasma (canale rosso lontano), che sono stati segmentati utilizzando il seguente algoritmo: i) filtrando il canale originale utilizzando un filtro anti-mediano, ii)mantenendo solo i pixel che l'intensità è superiore a una soglia definita manualmente (ogni canale ha la propria soglia), iii ) contandoil numero rimanente di pixel per ogni canale, iv) unendo i canali e contando il numero di pixel condivisi sia dai batteri che dai nuclei per quantificare i batteri intracellulari. I risultati finali, espressi in media nei quattro campi, sono l'area batterica totale, l'area cellulare totale, l'area totale dei batteri intracellulari e il rapporto tra area batterica intracellulare e superficie totale delle cellule. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
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Discussion
Descriviamo qui i metodi necessari per un saggio fenotipico utilizzando un ceppo Mtb H37Rv che esprime GFP per infettare le cellule ospiti etichettate fluorescentmente, il che lo rende appropriato per schermi ad alto contenuto / ad alta produttività. Questo protocollo potrebbe essere applicato a una vasta gamma di composti, sonde fluorescenti e mutanti Mtb. Per ogni protocollo sopra descritto, è possibile eseguire passaggi di fissazione e immunoetichettatura prima dell'acquisizione dell'immagine. Utilizziamo un microscopio confocale fluorescente automatizzato dotato di un obiettivo ad acqua 20X (NA 0.70) o 60X (NA 1.2) per acquisire immagini. Il microscopio confocale è dotato di laser ad eccitazione da 405, 488, 561 e 640 nm. La fluorescenza emessa viene catturata utilizzando 3 telecamere associate a una serie di filtri che coprono una lunghezza d'onda di rilevamento che va da 450-690 nm. È importante notare che la regolazione delle impostazioni di eccitazione ed emissione del microscopio dipende dal tipo di coloranti o fluorocromi utilizzati in ogni esperimento. Per i test fenotipico, DAPI o Hoechst sono comunemente usati a 5 μg/ml per 10 min per macchiare i nuclei. Tuttavia, le cellule possono anche essere macchiate con diversi coloranti fluorescenti specifici per il rilevamento di citoplasma, membrana o citoscheletro. Dopo l'acquisizione dell'immagine, le immagini devono essere analizzate utilizzando un software di analisi basato su immagini. Gli algoritmi di segmentazione delle cellule in base all'intensità di ciascun pixel devono essere utilizzati rispettivamente per accertare il numero di cellule o l'area batterica intracellulare (vedere figura 4). I dati generati devono essere soppesati rispetto a criteri di accettazione basati su dati statistici per convalidare la robustezza e l'accuratezza del saggio.
Gli schermi ad alta velocità effettiva su larga scala sono esperimenti dispendiosi in termini di tempo e risorse. Pertanto, è di primaria importanza valutare in anticipo l'idoneità del saggio. I dati raccolti dagli schermi fenotipiche sono stati visualizzati utilizzando software per fogli di calcolo come Excel e generalmente normalizzati per piastra. Le metriche di qualità più comuni utilizzate sia per gli schermi siRNA che per le piccole molecole sono la Z. La Z è definita con deviazione media e standard dei controlli sia positivi che negativi9. La Z quantifica se la risposta al test è abbastanza grande da convalidare la sua applicazione per uno schermo su larga scala di campioni. L'intervallo della Z è infinito negativo a 1, con >0,5 come ottimo saggio, >0 un saggio accettabile e <0 un saggio inaccettabile. Rispetto agli schermi a piccola molecola per i quali la forza dei controlli consente la convalida del saggio con Z > 0,5, la variabilità degli schermi siRNA influisce sulla Z che tende ad essere inferiore (spesso tra 0,0-0,5)10. Infatti, il successo degli schermi siRNA dipende dall'ottimizzazione di i ) l'efficienzadella consegna del siRNA nelle cellule, ii) la citotossicità indotta dalla trasfezione e iii) la condizione di dosaggio per l'efficienza del silenziamento genico. Il siRNA può essere facilmente trasfetto in varie linee cellulari, come HeLa, seguendo il protocollo di trasfezione del produttore, ma l'efficiente trasfezione del siRNA in alcune linee cellulari tra cui i macrofagi rimane ancora una sfida. Tuttavia, l'espressione virale mediata da vettori di RNA a tornanti corti (shRNA) potrebbe rappresentare una buona alternativa11. Per sfuggire alla difficoltà di interpretazione, i dati raccolti dagli schermi siRNA sono spesso normalizzati rispetto alla distribuzione standard normale per definire il punteggio Z (chiamato anche valore Z) per ognipunto 10,12. Quindi, i campioni di hit sono stati classificati in base al punteggio Z che in genere appartiene a meno di -2 o più di +2. Infine, i riscontri selezionati nella schermata primaria sono stati ritestati in una schermata secondaria che include più repliche per confermare il fenotipo osservato nella schermata primaria.
Il nostro protocollo potrebbe essere facilmente applicato per schermi su piccola scala con apparecchiature. Per raggiungere questo obiettivo, sono necessarie la miniaturizzazione del test nelle piastre a micro- formicolio e la manipolazione della libreria di molecole per ottimizzare il processo di conservazione, erogazione emiscelazione 13. Inoltre, si consiglia di utilizzare una piattaforma robotica automatizzata, compresi i distributori, al fine di controllare in modo accurato e riproducibile le condizioni di dosaggio nelle piastre del micro-tricitro. L'enorme quantità di dati prodotti dallo screening ad alta velocità effettiva (HTS) dovrebbe anche essere gestita da un database e da una pipeline adattata per l'analisi delle immagini dell'immagine confocale, l'archiviazione e il trasferimento dei dati. I test presentati nella presente relazione sono stati eseguiti nell'impianto biosicurezza di livello 3 (BSL3). La stretta aderenza alla sicurezza in BSL3 aumenta la difficoltà degli schermi. In effetti, molte attrezzature necessarie per gli schermi devono essere disponibili in BSL3 e isolate per proteggere il lavoratore e l'ambiente dalla contaminazione. Pertanto, l'installazione della tubazione adattata in BSL3 ha richiesto molto spazio. Per questo motivo, il nostro protocollo è stato sviluppato per far eseguire un massimo di passaggi dal BSL3 come la trasfezione del siRNA e il trasferimento composto alle piastre. L'infezione cellulare attraverso le fasi di acquisizione dell'immagine è stata eseguita in condizioni BSL3. Le immagini sono state poi trasferite in un server dedicato e analizzate al di fuori del BSL3.
Il saggio fenotipico qui descritto si basava su due metodi di analisi delle immagini (Figura 4). Il primo metodo, utilizzato per lo screening del siRNA, è stato progettato per fornire il numero di cellule infette. Questo parametro è stato trovato per confrontare in modo efficiente l'effetto del silenziamento genico sulla replicazione intracellulare mtb. Quando si vagliano i composti, tuttavia, una lettura più basilare basata sulla superficie totale delle cellule era sufficiente per identificare chiaramente i composti attivi. Poiché questo secondo metodo è più veloce e più facile da implementare, è stato preferito per l'analisi delle immagini derivanti dallo screening dei composti. Per andare oltre, potrebbero essere aggiunti più coloranti fluorescenti e / o sonde di etichettatura e gli script di analisi delle immagini potrebbero essere ottimizzati per generare dati multiparametrici come colocalizzazione, morfologia dei nuclei e delle cellule, morte cellulare, aggregazione batterica, così come il traffico intracellulare dei batteri. È importante notare che per i test di traffico intracellulare o colocalizzazione, è essenziale ottenere z-stack al fine di applicare una valutazione cumulativa.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Il sostegno finanziario a questo lavoro è stato fornito dalla Comunità europea (sovvenzione ERC-STG INTRACELLTB n° 260901, sovvenzione MM4TB n° 260872), dall'Agence Nationale de Recherche, dalla Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) e dalla regione Nord Pas de Calais. Riconosciamo con gratitudine l'assistenza tecnica di Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni e Frank Lafont dalla piattaforma BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
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