활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

타고난 면역 시스템의 활성화는 감염, 질병, 예방 접종 ^7시 적응 면역 반응을 조종하는 데 필요합니다. 수지상 세포는 선천성 면역 체계의 세포를 제시하는 가장 강력한 항원이다; 그들은 항원의 흡수, 림프절 마이그레이션, 순진 CD4 ^+와 CD8 ⁺ T 세포 용해 세포 ^8-10의 활성화를 위해 전문화되어 있습니다. 빠른 병원체 검출을 사용하려면 타고난 면역 시스템은 보존 병원체 파생 모티브 또는 세포 스트레스와 손상의 호스트 파생 마커를 인식하는 수많은 생식 인코딩 패턴 인식 수용체 (PRR)를 사용합니다. 수용체 (TLR에) 같은 전화는 특정 세포 phagocytized 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS) 및 위험 관련 분자 패턴 (감쇠)를 인식 막 결합 패턴 인식 수용체이다. 수용체 (NLRs) 같은 대비 고개를 끄덕으로 세포질하고 PAMPS 및 감쇠의 다양한 범위에 응답합니다. 수용체가 다시 같이 고개를 끄덕세포 표면 및 세포 내 이입 PRRS을 회피 병원균에 대한 방어의 두 번째 라인을 제시한다. 파생 병원균, 또는 "위험"의 상호 작용, 관련 TLR과 NLR 리간드 요소는 다른 면역 세포와 T 세포와 자연 살해 세포 활성화 ^(11)의 승진 증가 DC의 상호 작용의 결과로 DC의 성숙의 상태에 이르게한다.

인터루킨-1β는 감염에 대한 숙주 방어의 중요한 구성 요소입니다. 미생물의 인식 시점이 높은 염증성 사이토 카인 IL-1β가 분비되고 화학 유인과 타고난 및 적응 면역 세포의 활성화 등의 기능은. 생체 내 IL-1β는 발열과 염증성 사이토 카인 등의 급성기 응답을 크게 책임이있다 합성 ^12.

대부분의 NLRs 리간드 감지, 물질 œ 인 중앙 염기 결합 도메인 (NACHT)에서 작동하는 것으로 생각되는 C 터미널 류신이 풍부한 반복 도메인을 포함NLRP3의 올리고머, 단백질 단백질 상호 작용을 통해 다운 스트림 대상에 신호 전달을 매개 N 터미널 이펙터 도메인 (NLRP3의 PYD)에 대한 rtant. NLRP3 단백질은 가장 강렬하게 공부 inflammasome을 단지를 정의합니다. 이 단백질은 NLR 가족의 일원이고 NLRP3 (또한 ASC라고도 함) 어댑터 단백질 PYCARD 및 ICE 이루어지는 멀티 분자량 단백질 복합체를 형성하는 기능을 갖는다. inflammasome을 활성화시 PYCARD은 NLRP3 N 단말기 도메인에 바인딩하고 카스파 제 활성화 및 채용 도메인 (CARD) 도메인을 통해 ICE를 모집합니다. 인터루킨-1 전환 효소는 처음의 N-말단에 카드 모티브를 포함하는 효소 원으로 생성됩니다. 두 ICE의 분자를 데려 inflammasome을 형성 결과는 충분히 닫고 촉매 활성화를 유도한다. inflammasome을 단지는 사이토 카인 성숙 세포질 프로 IL-1β를 변환 할 수 있도록하여 ICE 활성화가 필요합니다.

IL 성공적으로 분비-1β의 DC에있는 두 개의 서로 다른 독립적 인 위험 신호를 감지해야합니다. 첫째, PAMPS, 감쇠, 또는 사이토 카인 신호 (TNFα 나 IL-1β)의 TLR 감지 세포질 프로 IL-1β 단백질 발현의 상향 조절됩니다. 두 번째, 종종 다른 신호는 ICE의 성숙의 상류 inflammasome을 복합체 형성이 필요합니다. 신호를 자극하는 몇 inflammasome을 세균 막 기공 (예 nigericin)를 형성하는 독소 (예 : 글루타민산 소다 요 산염 결정, MSU 등) 리소좀 중단 결정하고, 세포 외 ATP (가) 있습니다. 이러한 다양한 활성제에 의해 inflammasome을 활성화 NLRP3로 이어지는 상류 메커니즘은 명확하지 않다. inflammasome을 형성 시그널링 상류 조사 연구는 저칼륨 유도 또는 반응성 산소 종 (ROS)와 같은 세포 내 사건 간접적 inflammasome을 ^13-28을 활성화하는 것이 제안되어있다.

NLRP3의 inflammasome을 서로 다른 바이러스 성 활성제의 사이에 B를 제공 인플루엔자이며,IL-1β 분비 ^{3, 29-33에} 필요한 기본 및 보조 신호 OTH. 마우스 NLRP3 녹아웃 모델을 사용하여이 DC에있는 IL-1β의 분비가 ³² NLRP3 의존하는 것으로 나타났습니다. 또한, NLRP3 녹아웃 마우스는 감염의 사이트에 적은 백혈구을 받고 높은 사망률 ^{2, 5를} 경험했다. 최근 두 논문은 인플루엔자 바이러스 감염시 NLRP3의 inflammasome을 활성화하기위한 메커니즘을 제안; 첫 번째, 두 번째 신호 다음에 세포질 프로 IL-1β 발현을 유도하는 TLR7 또는 TLR8 (응답 세포의 TLR의 발현에 따라 다름)에 의해 또는 다른 TLR에 의한 공생 박테리아의 검출을 통해 바이러스 성 RNA, NLRP3의 활성화의 인식을 통해 프라이밍 트랜스 골지 네트워크 ^{(33, 34)에} 바이러스 성 이온 채널 단백질 (M2)로 inflammasome을 형성. 후자의 공정에서, NLRP3의 inflammasome을 트리거링은 세포 내 이온의 외란에 의해 달성된다 <EM> inflammasome을 형성하는 신호로서 NLPR3 의해 감지 단순히이다 ROS 생산으로 이어지는 환경. 그러나, 인플루엔자 감염시 ICE 활동의 inflammasome을 활성화 상류의 정확한 메커니즘은 아직 불분명하게 남아있다.

이 작품은 잘으로 inflammasome을 활성화 한 다음 R848과 TLR8 결찰에 대한 응답을 기준으로 DC의 기초가되는 경로 IL-1β 분비의 추가 조사를위한 기초로 사용할 수 있습니다 인간의 moDCs에서 NLRP3의 inflammasome을 공부를위한 가치있는 기술을 설명합니다 NLRP3의 알려진 활성제, nigericin. 이 방법의 변형을 포함하는 다른 세포 유형과 함께 사용하지만, 이에 한정되지 수 : 단핵구, 대 식세포, 다른 DC 서브 세트 및 상피 세포.

윤리 정책 : 연구 샘플을 얻어 기증자의 동의와 연구에 저장됩니다. 모든 샘플 코드 또는 사용하기 전에 익명으로 처리해야한다. 이 프로토콜은 우리의 임상 시험 심사위원회의 가이드 라인을 따른다.

1. 단핵구 유래 수지상 세포에 인간의 말초 혈액 단핵구의 분화.

참고 : 인간 버피 코트는 인간의 말초 혈액 세포 (PBMC를)의 소스 역할을하고 뉴욕 혈액 센터 (뉴욕, NY)에서 얻을 수 있었다. 혈액 기증자는 건강한 지원자입니다. 오일 절차는 조직 배양에 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 도금을 시작은 ^35,36을 플라스. 게시 된 프로토콜에서 주목할만한 차이점은 다음과 같습니다 :

1. 10cm 폴리스티렌 조직 배양 플레이트보기 플라스크 당 2 × ^13의 PBMC를 다운로드 고착 대신하는 필터 캡 ^225cm이 비 발열 폴리스티렌 조직 배양 플라스크를 사용S (58cm ²⁾ (1 단계).
2. 5 % 풀링 된 인간 혈청 (PHS, 30 ㎖)으로 미디어를 준비 500 ML RPMI-1640 + L-글루타민, 5 ㎖ 1 M HEPES 버퍼, 1.4 ㎖의 50 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 (5 % PHS 미디어) 여과 한 다음를 통해 20 μm의 필터. 50 ㎖ 5 % PHS 미디어 225cm ^당 조직 배양 플라스크의 총을 추가합니다.
3. 25 ML 신선한 RPMI-1640 접착 세포를 세 번 씻으십시오. 각 세척시 5 초 동안 격렬하게 흔들어 및 비 부착 세포 (4 단계)를 대기음.
4. 하루 한 PBMC는 처음 단계에서 도금 될 때 100 IU / μL 0 일, 2 플라스크 (3 단계) 당 GM-CSF, 4. 0 일 400 IU / μL IL-4, 380 μL의 190 μl를 추가 정의된다 1 (단계 8).
5. 1 × 10 ⁶ 세포 / ml (15 단계)의 농도가 수확 일 5 moDCs.
6. 자신의 휴식 상태로 즉시 moDCs를 사용합니다. 17 ~ 22 단계가 수행되지 않습니다. 참고 : 샘플이 최상의 결과를 최대한 빨리 수집 후 처리해야합니다.
7. 농도에서 나누어지는 moDCs2 × ⁵ 세포의 기 /도 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (웨스턴 블롯, ELISA, FACS) 또는 폴리-L-라이신 처리 chamberslide (현미경) 상 실험을위한의 (1 × 10 ⁶ 세포 / ml의 200 μL / 웰) . 참고 : 완전히 비자극 (음성 대조군) 활성화 뒤에 만 만 활성화 및 프라이밍 프라이밍, 적어도 4 조건이 있습니다. 조건이 필요한 경우 희석제 R848에 대한 컨트롤과 nigericin을 포함하도록 확장 할 수 있습니다. 다운 스트림 분석이 ICS 인 경우, 중복 이소 컨트롤에 대한 필요합니다.

. 2 inflammasome을 준비하기 - 신호 1

1. 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 동결 건조 R848을 재구성. RPMI-1640 RT에서 근무 주식을 희석.
2. 18 시간 동안 우물을 충당하기 위해 10 μM 최종 농도 R84​​8를 추가합니다. 장소 37 ° C에서 인큐베이터에있는 세포와 5 % CO _2.

3 NLRP3 inflammasome을 활성화 -. 신호2

1. 제조업체의 지침에 따라 에탄올에 동결 건조 nigericin을 재구성. 해당 조건에 추가하기 전에 RPMI-1640 RT에서 근무 주식을 희석.
2. 20 μm의 최종 농도 nigericin 추가하고 37 ° C에서 인큐베이터에 반환하고 5 % CO _{2 ~} 6 시간 동안. 더 세척 단계는 프라이밍 사이에 활성화 중에 발생하지 않습니다. 주 : IL-1β의 분비 A, 모 넨신, 디 니트로 페놀 또는 카르 보닐 시안화 chlorophenylhydrazone ^{37, 38} brefeldin 칼슘 ionophores의 존재에 의해 증가된다. 이 IL-1β의 분비를 변경 때문에 inflammasome을 프라이밍 또는 활동을 분석 할 때 그러므로, 이러한 분비 억제제의 첨가는 권장하지 않습니다.

4. IL-1SS 샘플 컬렉션

1. 3 분 974 XG에 세포 상층 액 접시를 원심 분리기.
2. 세포 펠렛을 방해하지 않고, 뜨는을 대기음 등으로 전송eparate 라운드 상층 액에서 사이토 카인의 분비를 측정하기 위해 판을 바닥. 참고 : 상층 액이 일시적으로 -20 ° C에 저장하거나 할 수 있습니다 -80 장기 기억 ° C.
3. 세포 샘플에서 모든 세포 IL-1β를 제거하기 위해 3 분 974 XG에 1X PBS 200 μL와 세포 펠렛을 세 번 씻으십시오. 참고 : 96 웰 플레이트에서 세포 펠렛을 세척 할 때 샘플을 방해하지 않도록, 수거함에 신속 판 반전하여 세척을 제거합니다.

5. 세포 및 뜨는 샘플에서 IL-1SS 측정

1. 세포 내 사이토 카인 염색법 (ICS)는 : ICS 프로토콜은 ^{39, 40에} 대하여 설명한다. 참고 : 다운 스트림 분석은 현미경 경우 세포를 중단하지 않습니다. 모든 세척 및 포부 (다운 스트림 분석에 따라) 세포 층 / 펠렛을 방해하지 않고 수행해야합니다.
   1. 적절한 우물에 5 % PHS 매체 100 μl를 추가합니다. 추가적절한 볼륨 (약 1 μl/2x10 ⁵ 셀 또는 1 μL / 웰)의 찬란 α-의 CD11c 및 α-CD14 표지 (표현형 마커, 클론 B-ly6 및 MφP9, 각각) 또는 이소 제어에서 10 분 동안 세포에 어둠 속에서 RT.
   2. 3 분 974 XG에 1X PBS로 3 회 세척한다.
   3. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 4 % PFA 100 μl를 추가하여 세포를 고정합니다.
   4. 포인트를 일시 정지 : 1X PBS에 4 ° CO / N에서 3 분 및 저장을위한 974 XG에 100 μL 1X PBS로 세척.
   5. 30 분 동안 세포 permeabilization 버퍼 100 μl를 추가합니다. 참고 : permeabilization 버퍼는 0.3 % 트리톤 X-100로 1X PBS로 구성하고, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) permeabilization이다. 다운 스트림 분석은 현미경 때 자기편 세포를 방해하지 않습니다.
   6. 적절한 α-IL-1β-FITC의 양 (약 62 NG의 antibody/2x10 ⁵ 셀, 약 또는 2.5 μL / 잘) (클론 8516) 나에 대한 아이소 타입 컨트롤을 추가37 ° C에서 인큐베이터에서 2 시간
   7. 어둠 속에서 3 분 동안 974 XG에서 permeabilization 버퍼 200 μL와 세포를 세 번 씻으십시오.
   8. 선택 사항 : DAPI와 얼룩은의 mountant를 추가하고, 유리 슬라이드 위에 부드럽게 커버 슬립을 배치합니다. 현미경 이미지를 캡처하기 전에 O / N을 치료의 mountant을 허용합니다.
   9. FACS 또는 현미경으로 데이터를 획득. 참고 : FACS이나 현미경으로 분석 적절한 염색 각 조건에 대한 아이소 타입을 비교한다.
      1. FACS : 한 번에 하나의 샘플을 취득. MODC 인구 프로 IL-1β 염색을 분석하기 전에 세포 ^-의 CD11c ⁺ CD14에 게이팅 다음에 살아있는 세포에 FSC / SSC 게이트를 설정합니다.
      2. 현미경 : 긍정적 인 염색 샘플을 사용하여 노출 시간을 설정 - R848 치료. 프로 IL-1β 표현 moDCs을 +의 비율을 결정하는 ^- DAPI ⁺ 프로 IL-1β의 ^+와 DAPI ⁺ 프로 IL-1β를 사용합니다.
2. SDS-페이지 : 면역 블롯이 프로 IL-1β를 감지하기 위해 수행된다. 참고 : 아래에서 설명하는 기술은 표준 면역 블롯 기술, 그라데이션 4-20% 폴리 아크릴 아마이드 젤, 형광 또는 화학 발광 검출 ^{(41, 42)을} 결합한다.
   1. 직접 용해 완충액 (5 ㎕의 세포 용해 완충액으로 1:1로 희석 하였다 β-mercaptoethanol/950 μL 램리 시료 완충액)을 변성 10 μL를 Lyse있는 세포. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 해물을 전송합니다.
   2. 100 ℃에서 10 분 동안 건조 접시에 열 해물
   3. 액체 볼륨을 집중하는 1 분 minicentrifuge에 20,800 XG에서 해물 스핀. 지점을 일시 정지 : 샘플은 단기 저장을 위해 -20 ° C에서 얼 수있다.
   4. 폴리 아크릴 아마이드 젤에 전체 볼륨을로드합니다. 염료 전면 겔의 바닥을 실행까지 약 1 시간, 또는위한 젤 상자를 통해 140 V를 실행합니다.
   5. PVDF Immobilon-FL의 membr에 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 단백질을 전송100 V. 블록 트리스 버퍼 식염수에 5 % BSA와 멤브레인 / 0.1 % 트윈 20 (TBS-T) 1 시간 동안 90 분 동안 고대 근동. 참고 : PVDF Immobilon-FL은 형광 검출에 사용하기에 가장 적합합니다. 다른 검출 기술이 배경 잡음비를 증가시키기 위해 서로 다른 조성을 갖는 막을 추천.
   6. 5 % BSA / TBS-T의 10 ㎖에 기본 및 보조 항체를 희석. 흔들어 섞으면 서 1 시간 동안 실온에서 이차 항체를 흔들어 동안 4 ° CO / N에서 기본 항체 배양을 수행합니다.
   7. 기본 및 보조 항체 배양하고 다시 차 배양과 영상 사이에 떨고있는 동안 5 분 TBS-T로 막 3 회 반복한다. 주 : 대역 형광 또는 화학 발광 검출을 사용하여 검출 될 수있다. 검출을위한 제조 업체의 지침을 따르십시오.
3. ELISA는 : 저장을 위해 냉동 샘플을 분석하기 전에 실온으로 평형을 유지해야합니다. 뜨는 condens을 통합 원심 분리기 샘플을 스핀 다운ATION. IL-1β의 측정을 위해 제조 업체의 지침을 따르십시오. 참고 :이 프로토콜에서 IL-1β는 특히 측정; 그러나, TNFα, IL-6, 및 면역 조절 사이토 카인 IL-10의 동시 측정은 적절한 조건은 프라이머 확인 하였다.

이 기술은 R848 프라이머를 TLR8을 측정합니다. 의 CD11c + moDCs - 프로 IL-1β에 대한 세포 내 사이토 카인 염색법은 CD14에서 현미경 및 외과 판독 할 수 있습니다. 두 기술은 프라이머 비, 또는 휴식, 휴대폰 제어뿐만 아니라 이소 제어 (도 1 및 2)에 상대적으로 정량화 될 수있다. 프로 IL-1β + 염색 세포의 비율은 평균 형광 강도 (MFI)를 제공하기 위해이 인구의 기하 평균을 곱합니다. MFI는 긍정적 인 염색 세포에 존재하는 프로 IL-1β의 양을 비교합니다.

다음과 같은 β-튜 블린 또는 β-액틴로 세포 내부 통제, (그림 3)에 대하여 정량화 세포 용 해물로부터 면역 블롯 대책 프로 IL-1β. nigericin 처리 된 세포에서 프로 IL-1β에 대한 면역 블롯은 프로 IL-1β의 감소를 공개해야한다. 이것은에 의해 보완됩니다ELISA에 의해 측정 된 상층 액에서 IL-1β, 동시 증가는 R848에 nigericin 조건에 따라 (그림 3, 4). 다른 모든 조건이없는 세포 IL-1β의 존재가 발생한다. 이러한 TNFα, IL-10 및 IL-6 등의 염증성 사이토 카인의 동시 측정, 그 nigericin는 IL-1β의 분비를 일으키는 원인이 특정되어 있는지 확인합니다. 프라이밍의 수준은 시간 (그림 3)과 용량 (그림 4)에 의존, 프라이머 R848 세포 내 프로 IL-1β 및 세포 IL-1β (뿐만 아니라 TNFα, IL-10의 정도에 반영 응답하고, 모든 R848에서 IL-6)의 분비는 (그림 4) 조건을 처리.

그림 1. 세포질 프로 IL-1β는 F에 의해 검출 낮은 세포 계측법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 세포질이 프로 IL-1β는 현미경으로 검출한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 세포질 프로 IL-1β는 SDS-PAGE에 의해 검출된다.res.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 분비되는 IL-1β는 ELISA에 의해 검출된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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