Summary
תאים דנדריטים (DC) להפריש IL-1β בתגובה להכרה TLR8 של פורין הסינתטי, R848, ואחרי הפעלת inflammasome NLRP3 עם nigericin, ולכן, IL-1β יכולים לשמש למדידת פעילות inflammasome NLRP3. צביעה תאית ציטוקינים, immunoblotting, וELISA משמשים למדידת inflammasome NLRP3 תחול והפעלה באמצעות ביטוי IL-1β במדויק.
Abstract
תהליכים דלקתיים כתוצאה מההפרשה של אינטרלויקין (IL) -1 ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון משפחה להוביל לדלקת מקומית או מערכתית, שיפוץ ותיקון רקמות, ושליטה virologic 1, 2. אינטרלויקין 1β הוא מרכיב חיוני של תגובת החיסון המולדת ותורמים לחיסול פולש פתוגנים תוך מניעת הקמתה של זיהום המתמשך 1-5.
Inflammasomes הוא פלטפורמת האיתות המרכזית להפעלה של אנזים אינטרלוקין 1 המרה (ICE או caspase-1). Inflammasome NLRP3 דורש לפחות שני אותות בDCs לגרום להפרשת IL-1β 6. ביטוי חלבון Pro-IL-1β מוגבל ב נח תאים; לכן אות תחול נדרש לשעתוק IL-1β וביטוי חלבון. אות שנייה חשה ידי תוצאות NLRP3 בהיווצרות inflammasome NLRP3 חלבון רב. היכולת של תאים הדנדריטים לresponד לאותות הנדרשים להפרשת IL-1β ניתן לבדוק באמצעות פורין סינטטי, R848, אשר חש ידי TLR8 במונוציטים אדם נגזרים תאים דנדריטים (moDCs) לתאי ראש, ואחרי הפעלה של inflammasome NLRP3 עם רעלן החיידק ו ionophore אשלגן, nigericin.
DCs נגזר מונוציטים מיוצרים בקלות בתרבות ולספק יותר באופן משמעותי מאשר תאי DCs מיאלואידית האנושית מטוהר. השיטה המוצגת כאן שונה ממבחני inflammasome אחרים בכך שהוא משתמש באדם חוץ גופית, במקום עכבר נגזר, DCS ובכך מאפשר לחקר inflammasome במחלות וזיהומים אנושיים.
Introduction
הפעלה של מערכת חיסון מולדת נדרשת לנווט את התגובה חיסונית אדפטיבית במהלך זיהום, מחלה, וחיסון 7. תאים הדנדריטים הם אנטיגן החזק ביותר הצגה בתאים של מערכת החיסון המולדת; הם מתמחים לספיגה של אנטיגנים, הגירה לבלוטות הלימפה, והפעלה של CD4 + נאיבי וcytolytic CD8 + T-תאי 8-10. כדי לאפשר את גילוי פתוגן מהיר מערכת החיסון המולדת מנצלת קולטנים רבים germline מקודד זיהוי תבניות (PRR) שיכירו מוטיבים נגזרו הפתוגן שימור או סמני מארח נגזר של מתח תא ונזק. אגרה כמו קולטנים (TLRs) הן קולטנים זיהוי תבניות קרום מחויבים שמזהים פתוגן phagocytized תאי מסוים הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) ודפוסים מולקולריים סכנה קשורה (damps). על ידי הנהון ניגוד כמו קולטנים (NLRs) הם cytosolic ולהגיב למגוון רחב של PAMPs וdamps. תהנהן כמו קולטנים מחדשלהציג קו הגנה שני נגד פתוגנים המפרים את תא שטח וPRRs endocytic. האינטראקציה של הפתוגן נגזר, או "סכנה" קשורה, גורמים עם ligands TLR וNLR מובילים למצב של התבגרות DC וכתוצאה מאינטראקצית DC גדלה עם תאים אחרים של מערכת חיסון וקידום של תא T והפעלת תא הרג טבעי 11.
אינטרלויקין 1β הוא מרכיב חיוני של ההגנה המארחת נגד זיהום. בעת ההכרה של מיקרואורגניזם, ציטוקינים מעודדי דלקת מאוד, IL-1β, מופרש ופונקציות כמו attractant הכימותרפיה וactivator של תאי מערכת החיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות. בvivo IL-1β היא אחראית במידה רבה לתגובת השלב החריף, כולל חום וציטוקינים דלקתיים סינתזה 12.
רוב NLRs מכיל תחום חוזר עשיר לאוצין מסוף C שהוא חשב לתפקד בחישת יגנד, תחום מרכזי נוקלאוטיד מחייב (נכט) שהוא important לoligomerization NLRP3, ותחום N מסוף מפעיל (PYD בNLRP3) שמתווך הולכים אותות למטרות במורד דרך אינטראקציות חלבון חלבון. חלבון NLRP3 מגדיר מורכב inflammasome הנחקר ביותר בעוצמה. חלבון זה הוא חבר של משפחת NLR ויש לו את היכולת ליצור חלבונים מורכבים מולקולרי רב מורכב מNLRP3, PYCARD חלבון מתאם (הידוע גם בASC), וקרח. עם הפעלת inflammasome PYCARD נקשר לתחומים מסוף NLRP3 N ומגייס ICE באמצעות הפעלת caspase ותחום גיוס תחומים (כרטיס). המרת אנזים אינטרלויקין 1 בתחילה נוצר כאב תסס מכיל מוטיב כרטיס בN-הסופית שלה. תוצאות היווצרות Inflammasome בהבאת שתי מולקולות ICE מספיק קרובה כדי לגרום להפעלת זירוזם. מורכב inflammasome הוא הכרחי להפעלת ICE ובכך מאפשרת לו להמיר-IL-1β פרו cytoplasmic להבשיל ציטוקינים.
הפרשה מוצלחת של IL-1β בDCs דורש חישה של שני אותות סכנה שונים ועצמאיים. ראשית, חישת TLR של PAMPs, damps, או ציטוקינים איתות (TNFα או IL-1β) גורמת להגברת ביטוי של ביטוי חלבון פרו IL-1β-cytoplasmic. שנייה, לעתים קרובות שונה, אות נדרשת להיווצרות מורכבת inflammasome במעלה הזרם של התבגרות ICE. Inflammasome כמה מגרה אותות כוללים רעלים נקבוביות קרום חיידק יוצרים (כגון nigericin), גבישי lysosomal שיבוש (כגון גבישי urate גלוטמט, MSU), וה-ATP תאי. המנגנון נגד הזרם המוביל לNLRP3 הפעלת inflammasome ידי מפעילים המגוונים אלה אינם ברור. מחקרים חוקרים במעלה הזרם איתות של היווצרות inflammasome מציע כי אירועים תאיים, כגון אינדוקציה של היפוקלמיה או מיני חמצן תגובתי (ROS) בעקיפין להפעיל inflammasome 13-28.
בקרב המפעילים נגיפיים השונים של inflammasome NLRP3 היא שפעת, המספקת בOTH האות הראשונית ומשנית הנדרשת להפרשה IL-1β 3, 29-33. באמצעות מודלים נוקאאוט NLRP3 עכבר נמצא כי הפרשת IL-1β בDCS היא NLRP3 תלויה 32. בנוסף, עכברי נוקאאוט NLRP3 נמשכים פחות לויקוציטים לאתר של זיהום וחוו תמותה גבוהה יותר 2, 5. שני מאמרים אחרונים מציעים מנגנון להפעלת inflammasome NLRP3 במהלך זיהום בנגיף שפעת; הראשון, תחול באמצעות הכרה של רנ"א הנגיפי על ידי TLR7 או TLR8 (תלוי בביטוי TLR של התא להגיב) או באמצעות חישה של חיידקי commensal ידי TLRs האחר כדי לגרום ביטוי פרו IL-1β-cytoplasmic, ואחריו אות שנייה, הפעלה של NLRP3 היווצרות inflammasome ידי חלבון ערוץ יון הנגיפי M2 ברשת טרנס גולג'י 33, 34. בשלב האחרון, מפעילה של inflammasome NLRP3 מושגת על ידי הפרעה של יונית תאיים <em> הסביבה המובילה לייצור ROS, שהוא, בפשטות, חש ידי NLPR3 כאות ליצירת inflammasome. עם זאת, המנגנון המדויק של מעלה זרם הפעלת inflammasome פעילות ICE במהלך זיהום שפעת עדיין אינו ברור.
עבודה זו מתארת טכניקת ערך ללימוד inflammasome NLRP3 בmoDCs אדם שיכול לשמש כבסיס לחקירה נוספת של המסלול שבבסיס DC מבוסס הפרשת IL-1β בתגובה לקשירת TLR8 עם R848 ואחרי הפעלה של inflammasome ידי כן activator הידוע של NLRP3, nigericin. וריאציות של שיטה זו ניתן להשתמש בסוגי תאים אחרים, כולל, אך לא מוגבלת ל: מונוציטים, מקרופאגים, תת DC אחר, ותאי אפיתל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: דגימות מחקר מתקבלות ומאוחסנות למחקר בהסכמה של תורמים. צריכה להיות מקודדות כל הדגימות או אנונימי לפני השימוש. פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של דירקטוריון סקירה המוסדית שלנו.
1. בידול של האדם מונוציטים דם ההיקפיים לתאים דנדריטים מונוציטים נגזרו.
הערה: מעילים באפי אדם משמשים כמקור של אדם תאי דם היקפי (PBMCs) והתקבלו ממרכז ניו יורק הדם (ניו יורק, ניו יורק). תורמי דם מתנדבים בריאים. ההליך של 5 הימים מתחיל בציפוי של תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) על גבי תרבית רקמת צלוחיות 35,36. הבדלים ראויים לציון מהפרוטוקולים שפורסמו הם כדלקמן:
- השתמש 225 סנטימטר 2 צלוחיות תרבית רקמת קלקר שאינו pyrogenic עם מכסה מסנן לדבוק כולל של 2x10 8 PBMCs לכל בקבוק במקום צלחת תרבית רקמת 10 קלקר סנטימטרs (58 סנטימטר 2) (שלב 1).
- הכן תקשורת עם 5% בסרום אדם (PHS; 30 מיליליטר) ונקווה ב500 מיליליטר RPMI-1640 + L-גלוטמין, חיץ 5 מיליליטר 1 M HEPES, ו1.4 מיליליטר 50 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין (5% תקשורת PHS) ואחרי סינון דרך סינון 20 מיקרומטר. להוסיף סך של 50 מיליליטר 5% תקשורת PHS ל225 סנטימטר בקבוק תרבות 2 רקמות.
- שטוף תאים דבקים שלוש פעמים עם 25 מיליליטר RPMI-1640 טריים. לנער במרץ במשך 5 שניות בכל שטיפה ולשאוב תאים חסיד שאינם (שלב 4).
- הוספת 190 μl של 400 IU / IL-4 ו380 μl μl של 100 IU / μl GM-CSF לכל בקבוק (שלב 3) ביום 0, 2, ו -4. יום 0 מוגדרת כPBMCs היום לראשונה מצופות בשלב 1 (שלב 8).
- 5 moDCs יום קציר בריכוז של 1x10 6 תאי מיליליטר / (שלב 15).
- השתמש moDCs מייד במצב המנוחה שלהם. שלבי 17-22 הם מעולם לא ביצעו. הערה: דוגמאות צריכים להיות מעובד בהקדם האפשרי לאחר איסוף לתוצאות הטובות ביותר.
- moDCs aliquot בריכוזtion של 2x10 5 תאים / טוב (200 μl / טוב של 1x10 6 תאים / מיליליטר) ב96 צלחת גם עגול תחתית (כתם מערבי, ELISA, FACS) או על גבי chamberslide פולי-L-ליזין שטופל (מיקרוסקופית) לניסויים . שים לב: יש לפחות 4 תנאים: (בקרה שלילית) לחלוטין unstimulated, תחול רק, הפעלה בלבד, ותחול אחרי הפעלה. ניתן להרחיב תנאים לכלול פקדי diluent לR848 וnigericin אם תרצה בכך. אם assay במורד הזרם הוא ICS, כפילויות נחוצות לפקדי אלוטיפ.
. 2 קרקע Inflammasome - 1 איתותים
- מחדש R848 lyophilized בDMSO על פי הוראות היצרן. לדלל המניה עובדת ב RT עם RPMI-1640.
- הוספת R848 בריכוז סופי 10 מיקרומטר לנכס בארות ל18 שעה. תאי מקום בחממה ב 37 ° C ו-CO 2 של 5%.
3 הפעלת Inflammasome NLRP3 -. איתותים2
- מחדש nigericin lyophilized באתנול על פי הוראות היצרן. לדלל המניה עובדת ב RT עם RPMI-1640 לפני הוספה לתנאים המתאימים.
- הוספת nigericin בריכוז סופי 20 מיקרומטר ולחזור לחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 6 שעות. אין שלבי כביסה להתרחש בין תחול ובמהלך ההפעלה. הערה: ההפרשה של IL-1β מוגברת על ידי הנוכחות של יונופורים סידן, brefeldin chlorophenylhydrazone, monensin, dinitrophenol, או ציאניד קרבוניל 37, 38. לכן, תוספת של מעכבי הפרשה אלה אינן מומלצים בעת ניתוח תחול או פעילות inflammasome שכן הוא ישנה את ההפרשה של IL-1β.
4. אוסף דוגמאות IL-1SS
- צנטריפוגה את הצלחת עם תאים וsupernatants ב974 XG במשך 3 דקות.
- מבלי להפריע לתא גלולה, לשאוב supernatant ולהעביר כלeparate עגול עם תחתית צלחת על מנת למדוד את הפרשת ציטוקינים מsupernatants. הערה: Supernatants ניתן לאחסן באופן זמני ב -20 מעלות צלזיוס או -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
- לשטוף את כדורים הסלולריים שלוש פעמים עם 200 μl של 1x PBS ב974 XG במשך 3 דקות כדי להסיר כל IL-1β תאיים מהדגימות הסלולריות. שים לב: כאשר שוטפים את כדורי תא מצלחת גם 96, להסיר לשטוף על ידי היפוך צלחת מהיר לפח אוסף, כדי לא להפריע לדוגמה.
5. מדידת IL-1SS מדוגמאות נייד וSupernatant
- תאיים ציטוקין מכתים (ICS): פרוטוקול ICS מתואר להלן 39, 40. שים לב: אין להשעות את התאים אם assay במורד הזרם הוא מיקרוסקופית. צריכים לעשות את כל הכביסות והשאיפות מבלי להפריע את שכבת תאים / גלולה (תלוי בassay במורד).
- הוספה של מדיה PHS 5% 100 μl לתוך בארות מתאימות. להוסיףנפח מתאים (כ 1 μl/2x10 5 תאים, או μl 1 / טוב) של כותרתו fluorescently α-CD11c וα-CD14 (סמני פנוטיפ; שיבוט B-ly6 וMφP9, בהתאמה) או שליטת אלוטיפ התאים 10 דקות ב RT בחושך.
- לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS ב974 XG במשך 3 דקות.
- תקן את התאים על ידי הוספה של 4% PFA 100 μl עבור 20 דקות ב RT בחושך.
- השהה פוינט: לשטוף עם 100 PBS μl 1x ב974 XG במשך 3 דקות ולאחסן ב 4 ° CO / N ב 1x PBS.
- הוספה של חיץ permeabilization 100 μl לתאים ל30 דקות. הערה: חיץ permeabilization מורכב של 1x PBS עם 0.3% טריטון X-100, ו -1% אלבומין בסרום שור (BSA) לpermeabilization. נא לא להפריע תאים חסיד כאשר assay במורד הזרם הוא מיקרוסקופית.
- הוספת נפח מתאים (5 תאים כ 62 antibody/2x10 ng, כ או 2.5 μl / טוב) של α-IL-1β-FITC (שיבוט 8516) או שליטת אלוטיפ עבורשעה 2 באינקובטור ב 37 ° C.
- שטוף תאים שלוש פעמים עם 200 μl של חיץ permeabilization ב974 XG במשך 3 דקות בחושך.
- אופציונאלי: כתם עם DAPI, להוסיף mountant, ומניח coverslip בעדינות על גבי שקופיות זכוכית. לאפשר mountant לרפא O / N לפני צילום תמונות במיקרוסקופ.
- לרכוש את הנתונים על ידי FACS או במיקרוסקופ. הערה: השווה את אלוטיפ עבור כל תנאי לצביעה המתאימה בעת ניתוח על ידי FACS או במיקרוסקופ.
- FACS: רוכשת את הדגימה אחת בכל פעם. הגדר את / שער SSC FSC בתאים חיים, ואחריו gating על CD11c + CD14 - תאים לפני ניתוח מכתים פרו-IL-1β אוכלוסיית moDC.
- מיקרוסקופית: הגדר את זמן החשיפה באמצעות מדגם מכתים החיובי - R848 שטופל. השתמש DAPI + פרו-IL-1β + וDAPI + פרו-IL-1β - כדי לקבוע אחוז פרו-IL-1β + moDCs להביע.
- SDעמוד-S: immunoblotting מבוצע כדי לזהות פרו-IL-1β. הערה: הטכניקה המתוארת להלן משלבת טכניקה סטנדרטית immunoblotting, ג'ל polyacrylamide 4-20% שיפוע, וגילוי ניאון או chemiluminescent 41, 42.
- תאי Lyse ישירות ב10 μl denaturing מאגר תמוגה (5 μl β-mercaptoethanol/950 חיץ מדגם μl Laemmli אחרי דילול 1:01 עם חיץ תמוגה תא). העבר את lysate ל1.5 צינורות מיליליטר Eppendorf.
- lysate חום על צלחת יבשה 10 דקות ב 100 ° C.
- ספין lysate ב20,800 XG על minicentrifuge דקות 1 לרכז את נפח הנוזל. השהה נקודה: אפשר להקפיא דגימות ב -20 ° C לאחסון לטווח קצר.
- טען את הנפח הכולל על ג'ל polyacrylamide. הפעל 140 V דרך תיבת ג'ל למשך כ 1 שעות, או עד שצבען מול בורח תחתית הג'ל.
- העבר את החלבון מן ג'ל polyacrylamide על membr PVDF Immobilon-FLane ל90 דקות ב100 V. בלוק הקרום עם BSA 5% בטריס בופר / 0.1% Tween-20 (TBS-T) במשך שעה 1. הערה: PVDF Immobilon-FL הוא הטוב ביותר לשימוש בזיהוי ניאון. קרום עם הרכב שונה מומלץ לטכניקות זיהוי אחרות כדי להגדיל את יחס האות לרקע.
- מדולל נוגדנים ראשוניים ומשניים ב10 מיליליטר של BSA 5% / TBS-T. בצע incubations נוגדן הראשוני על 4 מעלות CO / N תוך רעד ונוגדנים משני ב RT עבור שעה 1 ואילו רועדים.
- לשטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBS-T במשך 5 דקות תוך כדי הטלטול בין incubations נוגדן הראשוני והמשני ושוב בין incubations והדמיה משני. הערה: ניתן לאתר להקות באמצעות ניאון או זיהוי chemiluminescent. עקוב אחר ההוראות של היצרן לצורך זיהוי.
- ELISA: דוגמאות שהם קפואים לאחסון צריכה לאזן לRT לפני הניתוח. ספין למטה דגימות בצנטריפוגה כדי לגבש condens supernatantation. עקוב אחר ההוראות של היצרן למדידה של IL-1β. הערה: בפרוטוקול זה IL-1β נמדדים במיוחד; עם זאת, מדידה בו זמנית של TNFα, IL-6, וציטוקינים המערכת החיסונית IL-10 להבטיח את התנאים המתאימים היו דרוכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקות אלה מודדים TLR8 תחול עם R848. מכתים ציטוקינים תאיים לפרו-IL-1β מאפשר למיקרוסקופיה וFACS קריאות מCD14 - CD11c + moDCs. ניתן לכמת את שני הטכניקות ביחס למי שאינו דרוך, או מנוחה, בקרת תא, כמו גם שליטת אלוטיפ (איורים 1 ו -2). אחוזים של תאים פרו-IL-1β + צביעה מוכפל בחציון הגיאומטרי של אוכלוסייה זו כדי לספק את עוצמת הניאון החציונית (MFI). MFI ניתן להשוות לסכום של Pro-IL-1β הווה בתאים מכתים החיוביים.
צעדי immunoblotting פרו-IL-1β מlysate התא, אשר לאחר מכן הוא לכמת ביחס לבקרה פנימית סלולרית, כגון β-טובולין או β-אקטין (איור 3). Immunoblotting לפרו-IL-1β בתאי nigericin מטופלים צריך לחשוף ירידה בפרו-IL-1β. זה נתמך על ידיגידול מקביל בIL-1β בsupernatants, שנמדדו על ידי ELISA, רק בR848 אחרי תנאי nigericin (איורים 3 ו -4). כל התנאים אחרים צריכים לגרום אין לו הווה IL-1β תאי. מדד בו זמני של ציטוקינים דלקתיים אחרים, כגון TNFα, IL-10, ו-IL-6, להבטיח nigericin שהוא ספציפי בגרימת הפרשה של IL-1β. רמת תחול היא זמן (איור 3) ומינון (איור 4) תלוי, תגובה באה לידי ביטוי במידה של IL-1β הפרו תאיים בR848 דרוך ו-IL-1β תאיים (כמו גם TNFα, IL-10, ו IL-6) הפרשה בכל R848 טופלה תנאים (איור 4).
איור 1. Cytoplasmic פרו-IL-1β הוא זוהה על ידי F cytometry הנמוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Cytoplasmic פרו-IL-1β הוא זוהה על ידי מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3.-IL-1β פרו cytoplasmic הוא זוהה על ידי-SDS.res.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מופרש IL-1β הוא זוהה על ידי ELISA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ציטוקינים דלקתיים הם חלק בלתי נפרד בהיגוי תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות כדי להילחם בזיהום נגיפי. IL-1β מופרשים הוכח להגדיל בשפעת זיהום 3, 43, 44. המנגנון המדויק שבאמצעותו ציטוקינים אלה מעובדים בתגובה להכרה נגיפית בתאים הדנדריטים אנושיים אינם מובנה במלואם. ערכות בידוד DC מיאלואידית יקרות וזמן רב. ערכות בידוד ומיון FAC שלא בכוונה אולי מתח או להפעיל את התאים. בנוסף, יש לעתים קרובות כמות מספקת של תאים מבודדים לניסויים. למרבה המזל, את הביולוגיה של אדם moDCs דגמים מקרוב זה של DCs מיאלואידית האנושי הראשוני במבחנה 45, 46. שני סוגי התאים דורשים שני אותות, TLR תחול והפעלת NLRP3, כדי להשיג את הפרשת IL-1β בוגרת. לכן, moDCs לספק וסוג תא מודל DC זול ופשוט ללימוד והימורter להבין את הרלוונטיות ואת התפקיד של inflammasome NLRP3 בבריאות ובמחלות של בני אדם.
זיהוי של IL-1β ניצול השיטות שתוארו כאן מספק immunoassays פשוטה ויעילה השונות כדי לחקור מחלות בפתולוגיות דלקתיות קשורות, כוללים זיהום רנ"א נגיפי; באופן ספציפי, כיצד למדוד IL-1β במגוון רחב של דרכים בתגובה לR848 וnigericin גירוי. אגוניסטים TLR אחרים (כגון midi (אני: C) וLPS) וממריצי NLRP3 inflammasome (כגון ה-ATP וMSU) יכולים לשמש למדידת פעילות זו על גירוי בהקשר של פתולוגיות מחלה אחרות; עם זאת, פעמים גירוי ותנאים עשויות צריכים להיות מותאמות. זמני חשיפה מגיב וריכוזים היינו גם צריכים להיות מותאמים בעת שינוי בפרוטוקול זה לשימוש בסוגי תאים אחרים ומינים.
כל התנאים יש להפעיל בשלושה עותקים והתגובה נשקלת בקפידה למטרות בקרת איכות; זה נפוץהשתנות תורם גדולות להתקיים. DCs נגזר מונוציטים הם סוג תא, לא קו סלולרי, והטרוגניות קיימת בתוך תרבות moDC.
הטרמה יכולה להיות מאושרת עם ICS לפרו-IL-1β והשוואת moDCs נח למצב דרוך-R848. moDCs מנוחה לא צריך לגרום להכתמה חיובית. לקרקע גם עשוי להיות מאומת על ידי immunoblotting לביטוי של פרו-IL-1β. תוצאות מוצלחות R848 תחול בהפרשת ציטוקינים מעודדי דלקת TNFα, IL-6, וציטוקינים המערכת החיסונית IL-10 עם הפרשה מינימאלית של IL-1β. תאים מופעלים Inflammasome לא צריכים להראות עלייה נוספת בTNFα, IL-6, ו-IL-10 הפרשה אבל יהיו לי עלייה בריכוזי IL-1β מופרשים בהשוואה לתאי כלא פעילים.
Pro-IL-1β עשויים להשתחרר באופן פסיבי במהלך המוות של תאי נמקים ולכן מבחני זמינות ביולוגית עשויים להיות עניין. לחלופין, immunoblotting יכול להתבצע על supernatants על מנת לקבוע את המשקל המולקולרי של IL-1β מופרשים כדי להבטיח IL-1β פעילים היא הצורה של ציטוקינים המופרשים; בוגרת IL-1β הוא 17 kDa בעוד המבשר הוא ביום 31 בkDa. כדי למדוד IL-1β מsupernatants, ריכוז תא יהיה חייב להיות מותאם על מנת להשיג איתות חיובית מעל לסף הגילוי. הפעלת caspase-1 יכולה להיות גם נמדדה באמצעות מגוון של שיטות כדי לקבוע הפעלת inflammasome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר אוליבייה Manches, Ph.D., דבור Frleta, Ph.D., וMeagan או 'בריין, MD לתמיכה והמשוב שלהם. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחל מדבקות והושלם במימון NIH מענקי פרסים רות ל 'Kirschstein שירות הלאומי למחקר למלגות פרט predoctoral (F31) לקידום גיוון במחקר הקשורות לבריאות (AI089030) וRO1 (AI081848 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12 well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96 well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12% polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| Laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| Human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| Nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol - 4 L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
