Summary
नि: शुल्क और सस्ती सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के एक वेब कैमरा और एक संयोजन का उपयोग करना, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में लोकोमोटिव पैटर्न गति, दूरी, और विभिन्न मोटर गतिविधियों के समय में अंतर का पता लगाने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर आंदोलन का विश्लेषण और लोकोमोटिव व्यवहार में विभिन्न असामान्यताओं का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है. इन प्रणालियों में व्यवहार में जानकारी का खजाना प्रदान कर सकते हैं, इन प्रणालियों की लागत और जटिलता कई प्रयोगशालाओं के लिए निषिद्ध किया जा सकता है. हम डी. मेलानोगास्टर में लोकोमोटिव व्यवहार और जब्ती आंदोलन को मापने के लिए एक कम लागत परख विकसित किया है. प्रणाली दूरी चले गए ट्रैक करने के लिए सस्ता और मुफ्त सॉफ्टवेयर का एक संयोजन का उपयोग कर कार्रवाई की जा सकती है कि छवियों पर कब्जा करने के लिए एक वेब कैम का उपयोग करता है, एक निर्धारित समय अवधि के दौरान आंदोलन और आंदोलन की अवधि के औसत वेग. इस प्रणाली की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, हम डी. के एक समूह के 3-10 गुना अधिक अतिसंवेदनशील जब्ती की तरह गतिविधि के लिए (SLA) जंगली प्रकार मक्खियों से हैं जो म्यूटेंट, बैंग के प्रति संवेदनशील (बी एस) paralytics, मेलानोगास्टर की जांच की. इस उपन्यास प्रणाली का उपयोग करना, हम पता लगाने में सक्षम थे कि बी एस mutanटी धमाके बेहोश (बीएसएस) जंगली प्रकार मक्खियों से एक उपन्यास वातावरण में खोजपूर्ण हरकत के निचले स्तर को दर्शाती है. इसके अलावा, सिस्टम सामान्यतः प्रकार द्वितीय मधुमेह के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है जो दवा मेटफार्मिन, बी एस म्यूटेंट में SLA की तीव्रता को कम कर देता है कि पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
Introduction
अपनी कम उम्र और उपलब्ध मजबूत आनुवंशिक उपकरण दिया, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर विभिन्न रोगों के एटियलजि और विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं की अंतर्निहित फिजियोलॉजी की जांच के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली है. कई मामलों में, यह व्यवहार आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ इन मॉडल जीवों 1,2 में हरकत पर है कि प्रभाव को मापने के लिए फायदेमंद है.
सामान्यतः दो आयामों 3-7 में मक्खी आंदोलन को मापने के लिए किया जाता है कि तरीकों की एक किस्म है. इन प्रणालियों एक साथ कई मक्खियों की ट्रैकिंग का समर्थन कर सकते हैं और वेग, रिकॉर्ड पथ लंबाई मापने के लिए और एक मक्खी आगे बढ़ खर्च किया गया समय का प्रतिशत रिकॉर्ड कर सकते हैं. वे हरकत और मक्खी आंदोलन 6-9 की यौन द्विरूपी प्रकृति पर दवाओं के प्रभाव सहित संदर्भों की एक किस्म में आंदोलन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन पद्धतियों में बड़ी खामी ट्रैकिंग व्यवस्था की लागत हैमंदिर या इसी सॉफ्टवेयर और कैमरा. कुछ मामलों में, यह डॉलर के हजारों में चला सकते हैं. लागत केवल एक नव पृथक उत्परिवर्ती की लोकोमोटिव पैटर्न बढ़ाता है, उदाहरण के लिए, एक ऐसी प्रणाली के सीमित उपयोग की आवश्यकता होगी कि एक प्रयोगशाला के लिए एक विशेष चिंता का विषय है.
एक सरल लेकिन कम मजबूत विधि रिकॉर्ड आंदोलन एक मक्खी एक बंद ट्यूब 10,11 के बीच में रख दिया गया है कि एक अवरक्त प्रकाश किरण पथ को पार कितने समय के आधार पर जो प्रणाली का उपयोग करने के लिए है. ऐसी प्रणालियों आंदोलन और नींद जगा चक्र पर बहुमूल्य जानकारी दे सकते हैं, वे वे मक्खी की वास्तविक पथ पर कब्जा करने में विफल से अधिक या अनुमान आंदोलन के तहत कर सकते हैं. अतिरिक्त उच्च संकल्प तरीकों इन सीमाओं को 12 कोशिश करते हैं और नाकाम करने के लिए इस्तेमाल किया गया है उदाहरण के लिए, ट्यूब के सिरों पर काफी आंदोलन प्रदर्शन है कि मक्खियों के रूप में कम आंदोलन को पंजीकृत करेंगे मक्खियों.
सरल और सस्ता अभी भी geotaxi उपाय है कि उपकरणों के चढ़ रहे हैंएस, एक ट्यूब या ट्यूब 2,13 की एक श्रृंखला के माध्यम से मक्खियों की ऊपर की गति. इस तरह की व्यवस्था कर रहे हैं सस्ते और आसानी से geotaxis दोषों की पहचान कर सकते हैं, वे जांचकर्ताओं के हित के लिए किया जाएगा कि आंदोलन के कई अन्य पहलुओं पर कब्जा करने में विफल.
कई प्रयोगशालाओं, सेट अप और संचालित करने के लिए डी. मेलानोगास्टर उपभेदों में व्यवहार मतभेद निस्र्पक के लिए एक लाभप्रद उपकरण होगा सरल है कि एक कम लागत मजबूत विश्लेषण प्रणाली के लिए. यहाँ हम कम से कम दो सौ डॉलर के लिए सेट अप और मक्खी आंदोलन की राह, वेग और अवधि के बारे में जानकारी देने के लिए सक्षम है किया जा सकता है कि एक परख का वर्णन. परख की प्रभावकारिता प्रदर्शित करने के लिए, हम यह पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दिखा रहा है कि आंकड़ों को पेश; बरामदगी और दवा मेटफार्मिन का 2) की क्षमता, के लिए अतिसंवेदनशील है कि एक बैंग के प्रति संवेदनशील (बी एस) उत्परिवर्ती में 1) एक हरकत का दोष है जो आमतौर पर जब्ती की तरह गतिविधि (SLA) मैं की तीव्रता को कम करने के लिए, प्रकार द्वितीय मधुमेह के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता हैn दो बी एस म्यूटेंट.
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Protocol
1. एजेंट की तैयारी हरकत परख के लिए मक्खियों
- स्थानांतरण धीरे व्यक्ति खाली शीशियों में दोहन और एक कपास प्लग के साथ शीशियों टोपी द्वारा मक्खियों. मक्खियों अवलोकन के पहले अबाधित 20-30 मिनट बैठने की अनुमति. यह पिछले अध्ययनों unanesthetized मक्खियों 14 की तुलना में संज्ञाहरण जोखिम व्यवहार को बदल सकते हैं पाया है के रूप में पूर्व व्यवहार अवलोकन घंटे के भीतर मक्खियों anesthetize नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- धीरे शीशी से बाहर उड़ नल और हवाई यात्रा की अनुमति के लिए छोटे slits के साथ (5 मिमी उच्च) एक 5 सेमी व्यास पेट्री डिश आड़ में व्यक्तिगत मक्खियों जगह है. नीचे से रोशन और पेट्री डिश ऊपर घुड़सवार एक वेब कैमरा का उपयोग मक्खियों निरीक्षण करते हैं.
2. एजेंट की तैयारी जब्ती परख के लिए मक्खियों
- दो दिन पुरानी जब्ती संवेदनशील मक्खियों फ़ीड मानक खमीर / cornmeal / अगर मीडिया या मानक मीडिया या तो दवा के साथ सीधे मिलाया. डेटा यहाँ प्रस्तुत के लिए, मक्खियों 1 जायें या तो खिलाया गयामानक मीडिया या मेटफार्मिन के 25 मिलीग्राम के साथ मिश्रित मानक मीडिया की 1 ग्राम च.
- मक्खियों व्यक्ति खाली शीशियों में कोमल दोहन द्वारा उन्हें स्थानांतरण और एक कपास प्लग के साथ शीशियों टोपी, मीडिया या मीडिया के साथ साथ दवा पर दो दिनों के लिए तंग आ गया है, के बाद. मक्खियों अवलोकन के पहले 20 मिनट के लिए undisturbed बैठने की अनुमति. यह पिछले अध्ययनों unanesthetized मक्खियों 14 की तुलना में संज्ञाहरण जोखिम व्यवहार को बदल सकते हैं पाया है के रूप में पूर्व व्यवहार अवलोकन घंटे के भीतर मक्खियों anesthetize नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- 10 सेकंड के लिए उच्चतम सेटिंग का उपयोग कर एक प्रयोगशाला vortexer पर एक मक्खी युक्त भंवर व्यक्तिगत शीशियों. सीधे पेपर ऊपर घुड़सवार एक वेब कैमरा नीचे कागज के एक रिक्त सफेद चादर पर स्थिर मक्खी रखें.
3. वीडियो रिकॉर्डिंग
- HandyAvi सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर आंदोलन या SLA रिकॉर्ड http://www.azcendant.com/download.htm . इस कार्यक्रम के लिए वेब कैमरा का उपयोग करता हैउपयोगकर्ता सेटिंग्स पर आधारित छवियों पर कब्जा.
- कब्जा टैब के तहत समय चूक छवियों विकल्प, खिड़की खोलता है, कब्जा उपकरण के रूप में वेब कैमरा चुनें. सबसे प्रयोगों के लिए 640 x 480 का वीडियो फ्रेम आकार पर्याप्त है.
- संपीड़न के लिए इंटेल IYUV कोडेक चुने और जब्ती परख के लिए 0.1 सेकंड / फ्रेम का चयन या आंदोलन परख के लिए 0.1-0.5 सेकंड / फ्रेम का चयन. उन्नत टैब के तहत प्रत्येक को पकड़ने के लिए एक. बीएमपी छवि फ़ाइल बनाएँ का चयन करें और यह (छवि ढेर) लेता है कि छवियों को स्टोर करने के लिए कार्यक्रम के लिए एक फ़ोल्डर का चयन करें.
- कागज की शीट पर एक मृत मक्खी रखें. वीडियो सेटिंग्स बॉक्स पर क्लिक करें और एक चमकदार सफेद पृष्ठभूमि और गहरे रंग की मक्खी के साथ एक स्पष्ट विपरीत है कि वहाँ तो डिवाइस सेटिंग्स टैब के अंतर्गत सेटिंग्स समायोजित.
- रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए शुरू बटन पर क्लिक करें. रिकॉर्डिंग की अवधि समाप्त हो जाने के बाद, स्टॉप बटन पर क्लिक करें. छवि पर ढेर अब चयनित फ़ोल्डर में होना चाहिए. नोट: रिकॉर्डिंग से पहले, यह सुनिश्चित है कि folछवि ढेर के लिए चयनित der खाली है.
4. ImageJ का उपयोग कर डेटा विश्लेषण
- पर डाउनलोड किया जा सकता है, जो ओपन एनआईएच के मुफ्त इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . नोट: प्रोग्राम डाउनलोड करने के अलावा, Multitracker प्लग - इन डाउनलोड और पर संकेत के रूप में स्थापित किया जाना चाहिए http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
- फ़ाइल टैब पर क्लिक करें और फिर आयात → छवि अनुक्रम का चयन करके ImageJ में छवि ढेर आयात करें.
- छवि पर ढेर वाले फ़ोल्डर का चयन करें, छवियों में से एक पर प्रकाश डाला और खुला का चयन करें. एक दृश्य विकल्प संवाद बॉक्स खुल जाएगा. संख्यानुसार क्रमबद्ध नामों पर क्लिक करें और फिर ठीक का चयन करें और छवि पर ढेर ImageJ में लोड किया जाएगा.
- थ्रेसहोल्ड सभी छवियों प्रत्येक मक्खी होने के साथ एक सफेद पृष्ठभूमि के होते हैं तोएक काले डॉट को बदल दिया. , इस प्रक्रिया को शुरू छवि टैब के तहत प्रकार → 8 बिट का चयन करके एक 8 बिट प्रारूप करने के लिए छवि परिवर्तित करने के लिए.
- फिर छवि टैब पर क्लिक करें और → दहलीज समायोजित चयन करें. इस सीमा बिंदु समायोजित किया जा सकता है काट जिसमें थ्रेसहोल्ड डायलॉग बॉक्स खुलेगा.
- एक टुकड़ा एक काले रंग की बिंदी का अभाव है वहां अतिरिक्त काले बिंदु हैं या देखने के लिए अगर चित्रों के माध्यम से स्कैन करें. यदि यह मामला है, इस समस्या को कम करने के लिए सीमा को समायोजित. आमतौर पर सीमा एक पर्याप्त मूल्य के लिए कार्यक्रम चूक के रूप में समायोजित करने की आवश्यकता नहीं है.
नोट: ढेर में हर स्लाइड मक्खी की स्थिति का प्रतिनिधित्व सिर्फ एक काले रंग की बिंदी होनी चाहिए. - थ्रेसहोल्ड संवाद बॉक्स में लागू चुने और संवाद बॉक्स मास्क परिवर्तित करने के लिए खुल जाएगा. विकल्पों में से किसी पर क्लिक करें लेकिन सिर्फ सीमा को ठीक छवि ढेर पर क्लिक न करें.
- छवि पर ढेर thresholding के बाद, चयन Multitracker प्लग में प्लगइन्स टैब के अंतर्गत क्रम मेंपिक्सल में मक्खी के आंदोलन को मापने. वस्तु ट्रैकर संवाद बॉक्स दिखाई देगा.
- संवाद बॉक्स में दिए गए चार विकल्पों में से सभी पर क्लिक करें और फिर ठीक का चयन करें. Multitracker प्लग में तो प्रत्येक टुकड़ा में काले डॉट को निर्देशांक देते हैं और परिणाम विंडो के साथ ही पिक्सल में कुल पथ लंबाई में इन सूची जाएगा. पथ खिड़की मक्खी ले लिया मार्ग की एक चित्रमय प्रदर्शन देता है.
- परिणाम विंडो से एक्स और y-निर्देशांक सूची की प्रतिलिपि बनाएँ और एक एक्सेल स्प्रेडशीट में डेटा चिपकाने. ढेर में किसी भी स्लाइड यह में एक काले रंग की बिंदी नहीं है, Multitracker कार्यक्रम कि स्लाइड पर रोक देगा. यदि ऐसा होता है, यह सुनिश्चित करने के लिए 4.2 और फिर से सीमा पर ढेर करने के लिए कदम वापस जाने के लिए आवश्यक है कि प्रश्न में स्लाइड में एक काले रंग की बिंदी के रूप में मक्खी रजिस्टरों.
- कागज के एक रिक्त सफेद टुकड़े पर एक सेमी अलग स्थान दिया गया है कि दो डॉट्स की एक अलग छवि ले, पथ सेमी पिक्सल से लंबाई परिवर्तित करने के लिए.
- ऊपर का पालन करेंकदम (3.1-4.4.2), एक्स निर्धारित करने के लिए, वाई पिक्सेल दो डॉट्स के लिए निर्देशांक और एक मुख्यमंत्री को इसी पिक्सेल की संख्या निर्धारित करने के लिए इस जानकारी का उपयोग करें. इस रूपांतरण कारक सेमी में आंदोलन डेटा उत्पन्न करने के लिए कदम पाँच में प्रयोग किया जाता है. नोट: बार यह किया है, यह भविष्य की सभी रिकॉर्डिंग के लिए तय कैमरा रखने के लिए महत्वपूर्ण है. कैमरा ले जाया या निकाला जाता है हर बार, एक सेमी पिक्सल परिवर्तित करने के लिए इस कदम को दोहराने की जरूरत है.
- शरीर की स्थिति और प्रकाश की तीव्रता / प्रतिबिंब में मामूली उतार चढ़ाव छवियों thresholding जब उत्पन्न होता है कि काले डॉट के आकार और केंद्र को प्रभावित करेगा क्योंकि Multitracker प्लग द्वारा उत्पन्न होता है कि पथ लंबाई आंदोलन overestimates. इस शोर मक्खी आंदोलन का सही आकलन प्राप्त करने के लिए हटा दिया जाना चाहिए.
5. एक्सेल का उपयोग कर डेटा विश्लेषण
- X की श्रृंखला आयात द्वारा दर्ज आंकड़ों से शोर को दूर, वाई Multitracker जनसंपर्क द्वारा उत्पन्न निर्देशांकफ्लाई विश्लेषण, लेखकों के द्वारा बनाई गई एक एक्सेल दृश्य मूल कार्यक्रम में ogram. (कार्यक्रम लेखकों से संपर्क करके उपलब्ध है.)
- क्लिक मुझे बटन पर क्लिक करें और एक मूल्य सीमा कट ऑफ का चयन करें. SLA विश्लेषण के लिए 0.5 सेमी / सेक की एक सीमा मान का चयन करें या आंदोलन के विश्लेषण के लिए 0.1-0.3 सेमी / सेक के बीच एक मूल्य का चयन करें. ठीक क्लिक करें और कार्यक्रम वेग, समय और आंदोलन की दूरी की गणना करेगा. नोट: कार्यक्रम अनुक्रमिक 0.5-1.0 सेकंड डिब्बे में डेटा का मूल्यांकन करने के लिए एक स्लाइडिंग खिड़की विश्लेषण का उपयोग करता है और उस खिड़की के दौरान वेग की गणना करता है. उपयोगकर्ता परिभाषित कटऑफ से ऊपर कुछ भी मक्खी आंदोलन के रूप में व्यवहार किया जाता है.
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Representative Results
यहाँ वर्णित तकनीक ड्रोसोफिला बी एस म्यूटेंट 1 में SLA में अंतर का विश्लेषण करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है. यहाँ प्रस्तुत परिणामों आसानी से हैरान बी एस उपभेदों (ईएएस), बैंग बेहोश (बीएसएस), और तकनीकी पीटा (TKO) शामिल है. ईएएस ठिकाना phosphatidyl ethanolamine संश्लेषण 15 में शामिल एक ethanolamine kinase encodes और TKO लोकस एक mitochondrial riboprotein 16 encodes. बीएसएस उत्परिवर्तन लकवाग्रस्त (पैरा) वोल्टेज gated सोडियम चैनल 17 का एक एलील है. इस अध्ययन में इस्तेमाल alleles ईएएस 1, बीएसएस 1, और TKO 25T थे.
SLA को मापने के लिए विधि की प्रभावकारिता का एक उदाहरण एक की तुलना में एक ईएएस जब्ती के प्रति संवेदनशील नियंत्रण मक्खी के पथ की लंबाई को दर्शाया गया है जो चित्रा 1, में देखा जा सकता हैकि दवा मेटफार्मिन खिलाया गया है. मेटफोर्मिन प्रकार द्वितीय मधुमेह के इलाज के लिए इस्तेमाल किया एक biguanide है. दवा AMPK की upregulation के माध्यम से, स्तनधारी कोशिकाओं 18 में ग्लाइकोलाइसिस और ग्लूकोज तेज में वृद्धि हो सके, जो mitochondrial श्वसन श्रृंखला जटिल मैं रोकता. पिछले अध्ययनों मेटफार्मिन 19. चित्रा 2 बी एस म्यूटेंट ईएएस खिलाने और दो दिन (भोजन के 25 मिलीग्राम / छ) के लिए मेटफार्मिन TKO SLA पथ की लंबाई कम कर देता है यह दर्शाता है कि रास्ते संभवतः एरोबिक चयापचय के निषेध के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, ग्लाइकोलाइटिक जीन upregulates ने पाया है कि .
पथ की लंबाई कम करने के अलावा, इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा SLA वेग और SLA अवधि में अंतर का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, डेटा SLA वेग (चित्रा 4) काफी बदल नहीं किया गया था, जबकि SLA अवधि काफी (चित्रा 3) कम हो गया था कि संकेत मिलता है.
ऊपर वर्णित परख भी समय का एक निर्धारित अवधि में हरकत मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 5 एक जंगली प्रकार कैंटन विशेष द्वारा तय एक पथ का एक उदाहरण दिखाता आंकड़ा (सीएस) के लिए उड़ान भरने और एक बीएसएस द्वारा तय एक पथ अवधि के ऊपर उड़ने 15 मिनट. दोनों मक्खियों के आंदोलन परिपत्र क्षेत्र के किनारों पर ध्यान केंद्रित किया गया था, सीएस मक्खी 15 मिनट रिकॉर्डिंग अवधि में और अधिक हरकत का प्रदर्शन किया. परख इसलिए आंदोलन की राशि और मक्खियों के आंदोलन की तर्ज दोनों देखने में उपयोगी है.
बीएसएस मक्खियों द्वारा तय की औसत दूरी 6 चित्रा से संकेत के रूप में सीएस मक्खियों की तुलना में काफी कम था. बीएसएस मक्खियों वे एक धीमी वेग के साथ स्थानांतरित करने के लिए जाती थी, कम आंदोलन को प्रदर्शित किया ही नहीं. दो व्यक्ति मक्खियों के आंदोलन का वेग में परिवर्तन 7 चित्र में चित्रित कर रहे हैं. इस डेटा का उपयोग करना, एक औसत वेग एफ में के रूप में गणना और तुलना की जा सकती SLA के लिए igure 4. 7 चित्र में दिखाया प्रतिनिधि मक्खियों के आधार पर यह बीएसएस मक्खियों चित्रा में प्रतिनिधित्व अवधि के दौरान निष्क्रियता के अधिक मुकाबलों था जबकि सीएस मक्खियों तेजी से आंदोलन की अधिक लगातार bouts था कि स्पष्ट है.
चित्रा 1. ईएएस म्यूटेंट और ईएएस म्यूटेंट में SLA के प्रतिनिधि रास्तों मेटफार्मिन खिलाया. व्यक्तिगत मक्खियों SLA प्रेरित करने के लिए यंत्रवत् हैरान थे. एक ईएएस उत्परिवर्ती खिलाया मेटफार्मिन के एक ईएएस उत्परिवर्ती की SLA के दौरान एक व्यक्ति की मक्खी की राह चित्रा में प्रतिनिधित्व किया है. ए) पथ. बी) पथ. (बार 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है).
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चित्रा 2. व्यक्तिगत मक्खियों SLA प्रेरित करने के लिए यंत्रवत् हैरान थे. मक्खी SLA के दौरान ले जाया दूरी SLA तीव्रता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था. जांच की दोनों बीएस म्यूटेंट में, मेटफार्मिन काफी ले जाया दूरी कम कर दिया. डेटा मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था (* पी <0.05; *** पी <0.001, n = 15).
चित्रा 3. व्यक्तिगत मक्खियों SLA प्रेरित करने के लिए यंत्रवत् हैरान थे. मक्खी SLA SLA तीव्रता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था के दौर से गुजर समय बिताया. जांच की दोनों बीएस म्यूटेंट में, मेटफार्मिन काफी SLA अवधि कम कर दिया. डेटा मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था (* पी <0.05; *** पी <0.001, n = 15).
चित्रा 4. व्यक्तिगत मक्खियों SLA प्रेरित करने के लिए यंत्रवत् हैरान थे. SLA का डटकर दौरान उड़ान का औसत वेग SLA तीव्रता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था. मेटफार्मिन खिलाया जब परीक्षण किया दो बी एस म्यूटेंट के लिए औसत वेग में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं आया था. डेटा मान व्हिटनी यू परीक्षण (एन = 15) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया था.
चित्रा 5. क्षेत्र में व्यक्तिगत मक्खियों के पथ. निशान व्यक्ति मक्खियों 15 मिनट की निगरानी अवधि के दौरान इस क्षेत्र में तय रास्तों का प्रतिनिधित्व करते हैं. ए) एक सक्रिय सीएस के पथ मो के साथ उड़vement परिपत्र अखाड़ा एक ठेठ बीएसएस मक्खी की. बी) पथ की परिधि के आसपास केंद्रित. आंदोलन अभी भी परिधि के आसपास केंद्रित है, लेकिन सीएस मक्खियों की तुलना में बहुत कम आंदोलन किया गया था. (बार 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है)
चित्रा 6. एक उपन्यास वातावरण के संपर्क में जब हरकत उड़ना. व्यक्तिगत मक्खियों एक 5 सेमी व्यास अखाड़ा (ऊंचाई में 5 मिमी) और आंदोलन में रखा गया 15 मिनट के लिए नजर रखी थी. पथ लंबाई प्रत्येक मक्खी के लिए गणना की गई और औसत लंबाई प्रत्येक जीनोटाइप के लिए ले जाया गया. बीएसएस म्यूटेंट सीएस मक्खियों की तुलना में पथ की लंबाई में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया. डेटा मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था (** पी <0.01, n = 10).
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Discussion
ड्रोसोफिला में हरकत या आंदोलन पैटर्न की जांच करते हैं, तो यह दूरी की यात्रा के बारे में जानकारी, आंदोलन का वेग और आंदोलन के पैटर्न को निकालने के लिए सक्षम होने के लिए उपयोगी है. इस जानकारी को निकालने के लिए आदेश में, महंगे उपकरण परंपरागत रूप से अक्सर संयम 4,8,9 ऐसे assays का उपयोग करना चाहते हैं कि छोटे प्रयोगशालाओं या प्रयोगशालाओं के लिए निषेधात्मक है कि नियोजित किया गया है.
यहाँ वर्णित परख दूरी (आंकड़े 2 और 6) आंदोलन का वेग कूच निर्धारित किया (आंकड़े 4 और 7) किया जा सकता है कम से कम दो सौ डॉलर की लागत कि आंदोलन (आंकड़े 1 और 5) का उपयोग उपकरणों की और पैटर्न . हम विकसित किया है एक्सेल दृश्य मूल कार्यक्रम का उपयोग करना, X की श्रृंखला, वाई ImageJ कार्यक्रम यह सब जानकारी निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता द्वारा उत्पन्न निर्देशांक. इस प्रणाली हैजब्ती के प्रति संवेदनशील ड्रोसोफिला बी एस म्यूटेंट 1 में SLA के दोनों आनुवंशिक और औषधीय दमन की पहचान करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया.
प्रणाली में बहुमूल्य जानकारी निकाल सकते हैं, हम केवल एक बार में एक मक्खी का विश्लेषण किया है. यह अत्यधिक समानांतर वाणिज्यिक विकल्पों 4 की तुलना में एक महत्वपूर्ण कमी हो सकती है. Multitracker प्लग में ImageJ के लिए एक साथ कई वस्तुओं को ट्रैक करने की क्षमता है लेकिन हम इस विकल्प की कोशिश नहीं की. इस हरकत परख के लिए, एक मक्खी को एक प्लास्टिक पेट्री डिश ढक्कन के तहत रखा गया है. कैमरे की स्थिति पर निर्भर करता है, एक समानांतर रिकॉर्डिंग करने के लिए कई पेट्री डिश फिल्म सकता है. दोष यह है कि वेब कैमरा एक बड़े क्षेत्र में लेने के लिए तैनात है के रूप में संकल्प में कमी होगी है. यह ज्ञात नहीं है रिकॉर्डिंग की अखंडता को प्रभावित करता है, लेकिन एक समानांतर रिकॉर्डिंग का पीछा करना चाहते थे एक उच्च अंत कैमरा एक विकल्प होगा कैसे.
रिकॉर्डिंग डीयहाँ 15 मिनट तक ही सीमित हैं, लेकिन यह एक ImageJ के 64 बिट संस्करण को रोजगार अगर लंबे समय तक रिकॉर्डिंग करने के लिए संभव है. 32 बिट संस्करण एक विश्लेषण कर सकते हैं फ़ाइलों के आकार को सीमित करता है जो एक स्मृति सीमा होती है. अब रिकॉर्डिंग के लिए, यह ImageJ के 64 बिट संस्करण का उपयोग करने के लिए आवश्यक है.
इस विधि के बारे में सबसे बड़े मुद्दों में से एक ImageJ सॉफ्टवेयर में यह प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न डेटा से शोर को दूर करने की जरूरत है. इसी तरह शोर मुद्दों अन्य रिकॉर्डिंग विकल्प 3,5,6,8 के साथ हल किया जाना चाहिए लेकिन, जैसा कि इस इस विधि के लिए अद्वितीय नहीं है. तरीकों में चर्चा की ImageJ के माध्यम से संसाधित जब कार्यक्रम वस्तु के केंद्र से आंदोलन उपायों की वजह से, एक स्थिर मक्खी के कारण प्रकाश में उतार चढ़ाव को भी एक स्थिर वस्तु में भिन्न है और आसन उड़ सकता है, जो आंदोलन की मामूली मात्रा में प्रदर्शित कर सकते हैं.
हमारे दृश्य बेसिक एक्सेल कार्यक्रम आंदोलन के लिए एक सीमा निर्धारित करने के लिए एक स्लाइडिंग खिड़की विश्लेषण का उपयोग करता है. इस thresholडी परख के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. जब्ती विश्लेषण के लिए, स्लाइडिंग खिड़की वास्तविक समय की 1 सेकंड तक फैला है जो दस रिकॉर्डिंग बिंदुओं को देखता है. मक्खी इस समय के दौरान 0.5 सेमी या उससे अधिक ले जाया गया है, तो यह सक्रिय रूप से अधिकार माना जाता है. यह कम है, तो यह आराम से कम माना जाता है. सामान्य आंदोलन को देख, एक कम सीमा काट निर्धारित करने की जरूरत है और यह परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से प्राप्त किया जा करने के लिए है. 0.1 सेमी / सेक की एक सीमा है कि इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए सबसे अच्छा तरीका यह समय की एक संक्षिप्त अवधि के लिए स्थिर है, जबकि एक मक्खी रिकॉर्ड और फिर यह रिकॉर्डिंग के दौरान कोई आंदोलन को इंगित करता है, ताकि कटऑफ समायोजित करने के लिए है.
संक्षेप में, यह कम लागत वाली विधि मक्खी हरकत के विभिन्न मापदंडों के बारे में सार्थक जानकारी निकालने के लिए एक व्यवहार्य परख का प्रतिनिधित्व करता है. यह एक, व्यवहार आनुवंशिक या औषधीय हेरफेर हरकत या जब्ती संवेदनशीलता पर एक प्रभाव है अगर पहचान करने के लिए उपयोग करने के लिए एक आदर्श स्क्रीनिंग तकनीक है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
लेखकों को भी ठीक ट्यूनिंग अपने काम में इस परख के लिए क्रिस बर्नर, स्टीफन McKinney, लौरा टोबिन, जेनी Gilbreath, एशले Olley, मेगन Hoffer, और मेगन हाइड करने के लिए धन्यवाद व्यक्त करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
- Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
- Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
- Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
- Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
- Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
- Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
- Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
- Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
- Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
- Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
- Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).
