Introduction
L'application d'un courant électrique à une cellule provoque la formation de pores de la membrane de la cellule, par un processus appelé électroporation. Les pores permettent le passage d'une variété de molécules à travers la membrane nonpermeant. Le champ électrique peut être commandée avec précision, de sorte que les pores formés sont très petites et se referment rapidement, avec un minimum de perturbation de la physiologie cellulaire. Fait intéressant, les cellules adhérentes sont cultivées sur une lamelle de verre revêtue d'oxyde d'indium-étain conductrice et transparente (ITO) et une électroporation in situ, qui se trouve sur la surface, où elles poussent, sans se détacher à une électroporation en suspension. Les cellules peuvent se développer très bien sur cette surface, et comme ils sont attachés et étendus, l'observation microscopique détaillée est possible. En utilisant cette technique, de petites molécules peuvent être introduites nonpermeant directement et essentiellement en 100% des cellules, ce qui rend cette technique particulièrement appropriée pour des études sur l'activation de la components une voie de stimulation suivantes ligand d'un récepteur (revue dans 1).
L'électroporation a été utilisé principalement pour l'introduction d'ADN (également appelé électrotransfection). Cependant, l'électroporation in situ peut être utile pour l'introduction d'une grande variété de molécules, telles que des peptides, des oligonucléotides 2-4, tels que l'ARN antisens, des oligonucleotides double brin de l'ADN leurre pour inhiber la liaison du facteur de transcription, ou siRNA 3,5, 6, 7-10 nucléotides radioactifs, des protéines 11 12 ou pro-médicaments 13. Après l'électroporation, les cellules peuvent être lysées par des analyses biochimiques ou fixées et colorées avec des anticorps.
Le revêtement d'ITO conductrice est très mince, 800-1,000Å, de sorte que la croissance de la cellule n'est pas perturbée par la différence de hauteur des deux surfaces, comme les cellules se développent à travers le bord de la couche conductrice. Ceci offre l'avantage que le non-electropfilmée cellules peuvent être cultivées à côté de ceux électroporation, pour servir de témoins. La même approche peut être utilisée pour l'examen des jonctions lacunaires, la communication intercellulaire (GJIC), comme décrit dans la vidéo.
Les jonctions lacunaires sont des canaux reliant les intérieurs des cellules adjacentes 14. Gap jonction, la communication intercellulaire joue un rôle important dans la formation des tumeurs et des métastases, alors que les oncogènes Src telles que supprimer GJIC 15,16. Pour examiner GJIC un colorant fluorescent tel que le jaune Lucifer (LY) est souvent introduit dans des cellules en culture à travers la micro-injection ou gratter de chargement 17 et de la diffusion du colorant dans les cellules voisines est observée au microscope sous éclairage fluorescent. Ces techniques mais provoquent invariablement des dommages cellulaires. Nous décrivons maintenant une technique dans laquelle les cellules sont cultivées sur une lamelle de verre, qui est partiellement revêtue d'ITO 18. Une impulsion électrique est appliquée en présence de LY (ou d'autres colorants) cal'aide de sa pénétration dans les cellules en croissance sur la partie conductrice de la glissière, tandis que la migration de colorant aux cellules adjacentes, non électroporation a été observée au microscope par l'illumination de fluorescence. Pour éviter que les cellules sensibles perturbateurs peuvent avoir tendance à se détacher de la monocouche, un ensemble a été conçu qui ne nécessite pas une électrode à être placé au-dessus des cellules pour appliquer le courant électrique 19. Cette méthode offre la possibilité de quantifier GJIC dans un grand nombre de cellules, sans aucune perturbation détectable pour le métabolisme cellulaire, comme indiqué par l'absence d'un effet sur la durée de la phase G1 suite à une stimulation de sérum 12, l'augmentation des niveaux de la fos protéine oncogène (Raptis, non publié) ou deux kinases associées au stress cellulaire, le porc de p38 ou JNK / SAPK kinase 1. Cette approche rendue possible l'examen du lien entre les niveaux d'expression oncogène, la transformation et GJIC 18, ainsi que l'effet de la Src et Stat3 sur GJIC dans une variété de types de cellules, y compris des cellules fraîchement cultivées à partir d'échantillons de tumeur du poumon de 20 à 23. En outre, dans l'électroporation in situ avec la configuration décrite qui manque une électrode supérieure a été utilisé avec succès pour la démonstration de l'écart jonction lors de la différenciation adipocytaire fermeture, bien que la fixation cellulaire au substrat est réduite à ce stade 19,24.
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Protocol
1 Placage des cellules dans la électroporation Chambers
- Dans une hotte à flux laminaire, trypsiniser les cellules en utilisant une technique stérile, comme d'habitude.
NOTE: Il est très important d'éliminer par centrifugation toutes les traces de la trypsine, car ils peuvent entraver la propagation des cellules sur la vitre, d'où la formation d'adhérentes et les jonctions communicantes. - Introduire à la pipette 1 ml de la suspension de cellules dans des chambres d'électroporation stérile fourni avec l'électroporation in situ (Figure 1), et les placer dans un 37 o C, incubateur à CO 2.
NOTE: L'adhésion cellulaire peut être améliorée par placage sur de la fibronectine, le collagène, la poly-lysine ou de la cellule et du tissu adhésif (voir le tableau des matériaux). - Lorsque les cellules ont formé une couche confluente ils sont prêts pour l'examen de GJIC.
2. procédure électroporation
L'électroporation pour examen GJIC peut être effectuée en dehors d'une hotte à flux laminaire,car il ne prend que quelques minutes. Si des temps d'incubation plus longs sont nécessaires pour une expérience spécifique, il peut être réalisé entièrement dans une hotte à flux laminaire. Dans tous les cas, les chambres dans lesquelles les cellules sont cultivées doivent être stériles.
- Préparer une / ml solution jaune Lucifer 5 mg: Dissoudre 10 mg de poudre LY (fourni avec le électroporation) dans 2 ml de milieu de croissance exempt de calcium. Pour les expériences qui nécessite de plus longues durées d'incubation, filtre stériliser la solution et conserver à 4 o C.
- Aspirer le milieu de croissance et laver les cellules avec du milieu sans calcium, en faisant attention à ne pas rayer la monocouche ou sécher les cellules. Si les cellules sont séchées, ils ont généralement des noyaux sombres et ramasser LY sans électroporation. L'effet est plus prononcé dans le milieu de la diapositive qui est plus exposé aux courants d'air (figure 4F).
- Avec une pipette Eppendorf, pipeter la solution de colorant sur les cellules (400 ul pour l'ensemble de chambre), au niveau du bord de la chambre, being attention à ne pas toucher la couche de cellules.
- Placer la chambre dans le support fourni avec le électroporateur et appliquer une impulsion de la force appropriée (voir Discussion).
- Aspirer délicatement une partie de la solution LY. Il peut être réutilisé une deuxième fois pour des expériences moins importants.
- Ajouter DMEM sans calcium contenant 10% de sérum dialyse.
- Incuber les cellules pendant 3-5 minutes dans l'incubateur pour permettre le transfert de colorant à travers des jonctions communicantes.
NOTE: L'inclusion de sérum dialyse à ce stade permet la fermeture des pores. - Laver le colorant non constituée en société DMEM sans calcium pour l'observation de cellules vivantes. En variante, les cellules peuvent être fixées à ce stade, par l'addition de formaldehyde à 4% à la source, puis lavées avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate). Dans tous les cas, le lavage doit supprimer tous fond.
NOTE: Dans des expériences préliminaires afin de déterminer les conditions optimales, si la tension est trop faible, il est possible de laisser les cellules récupèrent dans le incubator pendant quelques minutes et l'électroporation de la même lame d'une deuxième fois, à enregistrer dans le coût de diapositives.
3. examen microscopique
- Observer les cellules sous illumination par fluorescence en utilisant un microscope inversé équipé d'un filtre approprié pour la teinture utilisé. Pour jaune Lucifer, l'excitation est 423nm, émission 555 nm, filtre VTC pour un microscope Nikon IX70.
- Éliminer les effets du ménisque en plaçant une lamelle couvre-objet en verre sur le dessus de la matière plastique et, après l'avoir rempli de liquide avec la partie supérieure, afin d'examiner la morphologie cellulaire en contraste de phase. Pour de meilleures images, le puits peut être détachée de la lame, et la lamelle couvre-objet placé sur le châssis. Pour les cellules fixées, le puits peut être rempli avec du glycérol pour l'observation au microscope, tandis que pour des cellules vivantes, il doit être rempli avec un milieu de croissance.
NOTE: Le lavage et la photographie est plus facile si les cellules sont fixées avec du formaldéhyde après le transfert du colorant (étape 2.7 ci-dessus). Si les cellules ne sont pas d't fixée, la fluorescence est éliminé des cellules à l'intérieur d'environ 60 minutes en fonction du type de cellule, la tension et la quantité de LY introduit alors dans les cellules fixes fluorescence est conservée pendant plusieurs heures. Cependant, la fluorescence se fane ou se dissipe après O / N incubation, même dans les cellules fixes. Pour cette raison, il faut prendre des images, peu de temps après l'électroporation (figure 2).
4 La quantification de la communication intercellulaire
- Photographier les cellules avec un objectif 20x sous fluorescence et contraste de phase (figure 3).
- Identifier et marquer d'une étoile les cellules par électroporation à la frontière avec la zone non-électroporation (Figure 2, flèche, bord d'électroporation).
- Identifier et marquer avec un point cellules fluorescentes sur le côté non-électroporation, où le colorant a transféré par les jonctions communicantes (figures 3A et 3B).
- Diviser le nombre total decellules fluorescentes sur la zone non-électroporation par le nombre de cellules électroporées le long du bord (figures 3A et 3B).
REMARQUE: Le transfert d'au moins 200 cellules par électroporation frontières contiguës est calculé pour chaque expérience. Le nombre obtenu est la valeur GJIC.
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Representative Results
La figure 2 montre foie de rat cellules épithéliales de T51B électroporation avec 22, LY et photographiées sous fluorescence (panneau A et B) ou à contraste de phase (C), ci-après la fixation d'éclairage et de lavage. Dans le panneau A, le bord de la zone électroporation est marqué en rouge. Le gradient de fluorescence à la droite de la ligne rouge indique transfert à travers les jonctions communicantes. Dans la figure 3A et 3B, la quantification de la communication jonctions lacunaires s'affiche: Les cellules à la limite de la zone électroporation ont été identifiés et marqués d'une étoile, tandis que les cellules où le colorant a transférés ont été marquées par un point. Le rapport indique le nombre moyen de cellules que dans le colorant transféré, par cellule de bordure électroporation. Dans cet exemple, il ya 57 points et 10 étoiles, c'est à dire, GJIC = 5,7.
En C et D, le transducteur de signal et activateur de la transcription 3 (STAT3) a été régulée à la baisse dans les cellules T T51Bvec expression de siRNA stable avec un vecteur lentiviral, ce qui provoque une réduction de la GJIC, comme illustré par la absense de transfert 22.
Figure 1 de l'électrode d'électroporation et montage de diapositives. (A) Vue d'en haut: Les cellules sont cultivées sur une lame de verre, recouvert d'oxyde d'indium-étain conducteur et transparent (ITO). Une chambre en matière plastique est collée sur la lame, pour former un récipient pour les cellules et LY. Le revêtement est gravé au laser en ligne droite dans le milieu, essentiellement la formation de deux électrodes. Un barrage est utilisé pour détourner les courants vers le haut, créant ainsi une forte transition de l'intensité du champ électrique. Pour obtenir des zones non-conductrices, l'ITO est également gravée en deux rectangles. Courants (flèches rouges) du générateur d'impulsions flux de chaque point à l'autre de contact, via une route conducteur entre les rectangles, la diffusion d'une manière directeion parallèle à la barrière intermédiaire, puis au-dessus du barrage par l'intermédiaire de l'autre côté, les cellules par électroporation dans des zones parallèles à la digue. Pour plus de clarté, la partie avant de la chambre est retiré (B) Vue de côté.: La diapositive avec les cellules en croissance sur l'ITO revêtue (vert clair) et les régions en verre gravé, nus sont présentés. Lorsque le milieu d'électroporation contenant LY est ajouté à la chambre à un niveau supérieur à la hauteur du barrage alors un chemin d'accès électrique entre les électrodes (+) et (-), et les cellules qui se développent dans ce domaine, est formé. On notera que la couche d'ITO est représenté avec une épaisseur exagérée par souci de clarté, bien que son épaisseur réelle (800 A) est bien inférieure à l'épaisseur des cellules (C). L'aire de cellules électroporées électroporées et non est présentée agrandie. Le colorant est dense près du barrage où toutes les cellules à une électroporation et s'estompe sur le bord électroporation que la concentration affaiblit par plusieurs jonctions gap transfteurs. Les grandes flèches indiquent le sens de transfert de colorant à travers des jonctions communicantes. Notez que la taille et l'épaisseur des cellules sont exagérées pour plus de clarté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: L'électroporation de T51B, les cellules épithéliales de foie de rat. LY a été introduit par électroporation dans T51B cellules de foie de rat épithéliales (doux, 12 volts). Après 5 min. incubation, les cellules ont été photographiées sous fluorescence (A, B) ou à contraste de phase (C) l'illumination. Notez le transfert étendu à travers des jonctions communicantes, représentée par le gradient de la fluorescence, qui s'étend depuis le bord de la zone électroporation (flèches, ligne rouge en A). Dans le même temps, il n'y a pas de dommages visibles aux cellules, un s vu sous contraste de phase (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 quantification de transfert écart de jonction. Les cellules à la limite de la zone électroporation qui a repris LY par électroporation (bailleurs de fonds de LY aux cellules non-électroporation) ont été marqués d'une étoile. Cellules où LY transféré dans des jonctions communicantes à travers ont été marquées par un point. Dans (A) et (B), il ya 57 points et 10 étoiles, c'est à dire, GJIC = 5,7. Les cellules de (C) et (D) n'ont pas les jonctions communicantes, comme indiqué par l'absence d'un gradient de fluorescence. Les flèches indiquent la limite de la zone électroporation. Bar = 100 um.es / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 cellules (A) de T51B qui ont été endommagés par grattage lors de la manipulation. Ces cellules peuvent ramasser LY même sans électroporation et peuvent transmettre à leurs voisins par des jonctions communicantes. (B) et (C) Les cellules endommagées par une impulsion qui est trop fort. (B) T51B foie de rat cellules épithéliales électroporation à réglage doux , 20 volts. Les cellules sur la gauche de la ligne gravée (flèche) ont été endommagés par l'électroporation. Dans ce cas, les cellules ne se détachent pas, mais un examen attentif de la photo à contraste de phase (panneau du milieu, flèche blanche) montre que les cellules ont des noyaux sombres, alors qu'ils émettent une fluorescence très faiblement, voire pas du tout (panneau supérieur). Néanmoins, le transfert ejonctions gap rugueuses est évident, pour les cellules sur le côté droit qui ne sont pas soumis à une électroporation. La photographie du bas a été préparée en combinant et UV illumination contraste de phase, afin de faciliter la visualisation de l'arête de l'électroporation. Cellules épithéliales du foie (C) chez le rat T51B électroporation est moyen, de 30 volts. Les cellules sur la gauche de la ligne gravée ont été gravement endommagés par l'impulsion. Notez comment les cellules se sont détachés et ne pas émettre de la fluorescence. Certains survivants autour du bord ont ramassé LY et semblent être de le transmettre à leurs voisins du droit par les jonctions communicantes. Cellules (D) de T51B électroporation avec 10 pg / ml d'iodure de propidium. Notez la coloration intense des noyaux. (E) Dômes de cellules épithéliales. Cellules T51B électroporation à réglage doux, 15 Volts. Notez la même électroporation des cellules à gauche. Toutefois, lorsque confluentes, les cellules T51B former des dômes qui risquent de se détacher pendant la manipulation et le lavage, et les cellules environnantes mai take jusqu'à LY. Notez le vaste transfert de colorant. (F) Les cellules qui ont séché peut ramasser LY sans moyen electroporation.The de croissance a été retiré des cellules et des cellules T51B ont été laissés dans une hotte à flux laminaire pendant 30 min. LY a ensuite ajouté aux cellules pendant 1 min et les cellules ont ensuite été fixé, lavé et photographié sous fluorescence (en haut) ou à contraste de phase (panneau du bas) illumination. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 Le blocage de peptide Grb2-SH2 inhibe l'activation médiée par Erk EGF dans les cellules intactes, vivant. Combinaison d'études GJIC et de transduction du signal. Après la liaison du ligand, un certain nombre de récepteurs de facteurs de croissance tels que le facteur de croissance épidermique Receptor (EGFR) sont trans-phosphorylée sur des résidus tyrosine spécifiques. Ceux-ci constituent des sites d'accueil pour les Src homologie 2 domaines de transducteurs de signaux tels que Grb2, qui est lié aux sos des facteurs d'échange GTP / PIB, qui est ainsi amené à la membrane et active Ras. Cela se traduit par l'activation de la cascade de Raf / Mek / Erk et la phosphorylation de Erk à une séquence P Y P TE. Par conséquent, le sondage avec des anticorps phospho-ERK spécifiques peut être une mesure de l'activation du récepteur de l'EGF. Après fixation, les cellules sont sondés avec un anticorps anti-pERK (Cell Signalling), suivi par un anticorps secondaire couplé à de la biotine, de la streptavidine-peroxydase de radis de cheval et le substrat diaminobenzidine, ce qui donne une couleur marron 29. Dans cette expérience, un phosphopeptide bloquant le domaine Grb2-SH2 (PVPE Y INQS p) a été introduit par électroporation in situ icellules NIH 3T3 nto croissance dans des chambres d'électroporation et la croissance arrêtés en milieu usé. 5 min après l'application de l'impulsion, les cellules ont été stimulées avec de l'EGF pendant 5 minutes, fixes, sondés pour activer phospho-ERK1 / 2 par les cellules stainingand immunoperoxydase du même champ photographié sous fond clair (en haut) ou à contraste de phase (en bas) d'éclairage. Notez que le peptide bloquant la protéine Grb2 SH2 considérablement réduit le signal du FEM, à savoir, la phosphorylation de ERK (zone a). L'inhibition du signal s'étend dans ~ 3-4 rangées de cellules adjacentes dans la zone non-électroporation (ondulée support), probablement en raison du mouvement de la 1123 Da peptides grâce à des jonctions communicantes. Cette découverte constitue une preuve convaincante que l'inhibition observé doit être dû au peptide, plutôt que d'un artefact de l'électroporation, les cellules étant donné que dans ce domaine n'ont pas reçu de courant, mais le peptide à partir de l'acquisition de leurs voisins. Dans le même temps, il n'y a pas d'effet détectable sur la morphologie cellulaire commereprésenté par contraste de phase. La flèche pointe vers le bord de la zone électroporation. Agrandissement: 240x. Pour plus de détails et des contrôles, voir la référence 29. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les étapes critiques dans le protocole
Matériau électroporation
La pureté de la matière à une électroporation est très important. Si les cellules sont très plates, des concentrations plus élevées alors du colorant de suivi doivent être utilisés (jusqu'à 20 mg / ml pour LY) et dans de tels cas, la pureté est encore plus important que dans les cellules avec une forme plus sphérique 1. Outre LY une grande variété d'autres colorants ou des molécules nonpermeant ont été employés, par exemple une série de colorants Alexa à utiliser comme sondes pour différents canaux comprenant des connexines 25. Cependant, les colorants tels que le bromure d'éthidium ou l'iodure de propidium sont intercalées dans l'ADN de sorte que les noyaux fluorescence très fortement, ce qui rend la quantification du transfert de colorant plus difficile (figure 4D). Les colorants de suivi doivent être préparés et lavages effectués dans un milieu de croissance sans calcium, car un afflux de calcium peut interrompre la communication de jonction, ainsi que de réduire cell viabilité. Toutes les solutions doivent être conservées à 37 ° C avant l'électroporation, ce qui facilite la fermeture des pores et une viabilité.
Détermination de la tension et de la capacité optimale
L'intensité du champ électrique est un paramètre critique pour la pénétration des cellules, ainsi que la viabilité. L'application d'impulsions multiples a été montré pour offrir de meilleurs résultats en termes de permeation et la viabilité des cellules d'une seule impulsion. L'appareil Insitu Porator des projets cellulaires dispose de trois réglages pour la capacité et le nombre d'impulsions: Doux (10 impulsions, 10 ms d'intervalle, 0,1 sec entre les impulsions), moyennes (20 impulsions, 80 ms d'intervalle, 0,2 sec entre les impulsions) et forte (50 impulsions , 120 ms d'intervalle, de 0,5 s entre les impulsions), tandis que la tension peut être réglée avec précision de manière indépendante (2-45V). En fait, les cellules plates nécessitent des tensions plus faibles que celles transformées, les cellules dans un bouquet ou des cellules avec une petite zone d'adhérence au substrat (par exemple, les cellules d'insectes Sf9), Peut-être en raison des grandes quantités de courant traversant une cellule étendue qui est en contact avec une surface conductrice plus grande. Pour de plus amples détails à ce sujet, s'il vous plaît voir 1.
Les problèmes potentiels et dépannage
Si les cellules ont été grattées pendant les manipulations, ils peuvent prendre le colorant fluorescent et sans électroporation (figure 4A). La quantité d'énergie délivrée aux cellules affecte l'efficacité de l'électroporation. Si l'impulsion est trop faible (c'est à dire, trop faible tension et les paramètres d'impulsion), puis les cellules normales sous contraste de phase, mais ils ne sont pas fluorescentes, sauf peut-être pour certaines cellules qui peuvent être morts ou ont été grattées pendant la manipulation (figure 4A) . Si l'impulsion est trop fort, sous les cellules de contraste de phase semblent avoir noyaux très sombres (figure 4B), mais il peut conserver une certaine LY, et même permettre à certains transfert de colorant aux cellules voisines. À la veillen impulsions plus élevées, les cellules sont détruites (Figure 4C). De telles cellules sont lysées, par conséquent, ils ne retiennent pas LY et une fluorescence très faiblement, voire pas du tout. Certaines lignées de cellules épithéliales telles que T51B structures forme de dôme qui risquent de se détacher lors des changements moyennes. Les cellules environnantes peuvent alors fluorescence que le colorant peut être transférée à travers les jonctions communicantes (figure 4E). Des exemples de conditions d'électroporation optimaux pour les lignes représentatives sont présentées dans le tableau 1.
Avantages par rapport à d'autres techniques et signification
L'introduction de l'ADN
Il existe un grand nombre de protocoles de transfection, tels que le phosphate de calcium, co-précipitation ou 26 différents types de liposomes. Cependant, ils peuvent affecter la cellule de façon subtile qui peuvent être très important, en particulier pour les études de transduction du signal. Par exemple, la phosphorylation Tyr-705 du transducteur de signal et activateur de la transcriptionion-3 (Stat3) qui est en corrélation avec l'activité de transcription est considérablement augmenté par la procédure de transfection au phosphate de calcium, même en l'absence d'ADN. Cela pourrait être dû au fait que la cellule modifie précipité à l'adhésion cellulaire et l'engagement de la cadhérine, un activateur connu 27 Stat3. Certains liposomes ont eu un effet similaire mais moins prononcée, tandis que l'électroporation ou infection rétrovirale n'a pas affecté les niveaux Stat3 6.
L'introduction de peptides
Une méthode courante est la construction d'un peptide de fusion avec des séquences qui traversent la membrane cellulaire, tels que le gène dérivé de HIV-tat. Toutefois, le transfert à travers la membrane est un processus relativement lent et l'inhibition du signal n'est pas aussi efficace. Pour l'étude de la séquence des événements qui se produisent suivant l'activation du récepteur par un ligand, la capacité de mise en place immédiate d'un peptide, d'un composé peptidomimétique ou une autre offre importante Advantage. L'électroporation d'un peptide de la cellule perméable afin d'accélérer son absorption n'est pas possible, probablement parce que le peptide lipophile est incorporée dans la membrane cellulaire, comme révélé par des peptides couplés au FITC (Raptis, non publié). Il est intéressant de noter que l'inhibition de l'activation de Erk par l'EGF par l'utilisation d'un peptide perméable aux cellules de blocage le domaine Grb2-SH2 par exemple, n'est que partielle 28, alors que l'électroporation de la même peptide obtenu une inhibition complète du signal 29 ( la figure 5). D'autres techniques, à base de liposomes sont également en existence. Toutefois, ils ne permettent pas l'examen de cellules non traitées côte à côte avec celles traitées, en conjonction avec des études écart de jonction, ce qui peut offrir le plus fort manifestation possible que l'inhibition du signal doit être dû à la matière en cours d'introduction (figure 5, ondulée support , c).
Études des jonctions
Microinjectionde colorants ou de gratter chargement sont couramment utilisés, mais ils introduisent toujours des dommages cellulaires. Une autre technique, la récupération de fluorescence après photoblanchiment n'est pas invasif, mais il nécessite un équipement coûteux, et peu de cellules peut être examiné à la fois, tandis que la formation de substances phototoxiques peut être un problème. Le dosage de parachute se compose de cellules de pré-chargement avec le colorant calcéine AM (vert), puis en laissant les cellules adhèrent sur une couche de cellules, comme des jonctions communicantes forment dans les 15 minutes-3 heures. Un grand nombre de cellules peut être traité de cette façon, mais la capacité des cellules à former des jonctions lacunaires dans ce dosage varie considérablement selon le type de cellule 30.
Limites
La tension requise est supérieure pour l'introduction de molécules de plus grande taille et des charges électriques. Aux hautes tensions nécessaires à la mise en place de grands plasmides, il peut y avoir une certaine mort cellulaire. Les tensions relatifs requis pour différentes moléculesont été décrits précédemment 9,12. Bien que nous décrivons l'électroporation en utilisant un appareil d'électroporation spécifique, il est possible pour une personne expérimentée avec des appareils électriques à faire à l'aide de la description détaillée de 19, ou de faire une installation simple, avec une électrode supérieure au-dessus des cellules, et une gravure avec des acides.
Orientations futures
Logiciel ont été développés pour quantifier précisément GJIC 31. Une autre amélioration est le développement de boîtes quantiques qui sont fluorescents seulement quand ils sont dans la cellule, de sorte qu'il n'y a pas besoin de laver le colorant non incorporé. Cela évite le stress de lavage, alors que le processus peut être observé dans les cellules vivantes, ne sont pas fixées en temps réel. L'introduction de peptides à interrompre les voies de signalisation est une approche puissante pour l'évaluation in vivo de la pertinence des interactions identifiées en utilisant des composants purifiés. L'examen du pottiel de différents peptides à inhiber une voie spécifique est une première étape importante dans le développement de médicaments peptidomimétiques, pour le traitement de la néoplasie rationnelle.
Autres commentaires
Les lames peuvent être lavées avec une solution Extran®-1000 à l'aide d'un petit pinceau pour atteindre la surface d'ITO dans le puits, et on les rince avec de l'eau. Si les cellules ont été fixées sur la lame, il peut être nécessaire d'éliminer les traces de protéine avec de la trypsine ou autres enzymes protéolytiques premier. Dodécylsulfate de sodium contenant des détergents doivent être évités. Diapositives lavées peuvent être stérilisés à l'peroxyde. Cependant, il est très important d'éviter de briser le sceau du bien sur la lame, car si une fuite de solution LY dans le support, il peut provoquer un court-circuit.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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