Summary

استقرار الكبدي النمط الظاهري عن طريق الأسطح الاصطناعية محسن

Published: September 26, 2014
doi:

Summary

هذه المادة سوف تركز على تطوير البوليمر المغلفة السطوح على المدى الطويل، ثقافة مستقرة من الخلايا الجذعية المستمدة خلايا الكبد البشرية.

Abstract

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

Introduction

وقد استخدمت على نطاق واسع المواد البيولوجية في صيانة وتمايز الخلايا الجذعية المحفزة 1. مع تمكين، وهذه ركائز البيولوجية غالبا ما تحتوي على عدد لا يحصى من المكونات غير محددة. Matrigel هو الركيزة تستخدم عادة لزراعة الخلايا الجذعية وتمايز. للأسف، تكوينه المتغير يؤثر وظائف الخلايا والنمط الظاهري. على الرغم من مجموعة متنوعة من المصفوفات البيولوجية البديلة، وأكثر تحديدا استخدمت 2-7، أصل حيواني أو ضعف قابلية يجعلهم مرشحين غير صالحة للتصنيع الصناعي. ولتحديد البدائل الاصطناعية، مع تكوين المعرفة والأداء الموثوق بها، هي الأهداف الرئيسية في أبحاث الخلايا الجذعية.

في محاولة للتغلب على قيود غير محددة ركائز ثقافة الخلية، وقد حددت التخصصات التعاون بين الكيمياء وعلم الأحياء المواد الاصطناعية مع القدرة على دعم النمط الظاهري الخلية. موالفةركائز ETIC هي قابلة للتطوير، فعالة من حيث التكلفة، ويمكن تصنيعها في الهياكل المعقدة 3D، ومحاكاة البيئة في الجسم الحي. بسبب هذه الخصائص ركائز الاصطناعية واستخدمت على نطاق واسع لدعم ودفع التفريق بين العديد من أنواع الخلايا 8-10.

وقد فحوصات متقدمة وعالية الإنتاجية تسهيل الفرز السريع للمواد الاصطناعية، من المكتبات الكبيرة، وتسليم مواد جديدة ذات خصائص مرنة مع تطبيقات واسعة في مجال البحوث الطبية الحيوية والتنمية 11-13. استخدام إنتاجية عالية البوليمر تكنولوجيا الفحص الصغيرة مجموعة، حددنا بسرعة البولي يوريثين بسيط (PU134)، ومناسبة لصيانة الخلايا الجذعية خلايا الكبد البشرية المشتقة. تم العثور على هذا البوليمر لتكون متفوقة على ركائز المستمدة الحيوانية فيما يتعلق التمايز الكبدية وظيفة 14-16. لقد الأمثل لاحقا عملية طلاء الظروف والتضاريس والتعقيم للوصول الآثارعلى الأداء البوليمر في تحقيق الاستقرار في وظيفة الكبدية وعمر. هذا له آثار هامة فيما يتعلق فهم أساسيات علم الأحياء الكبدية لنمذجة تستند خلية والتطبيقات الطب التجديدي.

التكنولوجيا وصفها هنا تمثل مثالا على كيفية سطح البوليمر الاصطناعية يمكن أن يكون الأمثل للحفاظ على النمط الظاهري الخلية. ونحن نعتقد أن الجمع بين هذه التكنولوجيا مع مصل فعال الكبدية المجانية بروتوكول التمايز لديه القدرة على توفير إنتاج قابلة للاستخدام من خلايا الكبد في المختبر، والنمذجة في الطب التجديدي.

Protocol

1. توليف PHNGAD (بولى [1،6-hexanodiol / neopentyl غليكول / دي (جلايكول الإثيلين) حمض الأديبيك -alt-] ديول) مخطط 1: توليف PHNAGD تمثيل تخطيطي لتركيب PHNAGD. كان من رد ال?…

Representative Results

المذيب البوليمر يؤثر على تضاريس سطح البوليمر المغلفة كان يذوب البولي يوريثين 134 في الكلوروفورم، إما وحدها أو بالاشتراك مع التولوين أو رباعي هيدرو الفوران أو ثنائي كلورو ميثان والشرائح الزجاجية المغلفة تدور مع تركيبات ?…

Discussion

تعتمد العديد من الطرق الحالية المستخدمة لتوليد خلايا الكبد من الخلايا الجذعية على المصفوفات غير محددة من أصل حيواني. يمكن لهذه ركائز يكون مكلفا ومتغير بدرجة كبيرة، مما يؤثر على وظائف الخلايا والاستقرار، وهو ما يمثل عائقا كبيرا أمام التطبيق. لذا، أجرينا شاشة للمواد ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ودعمت DCH، MB وFK قبل EPSRC اتبع على الصندوق. BL-V وDS تم دعم كل من MRC درجة الدكتوراة. وأيد KC بتمويل من منهاج الطب التجديدي المملكة المتحدة.

Materials

Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System  P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
 1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031  Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

References

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3 (3), 034112 (2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4 (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5 (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -. F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).

Play Video

Cite This Article
Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

View Video