Summary
インビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、浸潤、および高スループット能力を有する食細胞での複製にハイスループットアッセイを開発した。方法は、宿主-病原体相互作用におけるそれらの関与がためにサルモネラ遺伝子ノックアウト変異株を評価するために使用した。
Abstract
サルモネラ種は、人畜共通の病原体とヒトや家畜1における食品媒介性疾患の主要な原因である。 サルモネラ -host相互作用のメカニズムを理解することは、 サルモネラ感染症の分子病態を解明するために重要である。食細胞におけるサルモネラ関連付けを表現型にゲンタマイシン保護アッセイ、浸潤及び複製は、RAW264.7マウスマクロファージを用いて宿主相互作用におけるサルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌の欠失変異体の役割を定義するためのハイスループットスクリーニングを可能にするように適合させた。このプロトコルの下で、分散野生型および複数の変異株が同一の培養皿に、同時に試験することができるので、測定値に有意に、標準プロトコルと比較して低減される。マルチチャンネルピペットの使用は、スループットが向上し、精度を向上させる。さらに、懸念が少ない鎬使用に関連96ウェル培養皿中でウェルあたり番目の細胞が対処された。ここでは、食細胞を使用して修正インビトロサルモネラ浸潤アッセイのプロトコールに成功協会、浸潤および細胞内複製のための38の個別サルモネラ欠失変異体を表現型に採用された。 インビトロ表現型は、そのうちのいくつかは、その後、動物モデルにおいてin vivo表現型を持っていることが確認された、提示される。このように、ハイスループット能力を有するマクロファージにおける修正された、 サルモネラの関連付けを表現型に標準化されたアッセイ、浸潤および複製は細菌-宿主の相互作用を研究するために、より広く利用することができる。
Introduction
非チフス性サルモネラは、すべての脊椎動物の腸内疾患の重要な原因である。ヒトでのサルモネラ症は、トップ細菌性食品媒介疾患1つである。彼らの動物宿主でサルモネラとの相互作用を支える分子機構の特性は、主に、感染の組織培養および動物モデルでのサルモネラ菌血清型ネズミチフス菌（STM）の研究によって達成される。 STM-ホスト相互作用に洞察を得ることは、私たちはサルモネラ菌が生存し、宿主細胞の内部成長をどのように理解するのに役立ちます。これらの相互作用を研究する最初の課題は、ホストと病原体の両方から可能な限り多くの参加要因を特定することであるが、これらの努力は、主に、同時に2つの独立した複雑な生物学的システムを扱う、 すなわち 、ホストとサルモネラの重要な難しさによって妨げている 生理的条件下で。さらに、大規模なrepertサルモネラのoire、潜在的にホストの相互作用に関与する因子をコードする宿主遺伝子は、この課題に取り組むために、ハイスループットの生物学的なプラットフォームを必要とします。
サルモネラの関連付けを表現型に変更され、標準化されたアッセイは、ハイスループット能力を有するマクロファージにおける侵略と複製が可能性が高いサルモネラ -host相互作用に従事した遺伝子の大規模なセットを調べるために開発されました。ゲンタマイシン保護アッセイは、1973年2で開発されましたが、最初に徹底的に1994年3,4にElsinghorstによって記述されていた。今では、サルモネラ 5,6を含むex vivoで多くの細胞内細菌性病原体を、研究するための標準的なツールとなっています。内部化細菌は真核細胞3に浸透することはできませんゲンタマイシンのようないくつかの抗生物質、によって殺されることを避ける。この現象を利用することによって、ゲンタマイシン保護アッセイは、細胞内のBAの生存および増殖を測定するcterial病原体。感染の間の3つのイベント、 すなわち 、真核細胞浸潤及び複製との関連、感染症、ゲンタマイシン処理、およびさらなるインキュベーション（ 図1）との間の時間間隔に基づいて、細胞内細菌性病原体について評価することができる。真核細胞系は、宿主 - 病原体相互作用の研究のための適切な動物モデルよりも複雑で、生理的環境を提供する。
ゲンタマイシン保護アッセイは、STM-宿主の相互作用を研究するための適切なプラットフォームであるが、24ウェル培養皿中の標準アッセイは、ロースループット容量を有する。 インビボでのデータセットのコンピューター分析は、約300宿主遺伝子産物（未発表データ）と相互作用することが予測される149 サルモネラ遺伝子産物を同定した。標準ゲンタマイシン保護アッセイを効率的に突然変異体のこの数を表現型に能力を持っていません。
ADDITでイオン、ゲンタマイシン保護アッセイは、理論的には単一の細菌の侵入を検出することができる。異なる時間に繰り返されるときこのため、固有の感度で、生データは、技術的差異の影響を受けやすい。内部統制および正規化後の相対的なデータの提示は、結果の意味の解釈のために不可欠である。これらの考察を考慮すると、修正された、標準化されたゲンタマイシン保護アッセイは、試験能力を向上させ、精度を高めるために開発された。
以下のプロトコルを詳細かつ96ウェル培養皿及びマウスマクロファージRAW264.7細胞株を使用して変更ゲンタマイシン保護アッセイを行うことが示されている。 24ウェル培養皿中の標準プロトコルと比較して、修正されたプロトコルは、以下の利点を有する：1）96ウェル培養皿を使用すると、十分な統計的検出力を有する内部陽性対照および陰性対照を含む表現型を決定するために10の異なる変異株まで使用でき;変異体株は、同一の培養皿に、同時に試験するため、2）結果の分散が大幅に低減される。オペレータの疲労を軽減しながら3）マルチチャンネルピペットの使用は、スループットを増加させる。最後に、24ウェル培養皿に比較して、96ウェル培養皿中でウェルあたり少ない宿主細胞の懸念は、プロトコルの最適化および標準化することで解決した。
要約すると、食細胞におけるインビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、侵入および複製に変更された、標準化されたアッセイは、精度が向上し、オペレータの疲労を低減しつつ、高スループット能力を達成する。
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Protocol
1マウスマクロファージRAW264.7細胞培養
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中でT-75細胞培養フラスコ通気フィルタキャップに低い継代数マウスマクロファージ細胞を増殖、RAW264.7（ATCC®番号、TIB-71） 5％CO 2インキュベーター中、37℃で0.5％のNaHCO 3、および1％100×非必須アミノ酸（NEAA）。
- 細胞がフラスコ中の60〜80％コンフルエンスに達したら、細胞を採取し、血球計で細胞を計数し、細胞濃度を計算するために、細胞スクレーパーを使用する。
- 細胞を再懸濁し、新鮮なDMEM細胞培養培地中で2.5×10 5 / mlの細胞濃度に希釈する。 96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに5×10 4細胞を含有するDMEM細胞培養培地200μlをプレートにマルチチャンネルピ ペットを使用する。
- 各サルモネラ株の 4つのウェルをプレート。 1セットのために3つの個別のプレートをセットアップします食細胞浸潤アッセイの、それぞれ、「会合」、「侵略」と「複製」でそれらをマークします。
- マクロファージ細胞をウェルの底に付着させ、37℃ON、5％CO 2インキュベーター内でプレートを置きます。
サルモネラ野生型および変異体の作製
- マクロファージRAW264.7細胞を調製する同じ日に、野生型（WT） サルモネラ菌血清型ネズミチフス菌の14028s、DinvA変異体、DphoP変異体、および所望の試験変異株、およびルリア-ベルターニ（文化、それらを単一のコロニーを選択必要に応じて抗生物質を添加したLB）培養液。 10変異株（DinvA変異体とDphoP突然変異体は、それぞれ、浸潤および細胞内複製に欠陥がある）までテストするために食細胞浸潤アッセイの各セットを使用してください。
- 秒、37℃で14時間、細菌を育てる丸底チューブにゆるく蓋をし14ミリリットルポリプロピレンで5ミリリットルのLBブロスのそれぞれにおいて220 rpmでhaking。 LBブロスは、50μg/ mlの、私たちの場合には、変異株のほとんどが、カナマイシンに耐性を示す、適切な抗生物質が含まれています
- 次の日、220 rpmで振盪しながらさらに4時間、1:50の比率でのLBブロスの平野5ml中のサルモネラ菌株の培養物に対するサブカルチャーをそれぞれ。
- ODを分光光度計で、各細菌培養の600の値を読み、それぞれの読み取りはサルモネラ病原性島-1 III型分泌系（SPI-1 TTSS）侵略のための遺伝子発現を最適化するために、0.6から1.2の範囲であるべきである。
- 新鮮なDMEM細胞培養培地中のmlの5×10 6 CFU /の濃度に菌を希釈、その後、細菌濃度を推定するために1 OD 600 = 7.5×10 8 CFU / mLの計算式を使用してください。
96ウェル培養プレート中で3浸潤アッセイ
- 3 96ウェルセル画を削除するCO 2インキュベータからL培養プレートおよび1×PBS緩衝液200μlで一回各ウェルを洗浄する。
- 洗浄およびPBSを完全に除去した後、各ウェルに200μlの細菌DMEM培地（上記参照）を追加する。 1：これは20の感染の各ウェルと多重度が1×10 6 サルモネラ細胞 （MOI）になる。
- 10分間の密閉されたキャリアは1,000×gで遠心分離し、プレートを、その後、37℃、30分間、5％CO 2インキュベーターでプレート（時間ゼロ）を交換してください。各株については、少なくとも4つの連のウェルを設定します。
- 30分後、インキュベーターからプレートを取り外して、関連付けられていない細菌を除去するために1×PBS200μlで3回洗浄。
- 洗浄後、更なる処理のための「会合」で標識されたプレートを保存します。オーダーT内の「侵略」と「複製」でマークされたプレートの各ウェルに100μg/ mlのゲンタマイシンを含むDMEM培地200μlを追加O。外サルモネラ菌を殺す追加の時間、37℃、5％CO 2インキュベーターにプレートを返します。
- マクロファージ細胞数を記録するための各感染株から1つのウェルに保存する、10分間、1％トリトンX-100を含有する1×PBS200μlで「会合」プレート上のウェルの残りの部分を扱う。トリトン溶液は、マクロファージ細胞を溶解し、関連したサルモネラをリリースします。
- 各ウェルから収穫サルモネラおよび1.5mlのエッペンドルフチューブに入れます。各ウェルから採取したサンプルに900μL1×PBSで3 10倍連続希釈を行い、渦は、各希釈の間で実行される。
- どちらLB（WT）またはLB館（突然変異体）プレート上に第3の希釈、10 -3を 、プレート。適切なサルモネラ株名、希釈番号、時刻と日付のプレートにラベルを付けます。
- 第三の希釈チューブをボルテックスした後、寒天の表面に10μlのサンプルを分注するとfを繰り返します5滴の合計のための私達の回。 510μlをペトリ皿プレート7上に均一に落下空間にいることを確認してください。
- 滴が寒天に浸透した後、上の板を回し、37℃、5％CO 2インキュベーターで一晩インキュベートする。
- 10分間、0.25％トリプシン-EDTAを含む150μlのを1×PBSとマクロファージの計数のために保存された井戸を扱います。
- トリプシン処理後、1.5mlのエッペンドルフチューブに場所マクロファージとは、トリプシン/ EDTA溶液を中和するために、FBS50μlとそれらを扱う0.4％トリパンブルーを用いて細胞を染色し、血球計を使用してを介してそれらをスコア。
- 1時間のインキュベーションが経過すると、CO 2インキュベータからの「侵略」と「複製」のプレートを取り外してから、「ステップ3.4」として、各ウェルを洗浄する。
- 「ステップ3.6から3.12」として更なる処理のための「侵略」のプレートを保存します。
- に10μg/ mlのゲンタマイシンを含むDMEM培地200μlを追加します。培地中で細胞外サルモネラのクリアランスを維持するための「複製」のプレート。 37℃、追加の22.5時間、5％CO 2のインキュベーターにプレートを返します。
- 次の日、37℃、5％CO 2インキュベータから「複製」のプレートを取り外して、「ステップ3.4」として、各ウェルを洗い、「ステップ3.6から3.12」として扱う。
- 最後に、37℃のインキュベーター中で一晩インキュベートした後、寒天プレートを除去し、細菌コロニーの数をスコア。
- 良いコロニー分布は10〜100個のコロニーの間でなければなりません、各スポットは、約2から20個のコロニーが含まれている一つの場所に20以上のコロニーがあった場合、それが得点するのは難しいだろう。カウントが低すぎたり高すぎると、必要に応じて10倍高いまたは低い希釈でサンプルをreplate。
4。データ解析
- メッキに基づいて、各プレートのCFU（1ml当たりのコロニー形成単位）を計算するボリュームと希釈係数。
- 各株から記録されたマクロファージ細胞数を通してマクロファージあたりのサルモネラの数を確認。
- それぞれ、細胞結合、浸潤または複製のための少なくとも3つの独立した実験からのマクロファージあたりのCFUの幾何平均を計算し、相対値をWTにさらに正規化する。
- WTの各菌株を比較することで、それぞれのスチューデントのt -testによる関連、浸潤、およびレプリケーションのためのデータを分析し、p値による統計的有意性を決定する。
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Representative Results
データが変更された食細胞浸潤アッセイに基づいてプロットされた後、代表的な結果（ 図2）を参照してください。データは複製8欠陥があることが知られている5の異なる株、WT、ΔinvA、ΔphoP、変異体A、および侵入のための欠陥があることが知られている突然変異体B.ΔINVA、およびΔphoPを含む、実験的な妥当性を評価するための陽性対照として使用されている。確かに、修正された浸潤アッセイで、ΔinvA変異体は、RAW264.7細胞によって不完全に内在化され、ΔphoP変異体は、24時間後にレプリケーションを減少させた。変異体A及びBは、このプロトコルを使用してアッセイの代表的な菌株である。変異体Aは、ΔphoP変異体と同様の複製（ 図2）の有意な減少を示している。興味深いことに、変異体Bは、複製が有意に増加します（ 図2）を示す。データは明らかに、これらの牟田の両方を示す国税庁は、マクロファージに侵入し、生存のための表現型が変化している。
要約すると、多数のサルモネラ欠失変異体は、個別に修正された浸潤アッセイを使用して、RAW264.7マクロファージにおける細菌関連への関与、浸潤、および複製のために表現型された。 38テスト変異体の二十は、これまでのところ、マクロファージ（ 表1）、食細胞におけるインビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌協会、侵入および複製精度と高スループット容量ながらを増加するように改変され、アッセイの細菌感染で変数ではあるが重要な欠陥を表示オペレータの疲労を低減することができる。
ハイスループットアッセイの図1ワーキング方式。ゲンタマイシン保護アッセイがMODIあるfied、96ウェルプレートで同時に多数のサルモネラ変異体の表現型に標準化。重要なステップは、RAW264.7マクロファージ細胞内のサルモネラの関連、侵入および複製を調べるために、上記のように実行されます。
。WT、ΔinvA、ΔphoP、変異体A及び変異体B - - 図2の代表的な結果は、ハイスループットアッセイは、 サルモネラ菌株に対して実行されたRAW264.7マクロファージ細胞における。各菌株について、マクロファージ当たりのCFUの幾何平均を示しているWT及びグラフィック表現をさらに正規化され、それぞれのセルの関連付け、侵入および複製に3つの独立した実験から得られる。エラーバーは標準誤差を表し、各株の統計的有意性は、参照されるWTにスチューデントのt -testによって決定された。 *はp <0.05。 MOI = 20。
候補遺伝子の表現型を表1。候補サルモネラ変異体は、RAW264.7マクロファージ細胞における関連、侵入および複製のために変更され、標準化されたアッセイにより表現型される。 20の変異体は、協会、浸潤および/または複製に重要な欠陥を持っている。
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Discussion
ゲンタマイシン保護アッセイが広く、宿主細胞内の細胞内細菌性病原体の侵入および複製を研究するために使用され、それは、特に、その侵入感染1を確立するための前提条件のステップであるサルモネラのように、病原体を研究するための重要な生物学的ツールである。 サルモネラ研究コミュニティにおける標準ゲンタマイシン保護アッセイを24ウェル培養皿5に実装されている。 48あるいは96ウェルプレートの使用は、高スループット能力9について以前に議論されたけれども、実際のプロトコルを詳細に実証されておらず、正常な細菌の突然変異体のコレクションをテストするために使用されている。ここで、修正された標準化プロトコルは、 サルモネラ変異体を表現型に、96ウェル培養皿を使用するために開発された。注目すべきことに、このプロトコルは唯一のサルモネラと食細胞を試験した、このように改変および最適化は、明らかにパーソナルプラグインに必要であろう r個の細菌または宿主細胞。
食細胞にサルモネラ協会 、侵入および複製を表現型に変更されたゲンタマイシン保護アッセイにはいくつかの利点がある。まず、96ウェル培養皿フォーマットは、最大10の異なる株は、十分な反復統計分析および内部対照と同時に試験することができ、高スループット試験および分析を可能にする。異なる時間に繰り返されるとき第2に、アッセイの高い感度、ゲンタマイシン保護アッセイの生データは、技術的差異の影響を受けやすい。この修正されたプロトコルの下では、いくつかの株は変動を減少、プロセス全体で同一の条件で表現型されている。最後に、マルチチャンネルピペットの使用は、効率が向上し、オペレータの疲労を低減する。定量的、再現性のある大量のデータを生成しながら、新しいプロトコルは、急速な表現型の多数のサルモネラ変異体を容易にした。
ove_content "> 96ウェル培養皿に浸潤アッセイを行うことで一つの懸念は、ウェルが少ない真核細胞を含有することがあり、このため定量性が損なわれる可能性があり、この懸念に対処するために、アッセイの大一連の再現性を最適化するために行われた。まずこのプロトコルで使用されるRAW264.7マクロファージを20未満の通路を有し、細胞がアッセイの前に一晩、96ウェル培養皿に播種し、第二に、MOIが20に減少した：1または：定期的に50を使用するから1 1 A MOI 20：100 1は、マクロファージの99％は、確率論的ポイントに応じて、ポアソン分布により算出され、10〜30細菌による感染にさらされることを保証することは生物学的要因に限定されない、と考えられる、細胞の損傷があり得る。 。圧倒細菌から引き起こされる物理的なコンタクト10はまた、 サルモネラの侵入を積極高いMOI 11と関連しているマクロファージのアポトーシスを誘発する可能性が20のMOIの使用：1を、携帯DAMAGeはおそらく限られた細菌マクロファージの物理的接触を最小限であることが見出された。第三に、インキュベーション時間間隔は、3つの時点のために最適化した関連付けをなしゲンタマイシンと共に30分間; 100μg/ mlのゲンタマイシンをさらに1時間（合計1.5時間後に感染症）のための侵入; 10μg/ mlのゲンタマイシンを持つ追加22.5時間（合計24時間後の感染）の複製。このテストでは、5μg/ mlのゲンタマイシンを、10％ウシ胎児血清（未発表データ）を用いて細胞を含まないDMEM中ですべてのサルモネラを死滅させるのに十分であるため、100μg/ mlのゲンタマイシン、迅速な殺傷及び10gを確保することが予想される/ mlのゲンタマイシン一晩のインキュベーションのための細胞培養培地中で細胞外の細菌のクリアランスを維持するインビボ 、それは子ウシ腸上皮細胞12,13を用いて組織に関連するサルモネラを検出するために約15分を要する; インビトロで 、30分間のインキュベーションをに報告され野生型のために適切であるこのプロトコルは、このアッセイのために食細胞の代わりに、上皮細胞を用いて小さな96ウェルフォーマットで。サルモネラ症の病因を研究する中で、最も広く使用されている上皮細胞株は、異種ヒト上皮結腸直腸腺癌由来する、のCaco-2である。のCaco-2細胞との定期的な24ウェル培養皿の浸潤試験を用いて、各時点で回収された細菌の実際の数は、表現型の複製のために特に22.5時間の時点では、時よりもはるかに低くなるようJ774またはRAW264などの食細胞、 0.7マクロファージは、（未発表データ）が使用される。したがって、これはより困難各ウェルより少ない宿主細胞を有している96ウェル培養皿を用いて表現型決定を行うことができる。これは、マクロファージ細胞は活発に内在以上の細菌を引き起こす可能性のある細菌を巻き込むことができ、そしてそれはまた、 サルモネラ菌は明らかたCaco-2細胞中でよりゆっくりと複製することを除外することはできないことが知られている。生き残るためには、内部のマクロファージ細胞を複製するサルモネラの能力はの病因に重要な役割に関連しているサルモネラ症、 すなわち 、大規模なホストの炎症応答をトリガーし、全身感染1を容易にする。私たちは、主にホスト相互作用におけるそれらの潜在的な契約のための計算パイプラインの選択された遺伝子の大規模なセットを表現型に変更され、標準化されたゲンタマイシン保護アッセイを用いた。それは、 サルモネラ変異株の約50％が貪食細胞の細胞内複製に関与する遺伝子として表現型が判明した。
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Acknowledgments
このプロジェクトは、（AJBとLGAのため、R01 AI076246）健康NIAIDの国立研究所のための助成金によって部分的にサポートされていました。 サルモネラ変異体のコレクションの一部は、HAP、R21のために（部分的に健康補助金の国立研究所によって、（MM、U01 A152237-05、R01 AI07397-01、R01 AI039557-11およびR01 AI075093-01用）健康補助金の国立研究所によってサポートされていましたAI083964-01、1R0 1AI083646-01、1R56AI077645、R01 AI075093）。私たちは、レプリカ平板法とコレクション内の変異体を確認するためのシュテフェンProwollikに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well Cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
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