Summary
Un ensayo de alto rendimiento in vitro de Salmonella fenotipo u otra asociación bacteriana, invasión, y la replicación en las células fagocíticas con capacidad de alto rendimiento se ha desarrollado. Se empleó el método de evaluar las cepas mutantes de Salmonella gen knockout por sus implicaciones en la interacción huésped-patógeno.
Abstract
Especies de Salmonella son patógenos zoonóticos y principales causas de las enfermedades transmitidas por los alimentos en los seres humanos y el ganado 1. La comprensión de los mecanismos que subyacen a las interacciones Salmonella -host son importantes para dilucidar la patogénesis molecular de la infección por Salmonella. El ensayo de protección de Gentamicina fenotipo asociación Salmonella, la invasión y la replicación en las células fagocíticas fue adaptado para permitir la selección de alto rendimiento para definir las funciones de los mutantes de deleción de Salmonella enterica serotipo Typhimurium en las interacciones huésped utilizando RAW 264,7 macrófagos murinos. Bajo este protocolo, la varianza en las mediciones se reduce significativamente en comparación con el protocolo estándar, porque de tipo salvaje y cepas mutantes múltiples pueden ser probados en la misma placa de cultivo y, al mismo tiempo. El uso de pipetas multicanal aumenta el rendimiento y mejora la precisión. Además, las preocupaciones relacionadas con el uso de menos hose trataron células st por pocillo en 96-así placa de cultivo. En este caso, el protocolo de la vitro Salmonella ensayo modificado en la invasión utilizando células fagocíticas se empleó con éxito al fenotipo 38 mutantes de deleción Salmonella individuales para la asociación, la invasión y la replicación intracelular. Se presentan los fenotipos in vitro, algunos de los cuales fueron posteriormente confirmó que en fenotipos in vivo en un modelo animal. Por lo tanto, la modificación, ensayo estandarizado fenotipo Salmonella asociación, la invasión y replicación en macrófagos con capacidad de alto rendimiento podría ser utilizado más ampliamente para estudiar las interacciones huésped-bacteriana.
Introduction
No tifoidea Salmonella son causas importantes de enfermedades entéricas en todos los vertebrados. La salmonelosis en los seres humanos es una de las principales enfermedades transmitidas por los alimentos bacterianas 1. Caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones de Salmonella con sus huéspedes animales se logra principalmente a través del estudio de Salmonella enterica serotipo Typhimurium (STM) en cultivo de tejidos y modelos animales de infección. Obtener ideas en las interacciones huésped-STM nos ayudará a entender cómo Salmonella sobrevivir y crecer dentro de las células huésped. El primer reto en el estudio de estas interacciones es identificar el mayor número de factores que participan como sea posible, tanto huésped y el patógeno, pero estos esfuerzos estén obstruidas en gran medida por las dificultades significativas de tratar con dos sistemas biológicos complejos independientes de forma simultánea, es decir, de acogida y Salmonella, en condiciones fisiológicas. Además, la gran RepertOire de Salmonella y genes de acogida factores que intervienen en las interacciones huésped potencialmente codifican requieren plataforma biológica de alto rendimiento para hacer frente a este desafío.
A modificada, ensayo estandarizado fenotipo asociación Salmonella, invasión y replicación en macrófagos con capacidad de alto rendimiento fue desarrollado para examinar un gran conjunto de genes que participan en las interacciones probables de Salmonella -host. El ensayo de protección de gentamicina fue desarrollado en 1973 2, pero fue el primero en describir minuciosamente por Elsinghorst en 1994 3,4. Ahora se ha convertido en una herramienta estándar para el estudio de muchos patógenos bacterianos intracelulares ex vivo, incluyendo Salmonella 5,6. Bacterias internalizadas evitar ser asesinados por algunos antibióticos, tales como gentamicina, que no pueden penetrar las células eucariotas 3. Al tomar ventaja de este fenómeno, el ensayo de protección de gentamicina mide la supervivencia y crecimiento de ba intracelularpatógenos cterial. Tres eventos durante la infección, es decir, la asociación con las células eucariotas, la invasión y la replicación, pueden ser evaluadas para los patógenos bacterianos intracelulares basados en el intervalo de tiempo entre la infección, el tratamiento de gentamicina, e incubación adicional (Figura 1). Líneas celulares eucariotas proporcionan un entorno fisiológico que es menos complejo que los modelos animales relevantes para los estudios de interacción huésped-patógeno.
El ensayo de protección de gentamicina es una plataforma adecuada para estudiar las interacciones STM-anfitrión, pero el ensayo estándar en una placa de cultivo de 24 pocillos tiene baja capacidad de rendimiento. Análisis computacional de los conjuntos de datos in vivo identificó 149 productos génicos Salmonella que se predicen para interactuar con aproximadamente 300 productos de los genes de acogida (datos no publicados). El ensayo de protección estándar Gentamicina no tiene la capacidad de fenotipo este número de mutantes de manera eficiente.
En addition, el ensayo de protección de gentamicina puede detectar teóricamente la invasión de incluso una sola bacteria. Debido a esta sensibilidad inherente, los datos en bruto son susceptibles a las variaciones técnicas cuando se repite en diferentes momentos. Los controles internos y la presentación de los datos en relación después de la normalización son esenciales para la interpretación significativa de los resultados. Dadas estas consideraciones, un ensayo de protección de gentamicina normalizado modificado fue desarrollado para mejorar la capacidad de prueba y aumentar la precisión.
El siguiente protocolo es detallada e ilustrada para llevar a cabo el ensayo de protección de gentamicina modificado utilizando 96 pocillos y placas de cultivo de la línea celular de macrófagos murinos RAW264.7. En comparación con el protocolo estándar de 24 pocillos placas de cultivo, el protocolo modificado tiene las siguientes ventajas: 1) El uso de 96 pozos placas de cultivo permite hasta 10 diferentes cepas mutantes que fenotipados incluidos los controles positivos y negativos internos con suficiente poder estadístico;2) La varianza de los resultados se reduce significativamente, porque las cepas mutantes se ensayaron de la misma placa de cultivo y, al mismo tiempo; 3) El uso de pipetas multicanal aumenta el rendimiento al tiempo que reduce la fatiga del operador. Por último, en comparación con 24 y placas de cultivo, las preocupaciones de menos células huésped por pocillo en 96-así placa de cultivo se abordaron a través de la optimización del protocolo y la normalización.
En resumen, el modificado, ensayo estandarizado para Salmonella in vitro fenotipo u otra asociación bacteriana, la invasión y la replicación en las células fagocíticas aumenta la precisión y logra la capacidad de alto rendimiento al tiempo que reduce la fatiga del operador.
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Protocol
1. murino macrófagos RAW264.7 Cell Culture
- Crecer bajo número de pasos células de macrófagos murinos, RAW264.7 (el número ATCC ®, TIB-71) en un matraz de cultivo celular ventilado tapa T-75 de filtro en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) , 0,5% de NaHCO3, y el 1% 100x Los aminoácidos no esenciales (AANE) a 37 ° C, en un incubador de CO2 al 5%.
- Una vez que las células alcanzan una confluencia del 60-80% en el matraz, utilizar un rascador de células para cosechar las células, y contar las células en un hemocitómetro y calcular la concentración de células.
- Resuspender las células y diluir la concentración de células en 2,5 x 10 5 / ml en medio de cultivo celular DMEM fresco. Utilice pipetas multicanal a la placa 200 l de medio de cultivo celular DMEM que contiene 5 x 10 4 células en cada pocillo de placas de 96 pocillos de cultivo celular.
- Placa cuatro pozos de cada cepa de Salmonella. Establecer tres placas separadas por un conjuntode ensayo de invasión de las células fagocíticas, y marcarlos con "asociación", "invasión" y "réplica", respectivamente.
- Coloque las placas en el incubador de CO2 al 5% a 37 ° C en ON para permitir que las células de los macrófagos para insertarse en el fondo de los pozos.
2 Preparación de Salmonella de tipo salvaje y los mutantes
- El mismo día de la preparación de las células RAW264.7 macrófagos, recoger colonias individuales de tipo salvaje (WT) de Salmonella enterica serotipo Typhimurium 14028s, mutantes DinvA, DphoP mutantes y las cepas mutantes de prueba deseados, y la cultura en Luria-Bertani ( LB) caldo suplementado con antibióticos, según proceda. Use cada conjunto de los ensayos de invasión de las células fagocíticas para probar hasta 10 cepas mutantes (DinvA mutante y DphoP mutante son defectuosos en la invasión y la replicación intracelular, respectivamente).
- Cultivar las bacterias durante 14 horas a 37 ° C con sHaking a 220 rpm en 5 ml cada uno de caldo LB taparon sin apretar en 14 ml de polipropileno en un tubo de fondo redondo. Caldo LB contiene antibióticos apropiados, en nuestro caso, la mayoría de las cepas mutantes son resistentes a la kanamicina, 50 mg / ml
- Al día siguiente, cada subcultura del sobre cultivos de cepas de Salmonella en llano 5 ml de caldo LB en una proporción de 01:50 para una 4 horas más con agitación a 220 rpm.
- Leer OD 600 valores de cada cultivo bacteriano en un espectrofotómetro, y cada lectura debe oscilar 0,6-1,2 para optimizar Salmonella isla de patogenicidad-1 tipo III sistema de secreción (SPI-1 TTSS) la expresión génica para la invasión.
- Usa la fórmula de 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 UFC / ml para estimar la concentración bacteriana, a continuación, las bacterias se diluye hasta una concentración de 5 x 10 6 UFC / ml en medio de cultivo celular DMEM fresco.
3. ensayo de invasión en el 96-así placa de cultivo
- Remover tres cel 96 pocillosl placas de cultivo de la incubadora de CO 2 y lavarla una vez con 200 l de tampón PBS 1x.
- Después del lavado y la eliminación completa de PBS, añadir 200 l de bacterias en medio DMEM (ver arriba) en cada pocillo. Esto da lugar a 1 x 10 6 células de Salmonella en cada multiplicidad bien y de infección (MOI) de 20: 1.
- Centrifugar las placas a 1000 xg en un vehículo cerrado durante 10 minutos, luego vuelva a colocar las placas (tiempo cero) en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min. Para cada cepa, configurar al menos cuatro pocillos por duplicado.
- Después de 30 min, quitar placas de la incubadora y se lava tres veces con 200 l de 1x PBS para eliminar las bacterias no asociados.
- Tras el lavado, guardar la placa marcada con "asociación" para continuar el tratamiento. Añadir 200 l de medio DMEM que contiene 100 mg / ml de gentamicina a cada pocillo de las placas marcadas con "invasión" y "replicación" para to matar la Salmonella extracelular. Devolver las placas a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante una hora adicional.
- Guardar un pocillo de cada cepa infectada para la grabación de recuento de células de macrófagos, tratar el resto de los pozos en la placa de "asociación" con 200 l de 1x PBS que contenía 1% de Triton X-100 durante 10 min. La solución de Tritón lisar células de macrófagos y la liberación Salmonella asociado.
- Harvest Salmonella de cada pocillo y los situará en 1,5 ml tubos Eppendorf. Realice tres 10 diluciones seriadas con 900μl 1x PBS en las muestras recolectadas de cada pocillo, vórtice se realiza entre cada dilución.
- Placa de la tercera dilución, 10 -3, en cualquiera de LB (WT) o LB Kan (mutantes) placas. Etiquetar las placas con nombre apropiado cepa de Salmonella, el número de dilución, punto en el tiempo y la fecha.
- Después de la tercera vórtex tubo de dilución, dispensar la muestra 10 l en la superficie del agar y repita fnuestros tiempos para un total de 5 gotas. Asegúrese de espacio de los cinco 10 l cae uniformemente sobre las placas plato de Petri 7.
- Después de que las gotas mojen el agar, gire las placas e incubar durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
- Tratar pozos guardados para el recuento de los macrófagos con 150 mu l 1 x PBS que contiene 0,25% de tripsina-EDTA durante 10 min.
- Después de tripsinización, lugar macrófagos en 1,5 ml tubos Eppendorf y los tratan con 50 l de FBS para neutralizar la solución de tripsina / EDTA, se tiñen las células con 0,4% tripán azul y puntúan a través de el uso de hemocitómetro.
- Cuando ha transcurrido la incubación de una hora, retirar la "invasión" y placas "replicación" de la incubadora de CO 2, y lavar cada pocillo como "Paso 3.4".
- Guarde la placa de "invasión" para su posterior tratamiento como "Paso 3.6 a 3.12".
- Añadir 200 l de medio DMEM que contiene 10 mg / ml de gentamicina ala placa de "replicación" para mantener el espacio libre de Salmonella en el medio extracelular. Devuelva la placa a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora para un 22.5 h adicionales.
- Al día siguiente, retire la placa de "réplica" de 37 ° C, 5% de CO2, y lavar cada pocillo como "Step 3.4" y tratarlos como "Step 03.06 a 03.12".
- Por último, eliminar las placas de agar después de la incubación durante la noche en 37 ° C incubadora y anotar el número de colonias bacterianas.
- Una buena distribución de colonias debe estar entre 10 y 100 colonias, cada punto contiene aproximadamente 2 a 20 colonias, que sería difícil de marcar si había más de 20 colonias en un solo lugar. Si el recuento es demasiado baja o demasiado alta, replate la muestra con 10 veces diluciones mayores o menores según sea necesario.
Análisis 4. Datos
- Calcular las (unidades de formación de colonias por ml) CFU de cada placa base en el forrovolumen y el factor de dilución.
- Determinar el número de Salmonella por los macrófagos a través del recuento de células de macrófagos registrado de cada cepa.
- Calcular las medias geométricas de CFU por macrófagos a partir de al menos tres experimentos independientes para la asociación celular, invasión o la replicación, respectivamente, y normalizar aún más a la WT para el valor relativo.
- Analizar los datos de la asociación, la invasión y la replicación de la prueba t de Student, respectivamente, mediante la comparación de cada cepa a WT, y determinar la significación estadística por el p-valor.
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Representative Results
Ver resultados representativos (Figura 2) después de que los datos que se muestran en base al ensayo de invasión celular fagocítica modificado. Los datos incluyen cinco cepas diferentes, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A y B. mutante Δ Inva, conocido por ser defectuoso para la invasión, y ΔphoP conocidos por ser defectuoso para la replicación 8, se utilizaron como controles positivos para evaluar la validez experimental . En efecto, en el ensayo de invasión modificado, un mutante ΔinvA se internaliza mal por células RAW264.7 y un mutante ΔphoP había reducido la replicación después de 24 hr. Mutantes A y B son cepas representativas ensayó usando este protocolo. Mutante A muestra una reducción significativa de la replicación (Figura 2), similar a un mutante ΔphoP; Curiosamente, B mutante muestra un aumento significativo en la replicación (Figura 2). Los datos indican claramente tanto de esos mutants han alterado fenotipos para la invasión y supervivencia en macrófagos.
En resumen, numerosos mutantes de deleción de Salmonella fueron fenotipados individualmente para participación en la asociación bacteriana, invasión, y la replicación en macrófagos RAW264.7 usando el ensayo de invasión modificado. Veinte de 38 mutantes ensayados hasta ahora muestran defectos variables pero significativas en la infección bacteriana de los macrófagos (Tabla 1), por lo tanto el ensayo modificado para in vitro fenotipo Salmonella u otra asociación bacteriana, la invasión y la replicación en las células fagocíticas aumenta la capacidad de precisión y de alto rendimiento, mientras reducir la fatiga del operador.
Figura 1. esquema de trabajo de ensayo de alto rendimiento. Ensayo de protección de gentamicina es modicado, estandarizado al fenotipo numerosos mutantes de Salmonella simultáneamente en placas de 96 pocillos. Los pasos clave se realizan como antes para examinar la asociación, la invasión y la replicación de Salmonella en los macrófagos RAW264.7.
. Figura 2. resultados representativos Los ensayos de alto rendimiento se llevan a cabo para las cepas de Salmonella - WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A y B mutante - en células de macrófago RAW264.7. Para cada cepa, las medias geométricas de CFU por macrófagos se obtienen a partir de tres experimentos independientes para la asociación celular, invasión y replicación, respectivamente, que son más normalizaron a la WT y la representación gráfica se muestra. Las barras de error indican el error estándar, y la significación estadística de cada cepa de referenciaa WT se determinó por la prueba t de Student. * P <0,05. MOI = 20.
Tabla 1. fenotipos de los genes candidatos. Candidatos Salmonella mutantes se fenotipados por la modificación, ensayo estandarizado para la asociación, la invasión y la replicación en células de macrófago RAW264.7. 20 mutantes tienen defectos significativos en la asociación, la invasión y / o replicación.
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Discussion
El ensayo de protección de gentamicina se utiliza ampliamente para estudiar la invasión y la replicación de patógenos bacterianos intracelulares dentro de la célula huésped, y es especialmente una herramienta biológica importante para el estudio de los patógenos, como Salmonella, cuya invasión es el paso requisito previo para el establecimiento de la infección 1. El ensayo estándar de protección de gentamicina en la comunidad de investigación de Salmonella se implementa en 24 pocillos placa de cultivo 5. Aunque el uso de 48 o incluso placas de 96 pocillos fueron discutidos antes para la capacidad de alto rendimiento 9, ningún protocolo real se ha demostrado en detalle y empleado con éxito para probar una colección de mutantes bacterianos. Aquí, un modificado y protocolo estandarizado fue desarrollado para utilizar placas de cultivo de 96 pocillos al fenotipo de mutantes de Salmonella. Cabe destacar que este protocolo sólo se ha probado para Salmonella y células fagocíticas, por tanto, modificaciones y optimización evidente que sería necesario con othe r bacterias o células huésped.
Hay varias ventajas para el ensayo de protección de gentamicina modificado para Salmonella fenotipo asociación, la invasión y la replicación en las células fagocíticas. En primer lugar, el formato de placa de cultivo de 96 pocillos permite realizar pruebas de alto rendimiento y análisis, hasta 10 cepas diferentes pueden ser probados simultáneamente con suficiente repetición análisis estadístico y los controles internos. En segundo lugar, debido a la alta sensibilidad del ensayo, los datos en bruto del ensayo de protección de gentamicina pueden ser susceptibles a las variaciones técnicas cuando se repite en diferentes momentos. Bajo este protocolo modificado, varias cepas se fenotiparon en las mismas condiciones durante todo el proceso, la reducción de la varianza. Por último, el uso de pipetas multicanal aumenta la eficiencia y reduce la fatiga del operador. El nuevo protocolo facilitó la rápida fenotipificación numerosos mutantes de Salmonella, mientras que la generación de grandes cantidades de datos reproducibles, cuantitativos.
ove_content "> Una de las preocupaciones en hacer ensayos de invasión en 96 pocillos placas de cultivo es que los pocillos contienen menos células eucariotas, y debido a esto la cuantificación podría verse comprometida. Para abordar esta preocupación, se realizaron una gran serie de ensayos para optimizar la reproducibilidad. Primera , los macrófagos RAW264.7 utilizados en este protocolo tenían menos de 20 pasajes, y las células fueron sembradas en 96 pocillos placa de cultivo durante la noche antes del ensayo En segundo lugar, la MOI se redujo a 20:. 1 de la utilizada regularmente 50: 1 o 100: 1 Un MOI 20:.. 1 asegura que el 99% de los macrófagos estará expuesto a la infección por bacterias de 10 a 30 calculados por distribución de Poisson de acuerdo con el punto estocástico Se cree que, no se limita a factores biológicos, daño celular podría ser . causadas por bacterias que abruman contactos físicos 10 Además, la invasión de Salmonella podrían inducir la apoptosis de los macrófagos, que se asocia positivamente con una alta MOI 11 Usando una MOI de 20:. 1, damag celulare se encontró que era mínima, presumiblemente debido a un contacto físico limitado de bacterias macrófagos. En tercer lugar, el intervalo de tiempo de incubación fue optimizado para los tres puntos de tiempo: asociación durante 30 min sin gentamicina; invasión durante 1 hora adicional (1,5 horas después de la infección total) con 100 g / ml de gentamicina; replicación para adicional 22.5 hr (total 24 horas después de la infección) con 10 mg / ml de gentamicina. En nuestra prueba, 5 mg / ml de gentamicina es suficiente para matar toda la Salmonella en DMEM libre de células con 10% de suero bovino fetal (datos no publicados), por lo tanto, 100 g / ml de gentamicina se esperaría para garantizar la rápida matanza y 10 g / ml de gentamicina mantendría el aclaramiento de bacterias extracelulares en el medio de cultivo celular para la incubación durante la noche en vivo, se tarda unos 15 minutos para detectar tejidos Salmonella asociada con el becerro delgado células epiteliales 12,13;. in vitro, 30 min de incubación se informa que ser adecuada para el tipo salvajeEste protocolo emplea células fagocíticas en lugar de las células epiteliales para este ensayoen un formato de 96 pocillos más pequeño. En el estudio de la patogénesis de la salmonelosis, la línea celular epitelial más ampliamente usado es Caco-2, derivada de adenocarcinoma colorrectal heterogénea epitelial humano. Uso de la prueba de 24 pocillos invasión placa de cultivo regular con células Caco-2, el número real de bacterias recuperadas en cada punto de tiempo, en particular el punto de tiempo de 22,5 h para la replicación fenotipificación, es mucho menor que cuando las células fagocíticas, tales como J774 o RAW264 0.7 macrófagos, se utilizan (datos no publicados). Por lo tanto, esto hace que sea más difícil de realizar fenotipificación utilizando una placa de cultivo de 96 pocillos cuando cada pocillo tiene un menor número de células huésped. Se sabe que las células macrófagos podrían engullir activamente las bacterias, lo que podría conducir a más bacterias están internalizados, y tampoco se puede descartar que la Salmonella aparentemente replicar más lentamente en células Caco-2. La capacidad de Salmonella para sobrevivir y replicarse dentro de las células de los macrófagos se relaciona con un papel clave en la patogénesis de lasalmonelosis, es decir, desencadenando respuestas masivas inflamación huésped y facilitar la infección sistémica 1. Empleamos principalmente el ensayo de protección de Gentamicina modificado y estandarizado al fenotipo de un gran conjunto de cálculo de tuberías genes seleccionados por sus posibles compromisos en las interacciones huésped. Resultó casi el 50% de los mutantes de Salmonella se phenotyped como genes implicados en la replicación intracelular en las células fagocíticas.
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Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud NIAID (por AJB y LGA, R01 AI076246). La colección mutante de Salmonella fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (por MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 y R01 AI075093-01), en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (por HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Damos las gracias a Steffen Prowollik de réplica en placa y confirmando los mutantes de la colección.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well Cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
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