Abstract
Telomerase, ein ribonucleoprotein, ist für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge und damit die Förderung der genomischen Integrität, Proliferation und Lebensdauer verantwortlich. Darüber hinaus schützt die Telomerase Mitochondrien aus oxidativem Stress und verleiht Resistenz gegenüber Apoptose, was seine mögliche Bedeutung für das Überleben der nicht-mitotischen hochaktive Zellen, wie Neuronen. Wir haben bereits gezeigt, die Fähigkeit der neuen Telomerase-Aktivatoren, um die Telomerase-Aktivität und Expression in den verschiedenen Hirnregionen der Maus zu erhöhen und die motorischen Nervenzellen Zellen vor oxidativem Stress zu schützen. Diese Ergebnisse stärken die Vorstellung, dass die Telomerase in den Schutz von Neuronen vor verschiedenen Läsionen beteiligt. Um die Rolle der Telomerase im Gehirn unterstreichen, hier vergleichen wir die Aktivität der Telomerase in männlichen und weiblichen Maus Gehirn und seine Abhängigkeit vom Alter. TRAP-Assay ist ein Standardverfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität in verschiedenen Geweben oder Zelllinien. Die Analy Hier zeigen wirsis der Telomerase-Aktivität in drei Regionen des Mäusehirns durch nicht-denaturierenden Protein-Extraktion unter Verwendung von CHAPS Lysepuffer gefolgt von Modifikation der Standard-TRAP-Assay.
In diesem 2-Schritt-Assay, verlängert endogenen Telomerase eine bestimmte Telomerasesubstrat (TS-Primer) durch Zugabe von 6 bp TTAGGG Wiederholungen (Telomerase-Reaktion). Die Telomerase-Reaktionsprodukte durch PCR-Reaktion die Schaffung einer DNA-Leiter mit 6 bp-Schritten amplifiziert. Die Analyse der DNA-Leiter wird durch 4,5% Agarose hochauflösende Gelelektrophorese, gefolgt von Anfärben mit hochempfindlichen Nucleinsäure-Färbung.
Im Vergleich zu den traditionellen TRAP-Assay, nutzen 32 P markierten radioaktiven dCTP für DNA-Detektion und-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Lösung des DNA-Leiter, bietet das Protokoll eine nicht-toxische Zeitersparnis TRAP-Assay zur Auswertung der Telomeraseaktivität im Gehirn der Maus, demonstrieren die Fähigkeit, erkennen Unterschiede in telomerasE-Aktivität in den verschiedenen weiblichen und männlichen Gehirn der Maus Region.
Introduction
Telomerase ist ein Ribonukleoprotein-Telomerase zusammen Reverse Transkriptase (TERT), der katalytischen Untereinheit der Telomerase-RNA-Komponente und eine (TERC). Die kanonische Funktion der Telomerase ist, um die richtige Länge der Telomere durch Zugabe von repetitiven Sequenzen (TTAGGG) an die telomeren Enden, damit die Förderung der genomischen Integrität und Zellproliferation 1 erhalten. Weitere Rollen wurden in TERT-Zellen zurückzuführen, dh Resistenz gegen Apoptose durch verschiedene schädigende Mittel induziert 2 schützt humanen mesenchymalen Stammzellen vor oxidativer Beanspruchung 3, und spielt eine überlebens Rolle vollständig differenzierten Neuronen durch seine Verbindung zum positiven RNA TIA1 Granulat 4.
TERT exprimiert wird, und vor allem in Körperteilenden Zellen und in den meisten Krebsarten aktiv ist, während die Enzymexpression und Aktivität sind fest in nicht-teilenden Zellen 5,6 geregelt. Studien haben gezeigt, dass das ROdent Gehirn, wird die Telomerase-Aktivität nicht nachweisbar durch postnatalen Tag 10, während TERT mRNA wird auf den unteren Ebenen bis ins Erwachsenenalter 7 gehalten. Andere Studien zeigten, Telomeraseaktivität in der Erwachsenenunter ventrikulären Zone, dem Riechkolben, dem Hippocampus und im Cortex und Cerebellum Erwachsenen 8. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass neue Verbindungen, die Telomerase-Expression und Aktivität im Gehirn und Rückenmark zu erhöhen ausgeübt neuroprotektive Effekte in N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) - injizierten Mäusen, verzögert die Entstehung und das Fortschreiten der Krankheit Amyotrophe Lateralsklerose in SOD1 transgenen Mäuse und erhöhte das Überleben von Motoneuronen im Rückenmark von diesen Mäusen 9. Um die überlebens Rolle der Telomerase in Neuronen im Gehirn zu verstehen, ist es wichtig, ein einfaches und relativ empfindlich schnelle Methode zum Nachweis von Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Bereichen des Gehirns zu entwickeln.
Die Telomer-repeat Amplifikationsprotokoll (TRAP) ist eine bekannte empfindliche Assays Kombinieren des kanonischen Aktivität der Telomerase und der Polymerasekettenreaktion (PCR). In diesem Assay fügt Telomerase TTAGGG Wiederholungen für eine Telomerase-Substrat (TS-Primer) Oligonukleotid, gefolgt von PCR-Amplifikation mit 6 Basenpaaren (bp)-DNA-Leiter mit der TS Rückwärtsprimer erzeugt -. ACX 32 P markiertem dCTP werden verwendet, um die Erfassungs geringe Menge an PCR-Produkten. Die DNA-Leiter wird durch Sequenzierung Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gelöst. Sowohl die Intensität der DNA-Banden und die Länge der DNA-Leiter spiegeln die Menge an aktiven Enzymmolekülen und ihre Prozessivität bzw. 10.
Das traditionelle Test hält einige größere Schwierigkeiten: Die Gefahr der Belastung durch radioaktive Stoffe, groß und schwer, Sequenzierung PAGE und der Zeitaufwand des Gels Laufen und Filmbelichtung des radioaktiven Produkt (über Nacht in beiden Fällen) zu behandeln. Dieses Protokoll bietet eine verbesserte nicht-radioaktiven Agarose-Gel-Mini-basierte Assays. Die DNA 6 bp-Leiter wird mit 4,5% hochauflösende Agarose-Gel aufgetrennt und die Detektion erfolgt mittels hochempfindlicher Nukleinsäure Fleck. Die Kombination von hoher Auflösung mit Agarose-Gel-Mini und empfindliche Nukleinsäurefärbung bietet einfach zu hand Assay, beseitigt die Gefahr der Radioaktivität ausgesetzt sind und die Gesamtdauer Assay 3 Tagen deutlich verkürzen, um mehrere Stunden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche in der Ben-Gurion-Universität (IL-39-08-2010) zugelassen.
1. Maus Gehirn Proteinextraktion
- Bereiten Sie 3 Rohre von je 15 ml 5 ml Ringer-Lösung und Ort Röhrchen auf Eis enthält.
- Opfern Sie die Maus mit Isofluran-Narkose (Achtung - chemische Haube) für 10-20 Sekunden, gefolgt von Genickbruch und sofortige Enthauptung.
- Entfernen das Gehirn aus dem Schädel und gründlich für einige Sekunden mit eiskaltem Ringer-Lösung, um Schäden am Hirngewebe zu verhindern.
- Verwendung einer chirurgischen Klinge, trennen das Cerebellum (CR) und Hirnstamm (BS) von dem frontalen Kortex. Als nächstes trennen das Kleinhirn aus dem Hirnstamm und schneiden den Frontallappen (FL) aus dem frontalen Kortex; entfernen Sie den Riechkolben aus der Frontallappen. Legen Sie die 3 Hirnregionen in den dafür vorgesehenen 15-ml-Röhrchen.
- Homogenisieren des Gewebes in jedes Röhrchen. Fr hinzufügenesh eiskalt Ringer-Lösung, so dass jeder Röhre enthält das gleiche Volumen und Zentrifuge für 7 min bei 800 x g.
- Entfernen des Überstandes und Zugabe von 100 ul Lysepuffer CHAPS in jedes Röhrchen. Gut mischen, indem die Lösung mehrmals (~ 10) durch ein 1-ml-Spritze mit einer 21 G-Nadel, und Inkubation auf Eis für 30 min.
- Wird der Inhalt jedes Röhrchens in eine neue Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 30 min bei 13.000 x g. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und bestimmt die Proteinkonzentration unter Verwendung eines vorher festgelegten Verfahrens. Speichern die Proteinextrakte in Aliquots von 10 ul bei 80 ° C aufweist.
2. TRAP-Assay Vorbereitung der Instrumente, Reaktionslösungen und Protein Verdünnung Berechnungen
- Bereiten Sie entsprechende Anzahl von markierten Mikrozentrifugenröhrchen für Proteinextrakt Verdünnungen und Telomerase-Reaktionspuffer. Führen Sie alle Pipettieren im Protokoll mit Filterspitzen, um eine Verunreinigung zu verhindern. Tauen die folgenden Lösungen auf Eis: TRAP-Reaktionsmischung 10x, TS-Primer, dNTPs, UPW und Proteinextrakte (siehe Tabelle der Werkstoffe für Reagenzien und Reagenzien Konzentrationen).
- Verdünne die Lösung der Proteinextrakt in einer Endkonzentration von 1 ug / ul mit ultrareinem Wasser (UPW).
3. Telomerase-Reaktion
- Bereiten Telomerase Reaktionsmischung durch Hinzufügen der folgenden, um einen Mikrozentrifugenröhrchen: 2 ul TRAP-Mix (10x), 1 ul TS-Primer (0,1 ug), 1 ul dNTPs (10 mM) und 15 ul UPW. Für mehrere Proben, multiplizieren vorgenannten Volumina der Anzahl von Proben, plus 1.
- Fügen 19 ul der Reaktionsmischung in jedes Reaktionsgefäß und mit 1 ul der verdünnten Proteinextrakt (1 ug Proteine) zu jedem Röhrchen für ein Endvolumen von 20 ul.
- Zeigen die Reaktionsrohre in einem 30 ° C vorgewärmten Wasserbad für 45 min.
4. PCR-Reaktion
- Fünfzehn min vor dem Ende der Telomerase-Reaktion, tauen die folgenden Lösungen: ACX Grundierung, Titanium Taq-Puffer, UPW.
- Bereiten PCR-Reaktionsmischung durch Zugabe Folgendes in einer Mikrozentrifugenröhrchen: 2,5 ul Titanium Taq-Puffer (10x), 1 ul ACX-Primer (0,1 ug), 2 ul UPW (1 ul, wenn IC verwendet wird) und 0,5 ul Titanium Taq-Polymerase (50x). Für mehrere Proben, multiplizieren vorgenannten Volumina der Anzahl von Proben plus 2.
- Sie 6 ul des PCR-Gemisches zu jeder PCR-Röhrchen und fügen das gesamte Volumen des Telomerase-Reaktion (20 ul) zu jedem Röhrchen für ein Endvolumen von 26 ul.
- Setzen Sie die PCR-Röhrchen zu einem PCR-Thermocycler und führen Sie das folgende Programm:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C - 30 Sek. *
- 60 ° C - 30 sec. *
- 72 ° C -. 45 s *
- 72 ° C - 2 min.
Speicher PCR-Produkte bei -20 ° C.
* = 34 Zyklen
5. Agarose Mini-gel Vorbereitung, Proben Laufen, und Gelfärbung
- 25 ml gekühltes Elektrophorese-Puffer (TBE) und einen Rührstab in ein Becherglas, das 2-4 mal das Volumen des Pufferlösung ist und langsam in 1,125 g des hochauflösenden (HR) Agarose-Pulver bestreuen, während die Lösung schnell gerührt . Entfernen Sie den Rührstab, decken Sie den Becher mit einer Kunststofffolie und Pierce in einem kleinen Loch für die Belüftung. Heizen Sie den Becher in der Mikrowelle auf "Low" Macht für 3 min und wechseln Sie dann auf "Hoch" Macht und erwärmen die Lösung in kurzen Pulsen mit Sorgfalt Verschütten nicht verursachen. Beachten Sie, dass, wenn der Schaum erzeugt wird durch Erhitzen großen Blasen und verschwindet nach einigen Sekunden ist die Agarose bereit.
- Guss das Gel auf einer horizontalen Mini Gel Vorrichtung, nachdem die Gel erstarrt bei Raumtemperatur zu ermöglichen, um das Gel für 20 min bei 4 ° C zu kühlen, bevor Gebrauch.
- Laden Sie jeder Spur mit 25 ul TRAP Probe (20 ul TRAP PCR-Produkte und 5 ul 6x Gel-Ladefarbstoff) und 11 laufen0 V für 3 Stunden in einer 4 ° C kalten Raum.
- Bereiten Nukleinsäurefarbstoff 3x Arbeitslösung durch Zugabe von 15 ul 10.000-Nukleinsäure-Färbung, Stammlösung zu 50 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW) mit 0,1 M NaCl (0,29 g). Färben Sie das Gel für 20 min unter leichtem Schütteln.
- Verwenden UV-Transilluminator mit 302 nm Wellenlänge, die Falle Leiter DNA-Banden zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gesamtzellproteinextrakte wurden aus dem Frontallappen (FL), Hirnstamm (BS) und Cerebellum (CR) hergestellt aus 3 CD-1 und 3 weibliche CD-1 männliche Mäuse im Alter von 1 und 3 Monaten für die abgeleitete TRAP-Assay modifiziert und 3 CD-1 männliche Mäuse im Alter von 2 Monate alt für die radioaktive TRAP-Assay. Telomerase-Aktivität wurde in 1 pg Proteine festgestellt wurden unter Verwendung der modifizierten TRAP-Assay und 2 pg Proteine zu extrahieren für die radioaktive TRAP-Assay. Nachweis von Telomerase-Aktivität durch das radioaktive TRAP-Assay und durch die modifizierte TRAP-Assay zeigt, daß eine bessere Visualisierung und Auflösung der Telomerase-DNA-Produkte mit dem modifizierten Test beobachtet, wie durch die Länge und Intensität der DNA-Leiter (1A gegen 1C gesehen und 1D). Eine schrittweise Reduktion der Telomerase-DNA-Produkte wird beobachtet, wenn abnehmende Konzentrationen von Proteinextrakten aus Glioblastom U-251-Zelllinie wurde verwendet suggestechen die Empfindlichkeit des modifizierten TRAP-Assay-Verfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität bei niedrigeren Konzentrationen von Proteinen Extrakt (Abbildung 1B).
Eine deutlich höhere Telomeraseaktivität in den FL und BS Regionen im Vergleich zu der in CR 3 Monate alten Weibchen und Männchen gesehen, wie durch die Intensität der DNA-Banden und die Länge der DNA-Produkte Leiter offenbart. Darüber hinaus ist es gezeigt, dass während des Übergangs in das Erwachsenenalter Maus Telomeraseaktivität Erhöhungen der FL und nimmt in der BS und CR (1D). Vergleich zwischen den Geschlechtern zeigt, dass in der FL Telomeraseaktivität ist bei Frauen im Gegensatz zu der BS und CR, die höhere Telomeraseaktivität bei Männern höher.
In Geweben exprimieren geringe Telomeraseaktivität haben wir festgestellt, dass die Detektion der DNA-Leiter mit PCR effizienter ist, ohne die interne Kontrolle (IC)-Primer, da der IC verwendet das TS als Vorwärts-Primer somit Störung der DNA-Leiter Verstärkung. Die Reproduzierbarkeit der Daten wird durch Wiederholen jedes Experiment mehrere Male erreicht.
Abbildung 1. Telomerase-Aktivität im Gehirn von Mäusen: Traditionell gegen modifizierten TRAP-Assay. A) Telomerase-Aktivität in Hirnregionen, 3 durch radioaktive TRAP-Assay (2 Monate alt männliche CD-1-Mäuse, extrahieren 2 pg Proteine). B) Empfindlichkeit des modifizierten TRAP-Assay wird durch abnehmende Konzentrationen der Proteine gezeigt analysiert Auszug aus Glioblastom U abgeleitet -251 Zelllinie. C, D) Telomeraseaktivität in 3 Regionen des Gehirns von 1 (C) und 3 (D) Monate alten weiblichen CD-1 und männlichen Mäusen. Die DNA-Leiter beginnt an der 50-bp-Bande mit 6 bp-Schritten. (NC - Negativkontrolle, IC-interne Kontrolle, BS - Hirnstamm, CR - Kleinhirn, FL - Frontallappen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse von Telomerase-Aktivität in Gehirn der Maus über die TRAP-Assay besteht aus 4 Schritten: 1) Extraktion von Proteinen spezifische Bereiche des Hirngewebes 2) TS Primerverlängerung durch Telomerase - Telomerasereaktion 3) Amplifikation der Telomerase-Reaktionsprodukte durch PCR 4 ) Auftrennung der PCR-Produkte mit hoher Auflösung Agarosegel.
Diese modifizierte TRAP-Assay befasst sich mit zwei Hauptschwierigkeiten, die sich aus der traditionellen Assay steigen: die Verwendung von radioaktiven dCTP für empfindliche Detektion der PCR-Produkte und PAGE Trennung der DNA-Leiter. Hochauflösung Agarosegel vereinfacht den Nachweis der Telomerase-Reaktionsprodukte (der DNA-Leiter), im Vergleich zu der Fest Sequenzierung PAGE behandeln. Darüber hinaus ist die Nukleinsäurefärbung eine ungiftige Lösung mit hoher Empfindlichkeit für die Detektion von kleinen DNA-Menge erforderlich ist.
Besonderes Augenmerk sollte auf den folgenden kritischen Schritte gegeben werden: 1) Halten die Zeit zwischen Gewebeentnahme und Homogenisierung auf ein Minimum Protein Integrität zu bewahren 2) CHAPS Lysepuffer erneutes Einfrieren zu vermeiden 3) Proteinextrakte sollten aliquotiert aufbewahrt und einmal vor dem Gebrauch aufgetaut werden können. Wiedereinfrieren der Proben zu vermeiden.
Probleme können bei der Gel-Vorbereitungsschritt, da eine hohe Konzentration Agarose-Gel auftreten ist anfällig für Spillover und erfordert große Aufmerksamkeit während des Kochens. Die Technik besitzt einige Einschränkungen mit der Notwendigkeit der Ausführung des Gels in einem kalten Raum. Darüber hinaus kann die geringe Menge an PCR-Produkten, die nicht auf einem UV-Tisch betrachtet werden.
Telomerase-Aktivität Niveau variiert zwischen den verschiedenen Geweben und wird als gering im Gehirn zu sein. Dieses Protokoll bietet eine empfindlichere Nachweisverfahren im Vergleich zu den herkömmlichen radioaktiven Assay ermöglicht eine bessere Erkennung von Telomerase-Aktivität im Gehirn. Obwohl verschiedene zeiteffiziente Methoden zur Verfügung (ein Schritt TRAP-Assay-Kits, mit einem labeled TS-Primer für den Nachweis) Diese Methoden sind wesentlich teurer. Darüber hinaus ist die Verwendung von Agarose beseitigt die toxische Gefährdung der Verwendung von Polyacrylamid-Gel.
Wie aus den repräsentativen Ergebnisse zeigten, unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, die Unterschiede in der Telomerase-Aktivität zwischen den verschiedenen Regionen des Gehirns und von männlichen und weiblichen demonstrieren. Dieses Verfahren kann zum Nachweis von Telomerase-Aktivität in anderen normalen Geweben mit niedriger Telomerase-Aktivität verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
