Introduction
Flertallet av nye HIV-infeksjoner i verden oppstår gjennom heteroseksuell smitte, med kvinner som representerer 47% av nye infeksjoner i 2011 (UNAIDS 1). Forstå det kvinnelige kjønnsorgan (FGT), en av de viktigste inngangsportaler for HIV og andre seksuelt overførbare patogener, er av stor betydning på veien til å finne effektive strategier for å hindre smitte. Immunresponser ved genital slimhinne er klart unikt og skiller seg fra de som er målt i perifert blod to. Imidlertid er dagens kunnskap om immun dynamikk på FGT begrenset i beste fall. Hittil har studier av slimhinnene immun miljøet i stor grad fokusert på gut-assosiert lymfoid vev (GALT), hvor det har blitt klart at de tidlige hendelser i slimhinnevevene følgende infeksjon har en sterk innvirkning på påfølgende sykdomsprogresjon 3,4. Prøvetaking fra underlivet mucosa representerer en stor utfordring og er i det minste delvis ansvarlig for lack av forståelse for immunologi av FGT. Løse gåten om immun dynamikken mellom vert og patogen i sammenheng med den distinkte miljø som er FGT nødvendiggjør effektive metoder for innsamling og analyse av prøver fra denne locale.
Den FGT er delt inn i to deler: den øvre skjede som inkluderer egglederne, endometrium og livmorhalsen, og den nedre kanalen som inneholder ectocervix og skjeden (anmeldt av Kaushic et al 5). Det er fortsatt uklart hva som er den relative bidraget av disse ulike nettstedene til HIV-infeksjon, men det antas at begge områder kunne bidra til HIV oppføring seks. T-celler utgjør 40-50% av leukocyttene i de øvre og nedre forplantningsveiene, mens makrofager utgjør ca 10% (vurdert i Rodriguez-Garcia et al 2). T-celler kan påvises i vagina, cervix og endometrium. Makrofager er sterkere lokaliseringzed i endometriet og myometrial bindevev enn livmorhalsen, selv om de kan påvises i begge vevene. Endelig kan plasmacytoid dendrittiske celler (PDCs) og Langerhans-celler også påvises i FGT vev. Den fenotype og proporsjoner av immun populasjoner og deres mottakelighet for HIV-smitte kan variere viktigere ifølge hormonelle sykluser, bruk av hormonelle prevensjonsmidler, bakteriell vaginose eller seksuelle aktiviteter 5,7-9.
Diverse metoder har blitt utviklet for å studere immun populasjoner og miljø i FGT. Livmorhals biopsi, cervical cytobrushes og cervicovaginal lavages (CVL) 10-12 er den mest brukte over litteraturen. CVL samling av PBS kylling er den enkleste metoden og gjør studiet av immunmodulator proteiner, men resulterer i ekstremt lave celle yield, og er derfor ikke egnet for å studere immuncellepopulasjoner av FGT 13. CVL prøver er, på den annen side, veri nyttig for evaluering av immun miljø av FGT ved å måle ekspresjonen av forskjellige cytokiner, kjemokiner eller antimikrobielle faktorer ved hjelp av metoder så som ELISA, cytokin bead matrise 14 eller massespektrometri 15,16. Karakterisering av immuncellefrekvensene, fenotyper og funksjoner kan oppnås ved å samle cervikale mononukleære celler (CMC) ved cervikal cytobrush eller ved cervikal biopsiprøver.
Cervical biopsiprøver er en invasiv metode som øker ubehaget og risikoen for blødning og tar 2 til 11 dager for å helbrede ved å følge prosedyren avhengig immunstatus til kvinnen 12.. På den annen side, cervikal cytobrushes, til tross for det lavere utbytte av celler samles, er en mindre invasiv og mer praktisk fremgangsmåte for å samle inn immunceller fra FGT. Begge fremgangsmåter kan nå det samme utbytte av CD45 +-leukocytter, men to sekvensielle cervikale cytobrushes er nødvendig for å oppnå den samme mengde av celler inneholdt in en biopsi 13. Likevel gir cytobrush prøvetaking fortsatt et akseptabelt antall celler (ca 5000 CD45 + celler / cytobrush) for ytterligere ex vivo phenotyping av flowcytometri 14. Dessuten kan funksjonelle karakterisering utføres på disse prøvene, som stimulering og intracellulær flowcytometri eller qPCR er blitt utført ved hjelp av cytobrush-avledet CMCs for å identifisere HIV-spesifikke immunresponser 17 eller Th cellepolarisering 18.. Utvidelse av T-celler befolkning kan også legge til rette for funksjonelle studier med CMCs 19.
Det er viktig å merke seg at biopsier og cytobrushes prøve forskjellige deler av FGT. Biopsier er utledet fra den overlegne del av epitel og stroma av ectocervix 12,13, mens livmorhals cytobrushes smake livmorhalsåpningen, samle celler avledet fra epitel av livmorhalsen og antagelig transformasjon sone. Cytobrush prøver derfor prøve en region består av et enkelt lag av columnar epitel, mens biopsier, omfatter et område omgitt av en plateepitel stratifisert epitel fem. Som et resultat, skiller innholdet i leukocytter populasjoner innhentet av cervical biopsi og cytobrush. Biopsier samle en høyere andel av CD3 + T-celler, mens cytobrushes resultere i samlingen av en høyere andel av CD14 + monocytter / makrofager 13.
Å studere immunologi av FGT har vært en interesse i mange år 20-22, og vi har opparbeidet en stor kompetanse med studiet av cytobrush-avledet CMCs. Våre studier fokusere mest på studier av HIV-smittet, infisert og HIV-eksponerte seronegative (HESN) kvinnelige sexarbeidere fra Nairobi, Kenya. HIV fortrinnsvis replikerer i aktiverte T-celler 23 og lavere antall aktiverte celler som kan bli målrettet av HIV i FGT kan bidra til beskyttelse mot HIV oppkjøpet. I tråd med denne hypotesen, flere studies har beskrevet lavere immunaktivering blant HESN sexarbeidere som er spesielt utsatt for hiv likevel forbli infisert 24,25, og denne hvile fenotype er også observert i FGT 14. Her beskriver vi metoden for behandling og vurdering av T-celler aktivering i CMC prøver fra livmorhalsen cytobrushes av ex vivo flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: De forskningsetiske styrene i både University of Manitoba og Kenyatta National Hospital / University of Nairobi godkjent denne studien og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne.
En. Utarbeidelse av Media og CMC Collection Tubes
- Forbered fosfatbufret saltvann (PBS) oppløsning (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na HPO 2 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoklav for sterilitet. Dette kan lagres ved 4 º C i flere måneder.
- Pre-delmengde 5 ml PBS i 50 ml falk tube (én per prøve å samles) og oppbevar ved 4 º C før prøvetaking tid.
- Etiketten 2-4 cryovials eller 1,5 ml mikrosentrifugerør per prøve å samle kylling for lagring.
- Forbered cellevekstmedium: RPMI 1640 + 1% penicillin / streptomycin / amfotericin B (sluttkonsentrasjon 100 enheter / ml, 100 pg / ml og 250 ng / ml, respectivEly, med ingen FCS / FBS lagt.
2. Innsamling av Cytobrush Samples
Innsamling av cytobrush prøver er en non-invasiv prosedyre som må utføres av en erfaren lege eller gynekolog.
- Samle livmorhals mononukleære celler (CMC) med både en cytobrush og et tre-eller plastskrape. Samle CMC fra deltakeren i henhold spekulum eksamen ved å sette skrapen og roterer rundt cervical os (Figur 1). Sett cytobrush inn i endocervikale os, rotere 360 °, og umiddelbart plassere både cytobrush og skrape inn i 50 ml falk rør som inneholder 5 ml PBS.
- Hold prøvene på is / ved 4 º C til behandling. For å opprettholde celle levedyktighet, prosessprøver innen to timer av samlingen.
- Hvis mulig, samle matchet blodprøver i grønn topp heparin vacutainers for perifert blod mononukleære celle (PBMC) isolasjon for å tjene som en komparator / kontroll for CMC analyse.
Tre. Isolering av CMCs
Utfør utvalgets behandling i et biosikkerhet nivå 2 laboratoriet, i en steril biosikkerhet kabinett med doble hansker.
- Under samlingen, kan CMC prøvene bli forurenset med blod. Utelat prøver med synlig blod forurensning fra studien for å hindre forvirrende inkludering av PBMC i den endelige prøven. På grunn av lavt antall lymfocytter isolert fra CMC prøver, kan mindre blodsmitte lett overvelde CMC lymfocytt komponent.
- Vortex falk rør som inneholder både cytobrush og skrape for 45 sek å distansere celler fra børstene. Prøver kan bli skummende under denne prosessen; dette er normalt.
- Bruk cytobrush å skrape eventuelle gjenværende materialet av skrapen, og kast den skraper i et blekemiddel løsning. Å samle noen celler gjenværende festet til børsten / skrape, bruk en frisk hanske å presse skrapen mellom tommel og pekefinger.Gli ned børsten, slik at cellene og PBS for å bli samlet i det samme 50 ml tube. Kast cytobrush inn et blekemiddel løsning, og kast hanske.
VIKTIG: Bruk en ny hanske for hver prøve. - Monter en 100 pm nylon celle sil til en frisk 50 ml Falcon-røret. Ved hjelp av en overførings pipette, samle PBS-cellesuspensjonen fra prøverøret og filtrere gjennom silen inn i det friske rør.
- Tilsett 5 ml av RPMI 1640 til den originale prøverøret. Ved hjelp overføringspipetten, vaskes sidene av prøverøret med RPMI og overfører gjennom filteret til den nye prøverør. Vask bunnen av nylonfilter med RPMI også.
- Sentrifuger prøvene i 10 min ved 514 x g. Det er avgjørende å forlate sentrifugen bremsen under denne operasjonen, for å hindre løsner CMC pellet.
- Fjern forsiktig supernatanten fra røret, ta vare å ikke forstyrre pelleten. Pellet størrelse vil være svært variabel; i såme prøver, er det pellet ganske stor på grunn av tilstedeværelsen av et stort antall epitelceller, mens det i andre tilfeller er det pellet knapt synlig og meget gjennomsiktig.
- Resuspender pelleten ved forsiktig omrøring av Falcon-røret. Tilsett 5 ml PBS å vaske prøven.
- Sentrifuger på nytt i 10 min ved 514 x g uten sentrifuge bremsen.
- Forkaste nøye supernatanten og re-suspendere pellet som ovenfor. Cellene er klar for enten nedfrysing (ved hjelp av en PBMC nedfrysing protokoll), stimulering eller flowcytometri phenotyping.
4. CMC Surface Farging og flowcytometri
- Resuspender pelleten fra trinn 3.10 i 100 ul blokkeringsløsning og overføre enten inn i en 96-brønns plate og FACS-røret. Den blokkerende løsning (for å blokkere Fcγ reseptorer) oppskrift er som følger: 1.8 mL mus IgG (sluttkonsentrasjon 0,2 pg / pl), 5 pl FBS og 93,2 pl FACS vaske (PBS + 2% FBS).Farging kan utføres i en 96 brønners plate hvis pelletsstørrelse er liten nok, men kan trenge å bli utført i FACS-rør hvis pellets er rutinemessig store. Det er viktig å titrere antistoffer tilsvarende.
- Blokker prøvene i 10 min på is / ved 4 ° C.
- Vask cellene med 100 ul FACS Wash (PBS + 2% FBS) i 96-brønners plater, eller 500 pl i FACS-rør. Sentrifuger ved 600 xg i 10 min ved 4 ° C med bremsen på lav (eller av, hvis en lav bremse-innstillingen er ikke tilgjengelig).
- Fjern supernatanten og re-suspendere cellepelleten ved omrøring. Legg levedyktighet Stain (Live Døde fikses levedyktighet fargestoff). Forbered levedyktighet fargestoff i henhold til produsentens instruksjoner. Det kan være nødvendig å titreres til bruk i hver lab / cytometer oppsett. Inkuber i 30 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellene 100 μl/500 mL PBS (for 96-brønners plate / FACS rør). Sentrifuger ved 600 xg i 10 min med lav / ingen brems. Fjern overståendet og resuspender celler.
- Inkuber cellene med en cocktail av overflatemerke antistoffer, i et totalt volum på 100 ul. VIKTIG: Optimaliser og titrere hver flowcytometri panel før prøve farging. Inkuber cellene i 30 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Gjenta trinn 4.5. Hvis fargingen i en 96-brønners plate, overføre cellene til en FACS rør og fortynn til et endelig volum på 750 pl FACS Wash inneholdende 1% paraformaldehyd (PFA) (eller CytoFix, fortynnet 1 i 4). Fortsett til datainnsamling på et flowcytometer.
5. Innsamling og klargjøring av livmorhals Vaginal Lavage (CVL)
- Før cytobrush prøvetaking, bruk en sprøyte for å vaske endocervix med 2 ml sterilt PBS og aspirer lavage fra bakre fornix.
- Samle den aspirerte lavage prøven i en 15 ml falk rør og holde på is / ved 4 º C til behandling.
- Sentrifuger prøven ved 400 xg for 7 min for å fjerne mobilnettet rusk.
- Collect supernatanten, aliquot av prøven i 1 ml eller 500 pl aliquoter og lagres ved -70 ° C. Aliquoter kan tines for ELISA eller perle rekke analyse av CVL proteiner, men unngå flere fryse / tine sykluser.
- Dersom det er ønskelig, resuspender pellet av mobilnettet rusk i RNA Senere å måle RNA uttrykk ved å følge produsentens protokoll.
6. Data Acquisition
- Forbered et sett med kompensasjon rør som matcher antistoff panel. Kjør kompensasjon rør for å justere spektral overlapping. Kjør prøvene på en hvilken som helst flerfarget flowcytometer som er konfigurert for fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer anvendt i panelet.
- Skaff et PBMC prøve først for å justere Forward Scatter (FSC) og sidespredning (SSC) spenning for å oppdage lymfocyttpopulasjonen. Prøv å holde dem på 100 på hver akse på en lineær skala. Kjøre en PBMC kontroll vil gjøre det betydelig enklere å finne CMC lymfocyttpopulasjonen.
- FSC terskelen for CMC prøver kan være nødvendig å øke i forhold til PBMC prøver på grunn smøre opp SSC aksen ved lave FSC verdier.
- Vortex hvert rør før du henter. Erverve hele røret for å maksimere antall lymfocytter gate hendelser samlet. Overvåke maskinens nøye for å unngå tilstopping.
- Eksportere dataene til en flowcytometrisk analyseprogram som FlowJo.
7. Gating Strategi
- Velg Videre side scatter høy (FSC-H) / Forward side scatter område (FSC-A) for å bestemme sing befolkningen.
- Velg Tid versus fluoriserende fargestoff (som eksempel FITC) til å kontrollere for kvaliteten på kjøpet. Endring i strømningshastighet kan innføre gjenstander i dataene. Utelukke ethvert område som viser avvik i strømningshastighet.
- Identifiser lymfocyttpopulasjonen på SSC-A/FSC-A tomten. Bruk en PBMC kontroll for å lette identifiseringen. Legg merke til at CMC lymfocyttpopulasjonen kanskje ikke like klart som PBMC kontroll. </ Li>
- Gate på SSC-A/viability dye å utelukke døde celler fra levende celler. Døde celler kan ikke-spesifikt omfatte antistoffer, som vil innføre artifakter.
- Gate på SSC-A/CD3 for å identifisere T-celle-populasjonen. Fra denne porten, identifisere CD4 + og CD8 + populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multiparameter flowcytometri er et kraftig verktøy for å dissekere fenotyper og funksjoner av celle undergrupper i tidligere uncharacterized vev. Analyse av CMC prøver kan gi informasjon om både lymfocytter og monocytter populasjoner med passende gating strategier.
En representativ CMC gating strategi, sammenliknet med en PBMC-profil, er vist i figur 2.. FSC-A versus FSC-H plott muliggjør utelukkelse av celle dubletter, som er svært utbredt i CMC prøvene sammenlignet med PBMC, selv etter filtrering (Figur 2A). Kvalitetskontroll omfatter fjerning av flow problemer med gating på gang, der endringer i strømningshastighet eller gjenstander som følge av utvalgs klumper kan lett identifiseres (figur 2B). Identifikasjon av lymfocytt / monocytt populasjoner er relativt lik i begge PBMC og CMC prøver (figur 2B). Utelukkelse av døde celler ved levedyktighet fargestoff hindrer inkluderingav apoptotiske celler som er ikke-spesifikt opptas fluorescerende antistoff-konjugater. Levedyktighet er lavere i CMC prøvene sammenlignet med PBMC, og kan være meget variabel fra prøve til prøve (figur 2B).
Denne analysen vil fokusere på fenotyping T lymfocyttpopulasjonen, men CMC prøvene inneholder også monocytter. Etter gating på monocytt populasjon, er celler gated basert på et levedyktighet fargestoff og en tømmekanal (figur 3A). Den dump kanalen inneholder antistoffer mot CD56, CD3 og CD19, og gating på dump kanal-negative celler vil eliminere eventuelle lymfocytt forurensning i monocyte befolkningen. Cellene kan deretter bli identifisert basert på ekspresjonen av markører slik som CD16 og CD11c. CD3 +-lymfocytt-populasjon er vanligvis redusert i forhold blant CMC forhold til PBMC (figur 3B, tabell 1). Den høye andelen av epitelceller, granulocytter og ikke CD3 + CD45 + leukocytter som finnes i CMC prøvene dominates over T-celle-populasjonen. CD4 + T celler (median: 55.30%, IQR: 50.53% -68,18%) og CD8 + T-celler (median: 25.60%, IQR: 21,50% -33,80%) er funnet på et lavere ratio (nærmere 02:01 blant CMC) sammenlignet med 05:01-forhold observert blant friske PBMC prøver fra den kommersielle sex arbeideren kullet i Kenya (figur 3C, tabell 1). Som i blodet, virker HIV-infeksjon proporsjoner av CD4 + og CD8 + T-celler blant CMC, redusere CD4 +: CD8 +-forhold på 0,7 (median: 0,7, IQR: 0,31 til 2,45) (figur 3C, tabell 1). Imidlertid er det ikke uvanlig å observere en høyere andel av CD8 + T-celler blant CMC befolkninger fra friske individer (figur 3C). Interessant nok en utvidet CD4-CD8-(dobbel negativ, DN) T-celle-populasjon i forhold til PBMC DN T-cellefrekvens kan observeres hos mange CMC prøver av HIV-negative individer (tabell 1). Disse resultatene er lik de som ble oppnådd for prøvene 26 forhud, selvugh disse cellene er dårlig karakterisert.
Typiske T celle fenotypiske markører er lett tallfestes blant CMCs men kan avvike fra PBMCs; Figur 4 viser identifisering av en CD8 + CD161 + + (MAIT) befolkning som er tydelig i PBMCs men nesten fraværende i CMCs (Figur 4A). Uttrykk for aktivering markører CD69 og HLA DR, migrasjon markør CCR5 eller utmattelse markør PD-en kan tydelig identifiseres på CD4 + eller CD8 + populasjoner (Figur 4B).
Kvantifisering av konsentrasjonen av cytokiner / kjemokiner CVL kan analyseres parallelt med CMC farging. Dette gjør det mulig for korrelasjon mellom CVL cytokin miljøet (pro-inflammatorisk versus immunoregulatory) og fenotype av CMCs. Disse dataene kan også bli brukt for å bestemme om frekvensen av chemokine receptor expression on CMCs er relatert til den relative ekspresjon av enten plasma eller CVL kjemokiner 14. Tabell 2 </ Strong> viser gjennomsnittlig konsentrasjon av cytokin og chemokine analytter i CVL samlet fra friske kvinner og analysert av Milliplex cytokin perle array-kits.
Figur 1. Anatomy av den kvinnelige skjede. A) Tverrsnitt av den kvinnelige skjede, som viser forholdet mellom vagina til den eksterne cervical os, cervical kanalen og livmorhulen. B) Front vinkel visning av livmorhalsen, som viser de eksterne os, og den fremre og bakre fornix regioner på 12:00 og 06:00, henholdsvis. Gjengitt med tillatelse fra Reusch et al 27. Den cervikale skraper roteres rundt livmorhalsåpningen til samle CMC, mens cytobrush er satt inn i cervixkanalen og roteres for å samle inn ytterligere CMC. Cervical vaginal lavages (CVL)oppsamles ved vasking av endocervix med PBS og samle den fra den bakre fornix.
Figur 2. Gating og kvalitetskontroll av CMC prøver. A) Identifisering av singlets etter FSC-A versus FSC-H tomten demonstrerer den lave prosentandelen av singlets i CMC prøvene sammenlignet med PBMC prøvene, selv etter filter-baserte CMC isolasjon. B) Eksempler på prøvene høy og dårlig kvalitet er vist for flere kvalitets kontrollmåten. Gating of Time versus fluorescens (eller SSC / FSC) kan identifisere mengdespørsmål og brukes til å ekskludere hendelser som kan føre til flekker gjenstander. En lymfocyttpopulasjonen basert på FSC versus SSC kan eller kan ikke lett identifiseres avhengig av prøven. Inkludering av en levedyktighet fargestoff er avgjørende, da enkelte prøver kan inneholde færre enn 50% levedyktige celler. Viability (amin-reaktive fargestoffer) flekke døde celler klarere enn levende celler, som tap av membranintegritet ved celledød lar fargestoffet til å få tilgang til amingrupper på proteiner i cellen. Levedyktige celler er derfor identifisert av gating på levedyktighet dye-negativ befolknings.
Fig. 3. Identifisering av T-celle-undersett. A) Et CD3 + populasjonen mellom CMC prøver er vanligvis en mindre andel av lymfocytt-porten i forhold til PBMC prøver. CMC prøvene er også mer variabel i størrelse på T-celle-populasjon, som vist. B) CD4 +, CD8 + og CD4-CD8-T-celle-populasjoner er lett identifiseres i både CMC og PBMC prøver. CD4: CD8 T-celle-forhold, kan variere fra prøve til prøve blant CMCs, som vist. Viste data ble samlet inn fra HIV-uinfiserte kvinner.
Figur 4. T celle fenotyper i CMC prøver. A) Den slimhinnene forbundet invariante T-celler (MAIT) CD8 + CD161 + + befolkning som er lett identifiseres i PBMC prøvene er nesten helt fraværende i CMCs. De CD8 + CD161 + T celler kan identifiseres i begge prøvene. B) CMCs utstillings uttrykk for fenotypiske markører inkludert CD69, HLA DR, CCR5 og PD-1. Gates ble trukket basert på fluorescens minus én (FMO) kontroller. Viste data ble samlet inn fra HIV-uinfiserte kvinner.
| CMCs | PBMC | |||||
| Befolkning | HIV + (n = 34) | HIV-(n = 44) | P-verdi en | HIV + (n = 28) | HIV-(n = 35) | P-verdi en |
| median (IQR) | median (IQR) | median (IQR) | median (IQR) | |||
| % Live-lymfocytter | 85,65 (60.25-92.63) | 88,70 (74.85-95.38) | 0,1193 | - | - | |
| % CD3 + i levende lymfocytter gate | 5,94 (0,90 til 16,80) | 1,44 (0,39 til 8,46) | 0,0303 | 41,15 (17.08-62.10) | 41,90 (20.40-51.30) | 0,4231 |
| p-verdi b | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| % CD8 + i CD3 + gate | 43,20 (25.75-66.00) | 25,60 (21.50-33.80) | 0.001 | 30,05 (22.75-38.78) | 14,60 (8.01-24.80) | <0.0001 |
| p-verdi b | 0,0291 | <0.0001 | ||||
| % CD4 + i CD3 + gate | 31,10 (20.45-63.10) | 55,30 (50.53-68.18) | 0.0003 | 56,10 (50.10-61.28) | 77,20 (65.90-92.80) | <0.0001 |
| p-verdi b | 0.002 | <0.0001 | ||||
| Ratio CD4: CD8 | 0,71 (0,31 til 2,45) | 2,09 (1,55 til 3,01) | 0.0003 | 1,92 (1,44 til 2,39) | 5,34 (2,66 til 10,77) | <0.0001 |
| p-verdi b | 0.004 | <0.0001 | ||||
| % DN i CD3 + gate | 10,40 (6.36-14.30) | 10.70 (6,76 til 19,10) | 0,4793 | 9,58 (6.65-15.98) | 7.01 (05.26-08.07) | 0,0032 |
p-verdi | 0,8338 | 0,0006 | | ||||
Tabell 1. Relative proporsjoner av T celle undergrupper i CMCs og PBMC. CMCsamples fra 44 HIV-negative og 34 HIV-positive kvinnelige sexarbeidere og PBMC prøver fra 35 HIV-negative og 28 HIV-positive ble sammenlignet for sin relative andel av levende celler, CD3 + T-celler og CD4 +, CD8 + og CD8-CD4-DN T celle undergrupper. Data er presentert som median (25 th -75 th interkvartile, IQR). Forskjeller mellom gruppene ble beregnet ved Mann-Whitney test. p-verdiene indikerer resultatet av en sammenligning mellom en HIV + og HIV-eller b-CMC og PBMC data.
| Analytt | Bety en (Std dev.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35,5 (90,6) | 2,9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2,7 (6,3) | 0,8 |
| Fractalkine | 51,6 (69,5) | 10.6 |
| IFN-a2 | 24,0 (12,0) | 40.6 |
| IFN-g | 3.9 (14.2) | 0,3 | IL-1a | 268,4 (721,3) | 6.4 |
| IL-1b | 46,8 (126,2) | 0,7 |
| IL-1ra | 4967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0,9 (2,6) | 0.6 |
| IL-6 | 14,8 (30,5) | 0,7 |
| IL-7 | 6.3 (10.1) | 0,1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0,3 |
| 4,5 (8,6) | 0,5 | |
| IL-15 | 1,4 (2,7) | 0,7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0,3 |
| IP-10 | 381,4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129,4 (340,4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5,9 (7,1) | 3.7 |
| MDC | 84,2 (94,6) | 6,9 |
| MIP-1a 20,9 (28,9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28,5 (42,6) | 8.9 |
| sCD40L | 10,8 (19,3) | 9 |
| sIL-2ra | 8,4 (9,8) | 7.7 |
| TNF-a | 1,9 (4,1) | 0,1 |
Tabell 2. Expression av cytokiner og kjemokiner i CVL. Prøver fra 51 HIV-uinfiserte (ikke-HESN) deltakere i den kvinnelige sex worker kohort på midten av menstruasjonssyklusen ble analysert for cytokin / chemokin konsentrasjon bruker Milliplex MAP Menneskelig cytokin / Chemokine perle matrisesett i henhold til produsentens'S natten protokollen, analysert i duplikat. IFN: interferon; MCP: monocyte kjemotaktisk protein; MDC: makrofag avledet kjemokiner, s: løselig; TNF: tumor nekrose faktor; MIP: makrofag inflammatorisk protein; ITAC: interferon inductible T celle alpha kjemotiltrekkende; MIG: monokine indusert av gamma-interferon; IP-10; interferon inductible protein. a Verdier under deteksjonsgrensen ble tildelt en verdi av en halv deteksjonsgrensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gitt de store kunnskapshull med hensyn til immunitet på det kvinnelige kjønnsorgan (FGT), kan fenotypeanalyser av CMCs tilby et bredt spekter av innsikt i flere lymfocyttpopulasjoner på livmorhalsen. Sammen med proteomikk analyser og virusmengde målinger i cervical kylling, kan immunitet mot seksuelt overførbare infeksjoner (SOI) s og andre patogener bli dissekert i ulike populasjoner.
Tekniske hensyn - CMCs: Isolering og vellykket farging av CMC prøvene kan være utfordrende. Optimalisering av CMC samling protokollen har vekt effektiviteten av oppsamling av CVL først, etterfulgt av cervical skraper og deretter endelig cytobrush. Det er viktig å øke planlagte eksempelstørrelser sammenlignet med dem som beregnes for perifere blod studiene på grunn av den økte sannsynligheten for prøven utelukkelse av forskjellige grunner, som omtales nedenfor.
Testing av ønsketd flyt panel på CMC prøvene er kritisk før studiestart innvielse. Det er viktig å overvåke celle autofluorescence i CMC prøver, spesielt i monocyte gate. CMC autofluorescence i noen kanaler kan være forhøyet i forhold til PBMCs, noe som kan påvirke gating og signal-til-støy-forhold. Videre bør optimale spenninger bli bekreftet for CMC prøver hvis tidligere bestemt på PBMC prøver.
For å bevare dataintegriteten, er det viktig å utelukke prøver med blodsmitte eller confounding kjønnssykdommer. Inkludering av en cellelevedyktighet fargestoff i flowcytometri panelet er viktig å ekskludere døde celler som ikke-spesifikt tar opp fluorescerende antistoffer. Mens de fleste prøver er meget levedyktig, er det ikke uvanlig å utelukke 10-20% av cellene ved levedyktighet fargestoff. Hvis subset analyse basert på CD4-og CD8-ekspresjon er planlagt, er det viktig å oppnå minst 100 CD3 +-arrangementer for å fortsette analysen. Prøvene samlet fra forskjellige kvinner, og til og med fra samme kvinne en t ulike tidspunkt, kan gi svært ulike celle tall 13.
Flowcytometrisk analyse av slimhinne lymfocytter er ofte enklere og mer vellykket hvis en PBMC kontrollutvalget kan kjøres samtidig med CMC prøvene. I noen CMC prøver, er det lymfocyttpopulasjonen vanskelig å identifisere ved FSC / SSC gating, men inkludering av PBMC prøven vil gi et bedre inntrykk av hvor du skal gate. Selv i prøver uten en klar lymfocytt FSC / SSC befolkningen, kan distinkte CD3 + populasjoner bli identifisert. Hvis datainnsamlingen er avbrutt av tekniske problemer (cytometer inntak tilstopping, bobler, etc.) gating på fluorescens over tid kan fjerne datainnsamling gjenstander samtidig gir analyse av prøver. Hensiktsmessige kontroller som fluorescens minus én (FMO) rør for gate plassering kan trenge å bli utført på perifere mononukleære blodceller (PBMC) når antall celler som kreves er for stor til å bruke cytobrush prøver.
ontent "> Flere studier har demonstrert påvisning av antigen-spesifikke T-celleresponser hos CMC prøver. kan CMC cytokinproduksjon også bli indusert av PMA / Ionomycine, PHA, IFNγ og anti-CD3-stimulering. En av de store begrensningene av CMC er stimuler celle nummer, noe som reduserer antall av tilstander og styringer som kan utføres per prøve. Det er også viktig å nøye overvåke og ta ekstra forholdsregler for å forebygge cellekultur forurenset. The genital tract er ikke et sterilt område, og i noen tilfeller ekstra antibiotika må legges til kultur media for å hindre bakterievekst. Selv om CMCs, kan fryses ned med lite tap av levedyktighet, er utvinning ca 50%, noe som gjør cryopreserved prøver dårlige kandidater for stimulering studier med mindre celle utvidelse er planlagt 10.Tekniske hensyn - CVLs: Innsamling av CVL vanligvis resulterer i begrenset prøve volume, hindrer analyse av et stort antall av proteinkonsentrasjonen ved gjentatt ELISA. En alternativ analyse er cytokin vulsten array, basert på Luminex plattform eller Flow Cytometry plattformen. Multipleksede sett er tilgjengelige fra flere kommersielle kilder, noe som muliggjør kvantifisering av opp til 30 analytter i et ekstremt lite prøvevolum (ofte ~ 25 mL). Optimalisering av disse analysene har avdekket optimal påvisning av analytter ved hjelp av natten inkubasjon protokollen. Noen analyser som er detectible i plasma / serumprøver er ikke detectible i CVL. Spesielt, konsentrasjon av CVL prøver ved hjelp av spinnkolonner ble ikke bedre deteksjon av eventuelle analyser, noe som tyder på at det er ingen fordel å prøve konsentrasjon før du kjører perle rekke analysen.
Confoundere spesifikke for genital slimhinne: Studier av FGT immunologi må passe på å erkjenne og utgjøre så mange konfunderende variabler som mulig. Menstruasjonssyklusen hsom nå blitt demonstrert å påvirke perifert blod immunitet 28, og utøver større sannsynlighet for påvirkning av CMC fenotype og cellesammensetning samt proteiner samlet fra CVL prøvene 29. Synkronisere prøvetaking til menstruasjonssyklus fasen er den foretrukne måten å redusere data variasjon, både målt ved østrogen / progesteronnivåer eller dager siden den første dagen av siste menstruasjon. Bruken av hormonell prevensjon også i stor grad påvirker slimhinnene miljøet og dens effekt bør tas i betraktning når man designer eller analyse av en studie. Endring av vaginal flora resulterer i bakteriell vaginose (BV) endrer også immun miljø og cellulære fenotyper. BV kan diagnostiseres ved gramfarging og en Nugent poengsum kan bli etablert for å kontrollere for confounding effekten av BV.
Seksuell aktivitet har også en betydelig innflytelse på genital immunologi, siden allo-svar på sæd kan indusere raske og dramatiske endringer i cell fenotype og trafficking. Faktisk Lajoie et al. har beskrevet forskjeller i CVL proteinsammensetningen mellom sex worker og ikke-sex worker populasjoner, med endringene som skjer i de første årene etter oppstart av sex arbeid.
Til slutt, vil kulturelle praksiser som skylling innføre ytterligere variasjon i slimhinnene prøvetaking. Avhengig av reagens som brukes (blekemiddel, detergent, limejuice, etc.), kan douching redusere hyppigheten / fenotypen av cellepopulasjoner, eller alter autofluorescens sammenlignet med andre prøver. Ideelt sett bør skylling før cytobrush prøvetaking motet blant giverne.
Fremtidige søknader: I tillegg til har gitt viktig innsikt i regulering av mucosal immunitet under menstruasjons / hormonelle variasjoner, viral / bakteriell infeksjon og før / etter overgangsalderen, er særlig relevant for vaksinestudier mot SOI / slimhinne patogener analyse av slimhinneprøver. I tilfellet med HIV,hvor et hovedmål med vaksinestudier er å lokke fram en slimhinne antistoff eller T celle respons, vil utvikling av CMC-baserte analyser spille en avgjørende rolle i å bestemme korrelater for beskyttelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
