Introduction
وبكتيريا كلوستريديوم البوتولينوم تنتج عصبي البوتولينوم، واحدة من السموم البيولوجية أقوى لرجل معروف 1. هناك 7 عترات متميزة بونت (بونت / AG). بونت / A-غال لحث الشلل في الوصل العصبي العضلي بسبب كمين التحلل البروتيني المعقد 2،3. فخ التحلل البروتيني يمنع العصبي-حويصلة الغشاء الانصهار، وبالتالي كتل العصبي إيماس 4. الهدف كمين محدد يعتمد على المصلي بونت معين المشاركة في عملية التسمم. بونت / A وبونت / E يلتصق SNAP-25 بينما يشق بونت / C كلا SNAP-25 و syntaxin 5. الأنماط المصلية المتبقية synaptobrevin يلتصق (وتسمى أيضا الحويصلة يرتبط البروتين غشاء (VAMP). وقد تم اختيار بونت / A للتنمية الفحص كما أنها مسؤولة عن نسبة عالية من التسمم الغذائي التي تحدث بشكل طبيعي ولها أطول مدة العمل 6. تطوير جزيء صغير علاجات ضد بونت / A هو هدف رئيسي لوقد استخدمت لدينا برنامج اكتشاف الأدوية والأساليب التقليدية القائمة على الهدف لتحديد الموقع مثبطات بروتين نشطة 7، 8-10. ومع ذلك، فإن خلق مثبطات الموقع النشطة مع النشاط واسع الطيف ضد الأنماط المصلية متعددة وفعالية بعد التعرض المحتمل أن يكون تحديا.
لذا قمنا بتنفيذ نهج مبتكر اكتشاف المخدرات المظهري يستخدم الانقسام بونت SNAP-25 بمثابة نقطة النهاية وظيفية للتعرف على الجزيئات الصغيرة التي يمكن منع بونت بوساطة تسمم الخلايا العصبية الحركية. مطلوب SNAP-25 لإطلاق الناقلات العصبيه، وتدهور SNAP-25 هو التنبؤية من الشلل والفتك في الجسم الحي. على سبيل المثال، يمكن فحص خلية القاعدة يؤدي إلى اكتشاف جهري جديدة من العوامل الخلوية المسؤولة عن تثبيط سموم أو تثبيط مسارات السم داخل الخلايا المستهدفة. عاملا مهما في تطوير الفحص المظهري هو اختيار النماذج البيولوجية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. Wووصف البريد وغيرها الماوس الجذعية الجنينية (ES) المشتقة من الخلايا العصبية الحركية الخلية التي تلخص الطابع المناعية من الخلايا العصبية الحركية الأساسية، بما في ذلك التعبير عن SNAP-25 11- 13. الأهم من ذلك، هذه الأنظمة الخلوية حساسة للغاية لبونت / A التسمم وتظهر تعتمد على الجرعة الانقسام من SNAP-25 في استجابة لزيادة تركيز السم 11،12. ويتم إنتاج الخلايا العصبية الحركية متباينة أيضا في الكميات التي تكفي لوحة إنتاجية عالية التحليل القائم ويسمح تصميم مجموعة من المقايسات الخلوية.
الفحص المظهري هو طريقة المناعي باستخدام اثنين من الأجسام المضادة متميزة لقياس الانقسام من التطور الطبيعي وأعرب كامل طول SNAP-25 خلال بونت / A التسمم الثقافة الماوس الخلايا العصبية الحركية. وهناك محطة الكربوكسيل بونت / A (باكس) الأجسام المضادة الحساسة للانشقاق الوحيد الذي يعترف كامل طول SNAP-25 تتيح تقييم بونت / A بوساطة التحلل البروتيني من SNAP-25التعبير في الخلايا العصبية الحركية الماوس 10. ويصور رسم تخطيطي للمقايسة HCI في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لوحة الماوس 20،000 متباينة خلايا ES (MES) / جيد في 96 بولي D يسين المغلفة لوحات جيدة والحفاظ على الخلايا العصبية الحركية في وسائل الإعلام محطة التمايز لمدة 5-7 أيام.
1. إدارة المجمع والتسمم مع بونت / A
تنفيذ كافة الأعمال التالية في الضميمة BSL2 للحفاظ على الامتثال للمبادئ التوجيهية CDC / المعاهد الوطنية للصحة.
- إعداد 10 ملم حلول المخزون من كل مجمع المكتبات في DMSO 100٪ البولي بروبلين في 96 لوحات جيدة. استخدام الأسهم 10 ملم لإعداد لوحة التخفيف الوسيطة التي هي 10 أضعاف أكبر من تركيز الفحص المطلوب. إعداد 100 أوقية لوحة المتوسطة من خلال الاستغناء عن 10 ملي الأسهم في لوحة 96-جيدا وتمييع إلى 100 أوقية باستخدام وسائل الإعلام الثقافة. الاستغناء عن 10 ميكرولتر من المركبات إلى 90 ميكرولتر من وسائل الإعلام على الخلايا 11. اختبار المركبات في 10 أوقية التركيز النهائي وضمان النسبة النهائية للDMSO لا تتجاوز 0.5٪.
- أداء جميع عشيقالمنشأ التي تستخدم الخلايا الحية والسم نشطة تحت مستوى السلامة الحيوية 2 الظروف. استبدال وسائل الإعلام القديمة في لوحات 96-جيدا مع 80 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز محطة جديدة باستخدام دليل ماصة 12 قناة. تنفيذ الطموح والاستغناء خطوات الصفوف لتجنب التعرض للخلايا دون وسائل الإعلام إلى الهواء المحيط.
- يمهد للمعالجة الخلايا مع المركبات قبل تطبيق السم من قبل إضافة 10 ميكرولتر من 10X المركبات من لوحة مصدر باستخدام ماصة 12 قناة، تليها خلط بواسطة طموح (مرتين). عن كل لوحة 96-جيدا، علاج عمودين من 6 آبار مع 10x DMSO مخففة في وسائل الإعلام لخدمة إشارة عالية كما والضوابط إشارة منخفضة. العمود دون علاج بونت يسلك أعلى مستوى من كامل طول SNAP-25 (السيطرة إشارة عالية). علاج العمود الآخر مع بونت وحدها (دون مركبات)، وسيطرة إشارة منخفضة. استخدام جهاز التحكم منخفضة لمراقبة كفاءة بونت الانقسام من SNAP-25 والكشف مع الأجسام المضادة باكس (الشكل 2).
- احتضان الخلايا مع المركبات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 6٪ CO 2 في حاضنة ثقافة الخلية.
- إعداد البوتولينوم عصبي ومن 1 ملغ / مل مصدر تجاري في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى النهائي 10X الأسهم عن طريق تمييع العمل مع وسائل الإعلام التمايز النهائي.
- بدء التسمم عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 10X بونت / A الأسهم في الآبار المخصصة لضوابط العلاج وإشارة منخفضة باستخدام ماصة الأقنية (الشكل 2). علاج الآبار تسمى تحكم عالية مع وسائل الإعلام وحدها.
- تطهير جميع الأدوات والمستهلكات البلاستيكية الأخرى التي تأتي في اتصال مع بونت / A خلال الدراسة عن طريق الغمر في محلول هيبوكلوريت 0.825٪ في الماء لمدة 20 دقيقة على الأقل. تنفيذ كافة الإجراءات في خزانات السلامة البيولوجية وتطهير مناطق العمل قبل وبعد التجارب مع 5٪ المنظفات المطهرة نظافة مثل حل MicroChem سواء.
- لوحات تسمية واضح للدلالة على استخدام السموم وincubأكلوا لوحات تعامل مع 1 نانومتر / L بونت / A لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية و 6٪ CO 2 في حاضنة ثقافة الخلية. عرض لافتات مناسبة لإطلاع الزملاء أن السم هو في استخدامها في المختبر.
- توقف بونت / A انشقاق بروتين بواسطة الميثانول التثبيت. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على السم والمركبات من كل بئر مع ماصة الأقنية وتجاهل في 10٪ محلول التبييض. إضافة الميثانول الجليد الباردة (100 ميكرولتر) مباشرة إلى كل بئر.
- احتضان لوحات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) للسماح تثبيت تحدث.
- بعد التثبيت، التعامل بأمان الكواشف التخلص منها (يعتبر تحييد) مع مستوى السلامة الأحيائية 1 البروتوكولات وتجاهل وفقا لذلك.
- تجاهل الميثانول واستخدم 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا وترطيب عليها قبل المناعية. أداء اثنين من يغسل PBS إضافية.
- بعد غسل النهائي، وترك في برنامج تلفزيوني في الآبار، لوحات ختم مع فيلم صفيحة ميكروسكوبية لاصقة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى التحليل. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية FOص عدة أيام.
2. المناعية
الإجراء المناعية هو، عملية متعددة الخطوات كثيفة العمالة التي تضم المتكررة كاشف دورات الاستغناء / نضح وغسل لوحة واسعة النطاق التي يمكن أن تؤدي إلى إدخال المحتمل لتقلب الناشيء داخل وinterplate كبير. يتم تطبيق نهج شبه الآلي لتوفير وقت العاملين في المختبرات، وزيادة الإنتاجية الفحص، وتقليل التباين المناعية.
- استخدام محطة العمل الآلية مجهزة رأس 96-جيدا قادرة على نقل كميات تصل إلى 250 ميكرولتر ومتكاملة مع الذراع الروبوتية القابض للتحرك معدات المختبرات في مواقع مختلفة على سطح السفينة وحدات (انظر المواد والمعدات) لهذا البروتوكول.
- تم تصميم السفينة وحدات لاستضافة أنواع مختلفة من معدات المختبرات ويمكن دعم ما يصل إلى 11 البنود في أي وقت واحد. تم تجهيز معالج صفيحة ميكروسكوبية الآلي مع مجلة مزدوج صفيحة ميكروسكوبية المعبئ من أجل عقد والتعامل مع ما يصل إلى 50 لوحات في كل دورة.
- وتقع محطة العمل الآلية من داخل مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية مصممة لمعدات التشغيل الآلي لتوفير مختبر العقم والسلامة. لالمناعية الآلي، يتم ترتيب سطح السفينة كما هو مبين في الشكل (3) لتمكين الوصول كاشف حسب الحاجة ودون تدخل بشري.
- لوحات ما قبل الحمل التي تحتوي على خلايا ثابتة في مجلة وحة ونقلها إلى سطح السفينة حسب الحاجة لعمليات معالجة السائل. استخدام رأس 96 ماصة مزودة 250 نصائح ميكرولتر لنضح PBS من الآبار وصولا إلى 10 ميكرولتر. Permeabilize الأغشية الخلوية لتسهيل الأجسام المضادة ملزمة لأهداف داخل الخلايا مع العازلة permeabilization (0.1٪ تريتون X-100). الاستغناء عازلة permeabilization (100 ميكرولتر) إلى كل بئر قبل ان يعود لوحات لمجلة تخزين الثانية من المعبئ صفيحة ميكروسكوبية لاحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إزالة العازلة permeabilization وPErform لوحة الغسيل مع برنامج تلفزيوني (مرتين) كما هو موضح سابقا في الخطوة 1.13.
- بعد الخطوة غسل الماضي، إزالة برنامج تلفزيوني العازلة والاستغناء عن 100 ميكرولتر من عرقلة العازلة التي تحتوي على 1٪ مصل الحصان و 0.1٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني في جميع microplates قبل إعادتهم إلى لوحة مجلة 1hr حضانة في RT.
- استخدام اثنين من الأجسام المضادة المناعية الأولية لل: الأرنب بولكلونل مكافحة فأر BACS الأجسام المضادة، للكشف عن كامل طول SNAP-25 وحيدة النسيلة الماوس مكافحة III تويولين الأجسام المضادة للكشف عن الخلايا العصبية (انظر المواد والمعدات). بعد 60 دقيقة من الحضانة، وإزالة عازلة تمنع والاستغناء عن 50 ميكرولتر من 4ug / مل من BACS الأجسام المضادة و 0.5 ميكروغرام / مل من III-تويولين في منع عازلة في جميع اللوحات.
- احتضان ل1hr في RT إزالة الأجسام المضادة الأولية ويغسل 3 مرات مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.05٪ توين (PBST).
- استخدام مفتش مكافحة الماوس المسمى مع اليكسا فلور 647 لتصور والثاني والثالث تويولين والمضادة للأرنب مفتش الموسومة ب اليكسا Fluor 568 لتصور الأجسام المضادة BACS. إعداد الأجسام المضادة على حد سواء باعتبارها 2 ميكروغرام / مل في تخفيف حظر العازلة والاستغناء عن 50 ميكرولتر من الخليط في كل بئر.
ملاحظة: الأجسام المضادة المناعية الثانوية التي اختيرت لوصفت مع fluorophores مختلفة للسماح للكشف عن ضوء الفلورسنت المنبعثة من بأطوال موجية متميزة باستخدام قنوات مختلفة داخل كاشف للتصوير نسبة عالية. - احتضان لمدة 1 ساعة على RT. نضح الأجسام المضادة الثانوية ويغسل 3 مرات مع 100 ميكرولتر من PBST.
- بعد غسل النهائي، إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على صبغة هويشت (32 ميكرومتر) وصمة عار على الحمض النووي للكشف نوى.
- ختم لوحات مع فيلم كتيم خفيفة لحماية fluorophores من photobleaching من. ويمكن تخزين لوحات في 4 ° مئوية لمدة أسابيع دون خسائر كبيرة في الإشارة.
3. التصوير
ملاحظة: إجراء الحصول على الصور باستخدام عالية المحتوى التصوير تميز الكليةتيم (انظر المواد والمعدات).
- مواصفات عالية تعريفات تصوير المحتوى:
- حدد نوع اللوحة، والتخطيط، وعدد من المجالات، والهدف: غرينر ش اضحة، شكل أيضا 96، 16، 20X المياه على التوالي.
- قنوات مختارة: نواة الإثارة EX: 405 نانومتر كقناة 4؛ السيتوبلازم EX: 644 نانومتر كقناة 2. مستضد الضد محددة قناة EX: 561 نانومتر كقناة 3 و إعداد قوة الإثارة من كل الليزر، وتجربة الإعداد إلى 2 التعرض، التعرض 1 مع الإثارة واحد على 644 نانومتر، التعرض 2 مع اثنين من الإثارات في 405 نانومتر و 561 نانومتر. حدد binning كما Bin2.
- استخدام آبار المراقبة عالية للتعرض الأمثل مع الحد الأقصى لكثافة كقناة SNAP-25 وآبار المراقبة انخفاض الحد الأدنى للكثافة.
- ضبط التعريض الضوئي، بحيث شدة كل قناة حوالي نصف مستوى التشبع (2،000-2،500 الوحدات النسبية).
- تعرف على الطائرة Z المثلى على قناة قناع الخلية باستخدام دلتا النصي التصحيح. انظر فايجوري 5 عن النتائج بعد المناعية والتصوير. تصدير البيانات إلى الملقم حيث برنامج تحليل الصور والمقيمين.
4. صورة تحليل (الشكل 6)
ملاحظة: تصف الخطوات التالية تطبيق خوارزميات البرمجيات كولومبوس.
- تحديد خوارزمية مناسبة لشريحة الكائنات الأولية (نوى). إذا لزم الأمر، وضبط عتبة الخلفية والمعلمات التباين. ويوفر البرنامج كولومبوس 4 طرق الكشف نوى. حدد الطريقة التي نوى شريحة بدقة من خلال فحص البصر نوى مجزأة (F في طريقة igure 6A M يتم تحديد).
- حدد خوارزمية محوار (CSIRO محوار تحليل 2) إلى قطاع neurites التي إذا لزم الأمر، وضبط عتبة الخلفية وعلى النقيض من المعلمات لإزالة الخلفية. انظر الشكل 6B عن المعايير المستخدمة للكشف عن neurites التي.
- تحديد المناطق محوار (شرائح محوار) بسإد على الأشياء الثانوية (neurites التي) باستخدام التوسع بكسل -3 من تويولين قناة β-III (اليكسا طحين 640)، وقناع (الشكل 6C).
- حساب شدة القنوات إشارة (SNAP-25، (اليكسا طحين 568) للمنطقة neurites التي وβ-III قناة تويولين (الشكل 6D و6E).
- تحديد المعايير المطلوبة للتصدير، مثل طول محوار، يعني من شدة SNAP-25، تويولين β-III، عدد الأنوية، رقم قطعة محوار، الخ (الشكل 6F).
- لوحات التحويل من التنضيد لوحة باستخدام الروبوت والحمل في تصوير نسبة عالية لاقتناء الصورة.
5. تحليل البيانات:
لتقييم مدى متانة مقايسة تصميم، وحساب المعلمات التالية من التجربة القائمة على طبق من ذهب.
- إشارة (S) على خلفية (ب): S / B = يعني شدة مكافحة إشارة عالية) / يعني شدة سيطرة إشارة منخفضة <لى> معامل الاختلاف (CV) للإشارة والخلفية (لقياس التوحيد للإشارة محددة): السيرة الذاتية = (الانحراف المعياري (SD) / متوسط العينة) * 100 (٪)، لتحديد التباين في التعامل مع السائل، الكواشف، الخ
- إشارة إلى الضوضاء: S = (يعني كثافة إشارة - تعني شدة سيطرة إشارة منخفضة) / SD السيطرة منخفضة
- حساب Z 'عامل مع التسمم من نصف واحد من لوحة 96-جيدا والتسمم وهمية من النصف الآخر. Z '= 1 - 3 * (SD السيطرة إشارة عالية + SD السيطرة إشارة منخفضة) / (يعني السيطرة إشارة عالية - متوسط سيطرة إشارة منخفضة). لمزيد من التحليل للبيانات الفرز، وتطبيع بعض المعلمات الخام الأولية على أساس لوحة للسماح للمقارنة بين لوحات وبين أيام مختلفة من التجارب.
- في المئة من الانقسام، مما يعكس انخفاضا في إشارة المرتبطة بالطول SNAP-25 قبل الكشف عن الأجسام المضادة المحددة (باكس): الشق٪ = 100٪ * (MEAن شدة مكافحة إشارة عالية - كثافة العينة) / يعني شدة مكافحة إشارة عالية.
- في المئة من تثبيط الانقسام: تثبيط٪ = 100٪ * (كثافة العينة - يعني شدة سيطرة إشارة منخفضة) / (يعني شدة مكافحة إشارة عالية - يعني شدة سيطرة إشارة منخفضة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلقت البيانات من الضوابط ارتفاع وانخفاض اثنين من السكان متميزة مع الفرق اثنين من الوساطات تتجاوز 3 انحرافات معيارية (الشكل 7A). الهدف من عملية الفرز هو العثور على المركبات داخل العينة مع القيم أقرب إلى السكان السيطرة إيجابي، على افتراض التوزيع الطبيعي ضمن العينة (الشكل 7B، (ط)). وتعتبر نقاط البيانات التي هي 3 انحرافات معيارية خارج يعني إحصائيا مختلفا عن الضوضاء وتصنف على أنها "ضرب" النشط (7B الشكل (II)، مربعات حمراء). سيتم إخضاع المركبات التي تصنف على أنها "يضرب" لإجراء مزيد من التجارب التأكيد في الدراسات المستقبلية. 7B الشكل (ب) يبين الكشف الزيارات إيجابية في عدد من العينات من مجموعة فرعية ممثلة لوحات الفحص. 4 جميع النقاط التي كان القيم أقل من (عينات متوسط - 3 * SD من العينات) ينتمي إلىنفس المانع الذي شوهد في مواقع مختلفة ضمن 4 لوحات الفحص المختلفة. أثبت هذا المانع قوية حماية SNAP-25 ضد بونت / A، كما هو مبين في الشكل (5).
الشكل 1: سير العمل للكشف عن مركب في مقايسة بونت / A HCI.
الشكل 2: خريطة 96 لوحة جيدا للمقايسة HCI الآبار الرقابة العليا (الوردي) يعاملون مع 0.5٪ DMSO عن السيطرة فقط وآبار المراقبة منخفضة (الأزرق) عولجوا 1 نانومتر بونت / A و 0.5٪ DMSO. وعولج عينة الآبار (الأخضر) مع 1nM السم و 10 ميكرومتر من المركبات في 0.5٪ DMSO. لم تستخدم الأعمدة والصفوف الخارجية (الرمادي) بسبب عدم التوافق مع لوحة الأمثل لحصيرة وعجز الهدف الماء الغمر 20X صورة لحافة الآبار.
تم الاستغناء تصميم الآلية سطح محطة عمل للمقايسة المناعية حجب العازلة، الأجسام المضادة الأولية، الضد الثانوية والبقع الخلوية في لوحات البولي بروبلين 96-جيدا لتقليل حجم الخسائر ميت كاشف: الرقم 3. تم الاستغناء عن برنامج تلفزيوني في صينية قادرة على اجراء 300 مل. يظهر متعددة تستخدم لطموح النفايات السائلة على الصورة أقحم.
الشكل 4: قطة الشاشة من نسبة عالية التجريبية تصوير اقامة.
الرقم 6: الطلقات الشاشة تظهر الخطوات المختلفة في خط أنابيب تحليل الصور.
الرقم 7: التصور الإحصائي للبيانات الناتجة عن الشاشة HCI. (A). (ط) صندوق تحليل مؤامرة من الشق٪ تحسب من آبار المراقبة. إظهار القيم الوسيطة كما هو الحال مع SD كل منهما (ن = 16). يمثل الوردي سيطرة إشارة عالية (شهادة الثانوية العامة)؛ الأزرق يمثل سيطرة إشارة منخفضة (LSC). Z '= 0.97 (ب) توزيع الرسم البياني لنفس القيم كما في (ط) للتدليل على المسافة بين اثنين من السكان السيطرة. تم حساب متوسط و 3 SD من القيم الإحصائية المرتبطة المقابلة مربع المؤامرة. (B). توزيع مجمع 192 معاملة عينات من نفس التجربة. (ط) صندوق مؤامرة يدل على القيم الإحصائية للانشقاق٪ للعينات بالمقارنة مع الضوابط فضلا عن القيم المتطرفة ذات دلالة إحصائية. (ب) و (ج)، وتوزيع الرسم البياني لنفس القيم في عدد السكان من كافة البيانات من الشاشة (الأخضراللون). إصابات (سلط عليها الضوء في المربع الأحمر) وقد تم اختيار، من القيم المتطرفة التي لديها٪ انشقاق قيم أقل من 3SD من المتوسط من السكان عينة (<25.89٪ الانقسام). أبرزت أربعة إصابات خلال اختيار (الثالث) على الرسم البياني جميع نقاط البيانات لها قيمة مماثلة لرقابة إشارة عالية ويمثل المجمع نفسه، ارتفعت إلى لوحة للاختبارات، ويعرف بونت / A المانع (Toosendanin) التي منعت SNAP -25 الانقسام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أدى رجولية عالية من أعصاب البوتولينوم والسهولة النسبية للتسليح في تصنيفها ضمن الفئة ألف (أولوية قصوى) وكلاء biothreat من المراكز الامريكية لمكافحة الامراض والوقاية منها. لسوء الحظ، هناك علاجات وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لا بونت لمواجهة التسمم بعد أن تم المنضوية السم من قبل الخلايا العصبية الحركية. أي آلية druggable تعزز انتعاش العصبية من بونت التسمم قد يؤدي نحو تطوير علاج محتمل لحماية كل من القوات المسلحة والجمهور ضد هذا التهديد البيولوجي. في هذه المقالة، نقدم HCI بروتوكول فحص مفصل لفحص مثبطات السموم القاتلة مثل بونت / A. أحد الجوانب غير عادية من هذا الاختبار هو تسليم الدقيق من السموم وتنفيذ بروتوكولات صارمة للسلامة الأحيائية لضمان سلامة المختبرات. يجب توخي الحذر الشديد حين السم النشط هو قيد الاستخدام. بونت / A التعطيل عبر تثبيت الميثانول وصفيحة ميكروسكوبية decontaminatiيوم مع التبييض 10٪ و 5٪ وتقضي على السطح هي الخطوات الرئيسية التي تسمح microplates لشطبها من خزانات السلامة البيولوجية لتقييم المصب في بيئات 2 مستوى السلامة الحيوية في المختبرات.
نظرا لحجم الاتساع المكتبات المركب إلى جانب بطء التوسع الخلايا العصبية الحركية (عدد الخلايا)، المقايسات HCI للمضادات عصبي تميل إلى تشغيل أكثر من عدة أسابيع. هذا يتطلب أن التباين بين لوحات وعبر الوقت يجب القضاء أو التقليل. في هذا البروتوكول نقدم أساليب الأتمتة للالمناعية، الحصول على الصور والتحليل للحد من تقلب الفحص. ويمكن تحقيق مزيد من الاتساق والموثوقية من خلال أتمتة المهام الروتينية المرتبطة بهذا البروتوكول بما في ذلك الطلاء الخلية، والغسيل، والتثبيت. مجموعتنا حاليا على تقييم تأثير هذه التحسينات بهدف دمجها في بروتوكول لدينا في المستقبل القريب.
في هذا التقرير، وصفنا SNAP-25الفحص باستخدام التصوير الانقسام نسبة عالية لقياس مضان النسبي سليمة SNAP-25 في الخلايا العصبية الحركية. يستخدم هذا الاختبار في BACS والأجسام المضادة β-III تويولين للكشف عن كامل طول SNAP-25 و β-III تويولين 11 على التوالي. ويستخدم تويولين β-III كعلامة لتحديد الخلايا العصبية تحديدا (الشكل 4). بينما بونت / A يشق SNAP-25، ويقلل من إشارة SNAP-25، والجزيئات الصغيرة التي تمنع أي جزء من هذه العملية تحسين SNAP-25 إشارة في فحص التصوير. كما يعتمد هذا الاختبار على إشارة مضان المتولدة من SNAP-25 موزعة عبر العديد من neurites التي صغيرة، صور عالية الجودة ضرورية على الاطلاق. ومن ثم، ينصح المجاهر الآلي التي تنتج صورا عالية الدقة مبائر (الشكل 4). نحن عادة التقاط 16/06 الحقول / جيدا في شكل 96-جيدا أثناء استخدام الهدف الماء الغمر 20X. عدد تصويرها الحقل تعتمد على العدد الإجمالي للneurites التي المطلوبة لgeneratالبريد النتائج ذات دلالة إحصائية.
واستخدمت وحدات خوارزميات تحليل الصور لاستخراج البيانات multiparameter (الشكل 6). كولومبوس خوارزميات تحليل الصور وحدات من السهل نسبيا لتوليد أبسط تحليل لسيناريوهات. لتحليل أكثر تعقيدا أو تصميم معايير محددة لقراءات معقدة، ومخطوطات مقرها Acapella يمكن استخدامها داخل البيئة أوبرا وكذلك داخل إطار كولومبوس. بالإضافة إلى كثافة مضان الحصول عليها من قنوات تويولين SNAP-25 و β-III، التي نجمعها بشكل روتيني غيرها من المعالم مثل عدد الخلايا (قياس غير مباشر من أجل سمية الخلايا)، طول محوار، محوار المتفرعة، والنهاية الأخرى لقياس صحة الخلايا العصبية خلال الفحص. ويتم تصدير البيانات الخام إلى نقطة النهاية برامج التحليل الإحصائي لمزيد من تحليل البيانات واختيار ضرب (الشكل 7). البيانات المقدمة هنا يدل على قدرة الفحص HCI أن تكون efficiتستخدم مستديم لفحص المظهري في البحث عن بونت / A مثبطات باستخدام نموذج الخلايا العصبية الحركية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
- Lamanna, C.
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
- Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
- Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
- Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
- Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
- Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
- Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
- Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
- Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
- Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).
