Introduction
A bactéria Clostridium botulinum produz neurotoxina botulínica, um dos mais potentes toxinas biológicas conhecidas para o homem 1. Existem 7 sorotipos BoNT distintas (TB / AG). BoNT / A-Gall induzir paralisia na junção neuromuscular, devido à proteólise complexo SNARE 2,3. SNARE proteólise impede-neurotransmissor vesícula de membrana de fusão e, por conseguinte, bloqueia a exocitose do neurotransmissor 4. O alvo SNARE específica depende do serotipo particular, BoNT envolvidos no processo de intoxicação. BoNT / A e BoNT / E se apegam SNAP-25 enquanto que cliva BoNT / C ambos SNAP-25 e syntaxin 5. O restantes serotipos sinaptobrevina clivam (também chamado de proteína de membrana de vesícula-associado (VAMP). BoNT / A foi escolhida para o desenvolvimento do ensaio, uma vez que é responsável por uma proporção elevada de ocorrência natural botulismo e tem a maior duração de acção 6. Desenvolvimento de pequena molécula terapêutica contra BoNT / A é uma meta importante parao nosso programa de descoberta de drogas e utilizou métodos tradicionais à base de alvo para identificar inibidores de sítio proteolíticas activas 7, 8-10. No entanto, a criação de inibidores de sítio activo com actividade de largo espectro contra vários serotipos e eficácia pós-exposição irá provavelmente ser um desafio.
Temos, portanto, implementado uma abordagem inovadora, fenotípicas descoberta droga que usa BoNT SNAP-25 clivagem como um desfecho funcional para identificar pequenas moléculas que podem bloquear BoNT mediada por intoxicação do neurônio motor. SNAP-25 é necessária para a libertação de neurotransmissores, como a degradação de SNAP-25 é preditivo da paralisia e letalidade in vivo. Por exemplo, o rastreio baseado em células poderia levar à descoberta de novos moduladores de factores celulares responsáveis pela inactivação da toxina ou a inibição das vias de toxina no interior das células-alvo. Um fator importante no desenvolvimento de ensaio fenotípico é a seleção de modelos biológicos fisiologicamente relevantes. We e outros descreveram rato estaminais embrionárias (ES) derivadas de células de neurónios motores que recapitulam o carácter imunológico de neurónios motores principais, incluindo a expressão de SNAP-25, 11- 13. É importante notar que estes sistemas celulares são altamente sensíveis a BoNT / A intoxicação e demonstrar a clivagem dependente da dose de SNAP-25 em resposta a concentrações crescentes de toxina 11,12. Os neurónios motores diferenciadas também são produzidos em quantidades que são suficientes para uma análise baseada placa de alto rendimento e permitiram a construção de uma variedade de ensaios celulares.
O ensaio fenotípico é um método de imunofluorescência utilizando dois anticorpos diferentes para quantificar a clivagem de comprimento total endogenamente expressa SNAP-25 durante BoNT / A intoxicação da cultura do rato do neurônio motor. Um terminal carboxilo BoNT / A (BACS) anticorpo sensível à clivagem que reconhece apenas o comprimento total SNAP-25 permite a avaliação de BoNT / A proteólise mediada da SNAP-25expressão no motor de rato neurônios 10. Um diagrama esquemático do ensaio IHC está representado na Figura 1.
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Protocol
Placa de 20.000 células ES de ratinho diferenciadas (MES) / poço em placas de 96 lisina revestidos assim Poli-D e manter no neurónio motor meios de diferenciação terminal por 5-7 dias.
Administração 1. Composto e Intoxicação com BoNT / A
Realizar todos os seguintes trabalhos em um gabinete BSL2 para manter a conformidade com as diretrizes do CDC / NIH.
- Preparar soluções de estoque 10 mM de cada composto da biblioteca em 100% de DMSO em placas de 96 poços de polipropileno. Usar o estoque 10 mM para preparar uma placa de diluição intermédia que é 10 vezes maior do que a concentração de triagem desejado. Prepare 100 uM placa intermediária dispensando estoque 10 mM em placa de 96 poços e diluir a 100 uM utilizando meios de cultura. Dispensar 10 ul dos compostos sobre a 90 ul de meio sobre as células 11. Teste os compostos em 10 uM concentração final e garantir a porcentagem final de DMSO não exceda 0,5%.
- Realize todos garanhãos que utilizam células vivas e toxina ativa sob nível de biossegurança 2 condições. Substituir as velhas mídias nas placas de 96 poços com 80 mL de fresco mídia diferenciação terminal usando um manual de 12 canais pipeta. Realizar aspiração e dispensar passos por linhas para evitar a exposição das células sem mídia para o ar ambiente.
- Pretreat células com compostos antes da aplicação da toxina através da adição de 10 ul de compostos de 10x a placa de fonte utilizando uma pipeta de 12 canais, seguido por mistura por aspiração (duas vezes). Para cada placa de 96 poços, tratamento de duas colunas de 6 poços com 10x DMSO diluído nos meios de comunicação para servir como sinal de alta e controles de sinal baixo. A coluna sem tratamento BoNT exibe o nível mais elevado de todo o comprimento SNAP-25 (controlo de sinal alta). Trate a outra coluna com BoNT sozinho (sem quaisquer compostos) como o baixo controle de sinal. Use baixo controle para observar a eficácia de BoNT clivagem de SNAP-25 e sua detecção com o anticorpo BACS (Figura 2).
- Incubar as células com os compostos durante 30 min a 37 ° C e 6% de CO 2 na incubadora de cultura de células.
- Prepare a neurotoxina botulínica A partir de um 1 mg / ml fonte comercial em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para uma final 10x estoque de trabalho por diluição com meios de diferenciação terminal.
- Iniciado intoxicação por adição de 10 ul de 10x de BoNT / A estoque em poços designados para tratamento e baixo sinal controlos utilizando uma pipeta de canais múltiplos (Figura 2). Tratar as cavidades designadas como de controlo elevado com meio isolado.
- Descontaminar todos os utensílios de plástico e outros materiais descartáveis que entra em contacto com BoNT / A durante o estudo por imersão em solução de hipoclorito de 0,825% em água durante pelo menos 20 min. Realize todos os procedimentos de biossegurança em armários e descontaminar áreas de trabalho, antes e depois de experimentos com 5% de detergente desinfetante limpador como solução MICROCHEM.
- Rotular as placas claramente para denotar a utilização de toxina e incubcomeram placas tratadas com 1 nM / L de BoNT / A durante 4 horas a 37 ° C e 6% de CO 2 num incubador de cultura de células. Mostrar sinalização adequada para informar os colegas que a toxina está em uso no laboratório.
- Parar BONT / A clivagem proteolítica pela fixação metanol. Remover meios contendo toxina e compostos de cada poço com uma pipeta multicanal e descartar em solução de lixívia a 10%. Adicionar metanol arrefecido em gelo (100 ul) directamente a cada poço.
- Incubar as placas durante 15 minutos à temperatura ambiente (TA) para permitir a fixação de ocorrer.
- Após a fixação, lidar com segurança com os reagentes descartados (considerado neutralizados) com protocolos de nível de biossegurança 1 e descartar adequadamente.
- Descartar metanol e 100 ul de usar PBS para lavar as células e hidratar-los antes da imunocoloração. Realizar duas lavagens com PBS adicionais.
- Após a lavagem final, deixe PBS nos poços, placas de vedação com película adesiva de microplacas e armazenar a 4 ° C até a análise. Armazene as placas a 4 ° C for vários dias.
2. Immunostaining
O procedimento immunostaining é, uma operação de várias etapas de trabalho intensivo que inclui reagentes repetitivos ciclos de distribuição / aspiração e placa de lavagem extensa que pode levar à introdução potencial de variabilidade intraplaca e Interplate significativo. Uma abordagem semi-automática é aplicada a economizar o tempo do pessoal de laboratório, aumentar a taxa de transferência de ensaio, e minimizar imunomarcação variabilidade.
- Use uma estação de trabalho automatizado equipado com uma cabeça de 96 poços capaz de transferir volumes de até 250 mL e integrado com um braço robótico garra para mover o material de laboratório em locais diferentes, na plataforma modular (ver Materiais e Equipamentos) para este protocolo.
- O deck modular foi concebido para acolher diferentes tipos de material de laboratório e pode suportar até 11 itens de uma só vez. O manipulador de microplacas automático é equipado com um compartimento duplo microplaca empilhador, a fim de manter emanipular até 50 placas por ciclo.
- A estação de trabalho automatizado está localizado dentro de uma cabine de segurança biológica Classe II projetado para laboratório equipamentos de automação para proporcionar esterilidade e segurança. Para imunocoloração automatizado, o convés está disposta como mostrado na Figura 3, para permitir o acesso do reagente conforme necessário e sem intervenção humana.
- Placas pré-carga contendo células fixas na revista placa e transferência para o convés como necessário para operações de movimentação de líquidos. Use a cabeça 96 pipeta equipado com 250 ul dicas para aspirar PBS dos poços até 10 jul. Permeabilizar as membranas celulares para facilitar a ligação do anticorpo a alvos intracelulares, com tampão de permeabilização (0,1% de Triton X-100). Dispensar tampão de permeabilização (100 ul) em cada poço antes de retornar as placas para o segundo compartimento de armazenamento do empilhador para uma microplaca de 15 minutos de incubação à temperatura ambiente (RT).
- Remover tampão de permeabilização e eplavagem da placa com PBS rform (duas vezes) como descrito anteriormente no passo 1.13.
- Após o último passo de lavagem, remover o tampão PBS e dispensar 100 ul de tampão de bloqueio contendo 1% de soro de cavalo e 0,1% de Tween 20 em PBS em todos microplacas antes devolvê-los ao compartimento placa durante 1 hora de incubação à temperatura ambiente.
- Usar dois anticorpos primários para imunocoloração: um anticorpo policlonal de coelho anti-rato de anticorpo BACS, para a detecção de comprimento completo SNAP-25 e um anticorpo monoclonal de rato anti-tubulina III anticorpo para a detecção de neurónios (ver Materiais e Equipamento). Após 60 min de incubação, remover o tampão de bloqueio e dispensar 50 ul de 4ug / ml de anticorpo BACS e 0,5 ug / ml de III-tubulina em tampão de bloqueio em todas as placas.
- Incubar durante 1 h à TA remover os anticorpos primários e lavar 3 vezes com 100 ul de PBS contendo 0,05% de Tween (PBST).
- Usar uma IgG anti-ratinho marcada com Alexa Fluor 647 para visualizar a -III tubulina e anti-IgG de coelho marcado com Alexa Fluor 568 para visualizar o anticorpo BACS. Prepare ambos os anticorpos como uma diluição de 2 ug / ml em tampão de bloqueio e dispensar 50 ul da mistura em cada poço.
NOTA: Os anticorpos secundários seleccionados para imunocoloração são marcados com diferentes fluoróforos para permitir a detecção da sua luz fluorescente emitida nos comprimentos de onda distintos, utilizando diferentes canais dentro do detector de o conteúdo de alta Imager. - Incubar durante 1 h à TA. Aspirar os anticorpos secundários e lavar 3 vezes com 100 uL de PBST.
- Após a lavagem final, adicionar 100 ul de PBS contendo corante Hoechst (32 uM) para corar o ADN para a detecção de núcleos.
- Selar as placas com uma película impermeável luz para proteger os fluoróforos de fotodegradação. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante semanas sem perda significativa de sinal.
3. Imagem
NOTA: Realizar a aquisição de imagens utilizando alta Conteúdo de imagem SysTEM (ver Materiais e Equipamentos).
- Especificação de Alta Definição Imager conteúdo:
- Selecione o tipo de placa, layout, número de campos, objetivo: Greiner u claro, formato de 96 poços, 16, 20X de água, respectivamente.
- Selecione os canais: núcleo de excitação EX: 405 nm como canal 4; citoplasma EX: 644 nm como o canal 2; antígeno específico EX canal anticorpo: 561 nm como canal 3 e Configure potência de excitação de cada laser, experimento Instalação como duas exposições, uma exposição com uma excitação a 644 nm, Exposição 2 com duas excitações em 405 nm e 561 nm. Selecione binning como BIN2.
- Use poços de controlo elevados para a otimização da exposição com intensidade máxima como canal SNAP-25 e baixa de poços de controlo de intensidade mínima.
- Ajustar a exposição, de modo que a intensidade de cada canal é de cerca de metade do nível de saturação (2000-2500 unidades relativas).
- Identificar o plano Z ideal no canal da máscara de célula usando o script de correção delta. Veja Figura 5 para resultados após immunostaining e imagem. Exportar dados para o servidor onde o software de análise de imagem está residindo.
4. Análise de Imagem (Figura 6)
NOTA: Os passos seguintes descrevem aplicação dos algoritmos de software Columbus.
- Selecione um algoritmo apropriado para o segmento dos objetos primários (núcleos). Se necessário, ajustar o limiar de fundo e de parâmetros de contraste. O software Columbus oferece quatro métodos de detecção de núcleos. Selecione o método que os núcleos do segmento com precisão por inspeção visual núcleos segmentados (em F igura método 6a M é selecionado).
- Selecione o algoritmo de neurite (CSIRO Neurite Análise 2) para o segmento de neurites Se necessário, ajustar os parâmetros de limite de fundo e contraste para remover o fundo. Veja a Figura 6b para os parâmetros usados para detectar neurites.
- Identificar as regiões neurite (segmentos neurite) based em objectos secundários (neurites), utilizando uma ampliação de pixel -3 do canal β-tubulina III (Alexa Flour 640) como máscara (Figura 6c).
- Calcule a intensidade dos canais de sinal (SNAP-25, (Alexa Farinha 568) para a região de neurites e canal tubulina β-III (Figura 6d e 6e).
- Selecione os parâmetros desejados para a exportação, como comprimento neurite, intensidades médias de SNAP-25, β-tubulina III, número de núcleos, número do segmento neurite, etc. (Figura 6f).
- Placas de transferência de tabuleiros usando o robô e carga para o Imager Conteúdo alta para aquisição de imagem.
5. Análise de Dados:
Para avaliar a robustez do ensaio desenhado, calcular os seguintes parâmetros a partir do experimento à base de chapa.
- Signal (S) a fundo (B): S / B = intensidade do sinal de controle de alta média) / média intensidade de baixo controle de sinal <li> Coeficiente de Variação (CV) de sinal e o fundo (para medir a uniformidade do sinal específico): CV = (Desvio Padrão (DP) / média de amostra) * 100 (%), para determinar a variabilidade no manuseamento de líquidos, reagentes, etc.
- Signal to Noise: S = (intensidade de sinal significa - intensidade de baixo controle de sinal média) / SD de baixo controle
- Calcular o factor de Z 'com intoxicação de uma metade de uma placa de 96 poços e uma intoxicação simulada da outra metade. Z '= 1-3 * (SD de alto controle de sinal + SD de baixo controle de sinal) / (média de controle de alta sinal - média de baixo controle do sinal). Para a análise posterior dos dados de rastreio, normalizar alguns dos parâmetros de matérias primárias sobre uma placa de base para permitir a comparação entre as placas e entre os diferentes dias de experiências.
- Percentagem de clivagem, reflectindo a redução do sinal associado com o comprimento total de SNAP-25 detectada por um anticorpo específico (BACS): Clivagem% = 100% * (meaintensidade n de controle sinal alto - intensidade da amostra) intensidade de controle de alta sinal / média.
- Porcentagem de inibição da clivagem:% inibição = 100% * (intensidade da amostra - intensidade de baixo controle de sinal média) / (intensidade de controle de alta sinal significa - intensidade de baixo controle de sinal média).
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Representative Results
Os dados dos controlos altos e baixos criadas duas populações distintas com a diferença de duas medianas superiores a 3 desvios padrão (Figura 7A). O objectivo do processo de triagem é para encontrar os compostos dentro da população da amostra com valores próximos das populações de controlo positivo, assumindo uma distribuição normal dentro da população da amostra (Figura 7B, (i)). Os pontos de dados que são três desvios padrão além da média são considerados estatisticamente diferente do barulho e classificado como um "hit" ativa (Figura 7B (ii), as caixas vermelhas). Os compostos que são classificados como "hits" irá ser submetida a mais testes de confirmação em estudos futuros. Figura 7B (ii) mostra a detecção de resultados positivos na população das amostras a partir de um subconjunto representativo das placas de rastreio. Todos os 4 pontos que tinham valores mais baixos do que as amostras (mediana - 3 * SD das amostras) pertencia ao mesmo inibidor que foi visto em diferentes locais dentro de 4 placas de rastreio diferentes. Este inibidor demonstrou robusta SNAP-25 de protecção contra a BoNT / A, como mostrado na Figura 5.
Figura 1: Fluxo de trabalho para rastreio de compostos no ensaio de BoNT / A HCI.
Figura 2:. O mapa da placa de 96 cavidades para o ensaio de poços de alta HCI controlo (rosa) foram tratados com 0,5% de DMSO apenas como controle e os poços de controlo de baixo (azul) foram tratados com 1 nM de BoNT / A e 0,5% de DMSO. Poços de amostra (verdes) foram tratadas com toxina de 1 nM e 10 uM de compostos em DMSO a 0,5%. As colunas e as linhas externas (cinzento) não foram utilizadas devido a incompatibilidade com a placa optimizado paraesteira e da incapacidade de o objetivo de imersão em água 20X de poços de borda da imagem.
Figura 3:. O desenho do pavimento da estação de trabalho automatizada para o ensaio de imunocoloração O tampão de bloqueio, o anticorpo primário, o anticorpo secundário e manchas celulares foram dispensadas em placas de polipropileno de 96 poços para reduzir o volume morto perda de reagente. PBS foi dispensado em uma bandeja capaz de reter 300 ml. O coletor utilizado para aspiração de resíduos líquidos é mostrada a imagem ampliada diante.
Figura 4: Captura de tela da alta experimental Imager conteúdo criado.
Figura 6: As capturas de tela mostram várias etapas no pipeline de análise de imagem.
Figura 7: visualização estatística dos dados resultantes da tela HCI. (A). (I) Caixa análise enredo da clivagem% calculados a partir de poços de controlo; mostrados como valores médios com os seus respectivos DP (n = 16). Rosa representa o controle de sinal de alta (HSC); azul representa o baixo controle de sinal (LSC). Z '= 0,97 (ii) distribuição do histograma dos mesmos valores que em (i) para demonstrar a distância entre as duas populações de controlo. Mediana SD e 3 foram calculados a partir dos valores estatísticos associados com a caixa-trama correspondente. (B). Distribuição do composto 192 a partir de amostras tratadas com o mesmo experimento. (I) Box-plot demonstrando os valores estatísticos para a clivagem% para amostras em comparação com os controles, bem como os outliers estatisticamente significativos. (Ii) e (iii), a distribuição do histograma dos mesmos valores na população de todos os dados a partir do ecrã (verdecor). Hits (destacados no quadrado vermelho), foram selecionados entre os valores extremos que têm% clivagem valores inferiores a 3 DP da mediana da população de amostra (<25,89% clivagem). Os quatro hits destacou durante a seleção (iii) no histograma de todos os pontos de dados têm valores semelhantes ao controle de alta de sinal e representado o mesmo composto, cravado na placa para os testes, um conhecido BoNT / inibidor A (Toosendanin) que bloqueou SNAP -25 clivagem.
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Discussion
A alta potência de neurotoxinas botulínicas e relativa facilidade de seu armamento resultou em sua classificação como Categoria A (prioridade mais alta) agentes biothreat pelos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças. Infelizmente, não há terapias aprovadas pela FDA para contrariar BoNT intoxicação após a toxina tenha sido internalizados pelos neurónios motores. Qualquer mecanismo druggable que promove a recuperação neuronal de BoNT intoxicação pode levar para o desenvolvimento de uma terapia potencial para proteger tanto as forças armadas e público contra esta ameaça biológica. Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado ensaio HCI para triagem de inibidores de toxinas letais, como BoNT / A. Um aspecto incomum deste ensaio é entregar escrupuloso das toxinas e implementação de protocolos de biossegurança rigorosas para garantir a segurança do laboratório. Extremo cuidado deve ser exercido enquanto toxina ativa está em uso. BoNT / A inativação através da fixação do metanol e microplacas decontaminatina com 10% de água sanitária e 5% toalhetes de superfície são passos chave que permitem microplacas para ser removido da armários de biosegurança para a avaliação do nível a jusante em ambientes laboratoriais 2 biosegurança.
Devido ao tamanho cada vez maior de bibliotecas de compostos juntamente com lenta expansão do neurônio motor (número de células), ensaios de IHC para antagonistas neurotoxina tendem a correr ao longo de várias semanas. Isto requer que a variabilidade entre as placas ao longo do tempo e devem ser eliminados ou minimizados. Neste protocolo, fornecer métodos de automação para immunostaining, aquisição e análise de imagens para reduzir a variabilidade do ensaio. Ainda mais a confiabilidade e consistência pode ser alcançada através da automação de tarefas rotineiras associadas a este protocolo, incluindo plaqueamento de células, lavagem e fixação. Nosso grupo está atualmente avaliando o impacto destas melhorias com a intenção de incorporá-los em nosso protocolo em um futuro próximo.
Neste relatório, nós descrevemos um SNAP-25ensaio de clivagem utilizando imagens de alta conteúdo para medir a fluorescência relativa de intacta SNAP-25 nos neurônios motores. Este ensaio utiliza os anticorpos de tubulina e BACS β-III para detectar a full-length SNAP-25 e β-tubulina III, respectivamente, 11. β-tubulina III é usado como um marcador para identificar especificamente os neurónios (Figura 4). Enquanto cliva BoNT / A SNAP-25 e reduz o sinal de SNAP-25, moléculas pequenas que inibem a qualquer parte deste processo melhorar a SNAP-25 no ensaio de sinal de imagem. Como este ensaio depende do sinal de fluorescência gerada a partir da SNAP-25 distribuída através de muitas neurites minúsculos, imagens de alta qualidade são absolutamente necessárias. Assim, microscópios automatizados que produzem imagens de alta resolução são recomendados confocal (Figura 4). Rotineiramente capturar 6-16 campos / poço num formato de 96 poços durante a utilização do objectivo de imersão em água 20X. O número de com imagens de campo são dependentes do número total de neurites necessária para generatpor e resultados estatisticamente significativos.
Algoritmos de análise de imagem modulares, foram utilizadas para extrair dados multiparâmetros (Figura 6). Os Columbus algoritmos de análise de imagem modular são relativamente fáceis de gerar para cenários de análise mais simples. Para uma análise mais complicada ou de criação de parâmetros específicos para leituras de complexos, com base Acapella os scripts podem ser utilizados dentro do ambiente Opera bem como dentro do contexto de Columbus. Além das intensidades de fluorescência obtidos a partir dos canais de tubulina de SNAP-25 e β-III, que recolhem outros parâmetros, tais como número total de células (medida indirecta para a citotoxicidade), comprimento de neurites, neurites de ramificação, e outros parâmetros para quantificar a saúde neuronal durante o ensaio. Os dados de ponto de extremidade matérias são exportados para o software de análise estatística de dados para posterior análise e selecção atingido (Figura 7). Os dados aqui apresentados demonstram a capacidade do ensaio IHC ser efficitemente utilizado para a seleção fenotípica em busca de inibidores de BoNT / A usando um modelo de neurônio motor fisiologicamente relevante.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
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