Summary
इस विधि माउस मॉडल में उपन्यास दवाओं की फार्माकोकाइनेटिक्स का आकलन करने के लिए, मन्या धमनी के माध्यम से एक स्थिर दवा समाधान पहुंचाने के लक्ष्य के साथ विकसित किया गया था.
Abstract
एक उपन्यास प्रणाली में एक दवा, दवा संयोजन, या दवा वितरण के उपयोग का प्रस्ताव है, एक अध्ययन मॉडल में दवा की फार्माकोकाइनेटिक्स का आकलन करना चाहिए. माउस मॉडल का उपयोग अक्सर पूर्व नैदानिक दवाओं की खोज और नशीली दवाओं के विकास 1-8 में एक महत्वपूर्ण कदम है, यह एक वर्दी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से चूहों में दवाओं को पेश करने के लिए एक प्रणाली डिजाइन करने के लिए आवश्यक है. आदर्श रूप में, प्रणाली एक निर्धारित समय पाठ्यक्रम पर नियमित अंतराल पर रक्त के नमूनों के संग्रह की अनुमति चाहिए. जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा दवा सांद्रता उपाय करने की क्षमता, व्यक्तिगत चूहों 1, 9, 10 में समय के साथ प्लाज्मा दवा के स्तर में परिवर्तन का पालन करने के लिए जांचकर्ताओं को अनुमति दी गई है. इस अध्ययन में, Paclitaxel तीन पर एक निरंतर धमनी अर्क के रूप में ट्रांसजेनिक चूहों में पेश किया गया था घंटे, रक्त के नमूनों को एक साथ निर्धारित समय बिंदुओं पर रेट्रो कक्षीय bleeds द्वारा लिया गया है. कैरोटिड धमनी लेनी गले नस सुई लेनी के लिए एक संभावित विकल्प, जब कारकों जैसे हैंस्तन ट्यूमर या अन्य अवरोधों कंठ लेनी अव्यावहारिक बना. इस तकनीक का उपयोग करना, प्लाज्मा और ऊतकों में Paclitaxel सांद्रता कंठ निषेचन की तुलना में समान स्तर हासिल की. इस ट्यूटोरियल में, हम सफलतापूर्वक अलग-अलग माउस मॉडल के लिए एक अनुकूलित कैथेटर की तैयारी से कैरोटिड धमनी कैथीटेराइज़ करने के लिए प्रदर्शन करेंगे, तो डालने और माउस मन्या धमनी में कैथेटर सुरक्षित, पीछे के माध्यम से बाहर कैथेटर के अंत धागा करने के लिए कैसे दिखाने माउस की गर्दन की, और दवा बाढ़ की एक नियंत्रित दर देने के लिए एक पंप करने के लिए माउस हुक. एकाधिक कम मात्रा रेट्रो कक्षीय bleeds समय के साथ प्लाज्मा दवा सांद्रता के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं.
Introduction
मन्या के माध्यम से नशीली दवाओं के अर्क उपकरण और तकनीक के अनुकूलन द्वारा मज़बूती और reproducibly किया जा सकता है. यह विस्तार करने के लिए ठीक नियंत्रण और ध्यान देने की जरूरत है, हालांकि प्रक्रिया जटिल नहीं है. बेहतर देखभाल और निपुणता मन्या धमनी अलग करने और आम तौर पर अभ्यास के माध्यम से हासिल किया जा सकता है जो कैथेटर, सम्मिलित करने के लिए आवश्यक हैं. एक अनुभवी तकनीशियन द्वारा सर्जरी एक घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए. (माउस वास्तविक दवा निषेचन के लिए प्रतिक्रिया हो सकती है, हालांकि) सफल सर्जरी के बाद, माउस सामान्य और स्वस्थ दिखाई देनी चाहिए, और दवा (एस) के एक नियंत्रित, वर्दी निरंतर खुराक में दिलाई जा सकती है. रक्त के नमूने मन्या धमनी के अलावा किसी अन्य साइट से लिया जाना चाहिए; रेट्रो कक्षीय bleeds दवा सांद्रता के विश्लेषण के लिए एकत्र करने के लिए आसान और संतोषजनक साबित कर दिया.
इष्टतम आकार और आकृति की कैथेटर्स एक सफल निषेचन 11 प्रदर्शन में एक अमूल्य संपत्ति हैं. हम कैथेटर उपलब्ध commerciall पायाY अक्सर बहुत बड़ी है और / या माउस मन्या धमनी के लिए सुविधाजनक उपयोग के लिए अनुमति देने के लिए भी लचीला होना. यह अर्क सिरिंज के लिए माउस कनेक्ट किया पॉलीथीन ट्यूबिंग से फैशन कैथेटर के लिए बेहतर साबित हुआ. इस प्रकार, सभी ट्यूबिंग, कनेक्टर्स और सुइयों के अर्क विधानसभा सरलीकृत जो लगातार आयामों के थे. इस तकनीक का उपयोग करना, यह अभी भी दिखाई दे रहा है, और मन्या धमनी में रक्त प्रवाह को कैथेटर शुरू में सुरक्षित है के बाद जब तक बहाल नहीं किया जाता है इस मुद्दे पर जहां पिछले धमनी में कैथेटर की नोक पुश करने के लिए आवश्यक नहीं है. यह धमनी puncturing की या कैथेटर होने के खतरों रक्त प्रवाह की उच्च दबाव से बाहर धक्का दे दिया कम कर देता है. कैथेटर डिजाइन के साथ साथ इतना sutures के साथ अच्छी तरह से कैथेटर को सुरक्षित और सर्जिकल टेप एक प्राथमिकता है, एक जगह में पकड़ करने के लिए "टक्कर" को शामिल नहीं करता है.
आधान के नैदानिक प्रशासन की एक बेहतर नकल के रूप में, आम चतुर्थ सांस में इंजेक्शन के लिए बेहतर हो सकता हैऐसे taxanes 3, 12, यहाँ वर्णित 13. तकनीक के रूप में दवाओं के मूल कंठ या और्विक शिरा के लिए उपयोग स्तन ट्यूमर के विकास और / या प्रविष्टि क्षेत्र के अत्यधिक vascularization से रोका गया था जिसमें माउस मॉडल में जान फूंकना अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था. इस विधि अक्सर भी ट्यूमर से मुक्त चूहों में उपयुक्त हो सकता है: कंठ दीवार की प्रवृत्ति अधिक विफल सम्मिलन और पूरा करने के लिए विफलताओं के परिणामस्वरूप चीर क्योंकि अलग और मन्या catheterizing हालांकि थोड़ा अधिक आक्रामक, हम इसे बेहतर कंठ पाया जाता है 3 घंटा समय पाठ्यक्रम.
यहाँ दिखाए गए परिणामों C57BL / 6J से हैं जबकि (घर में नस्ल) चूहों, हम सफलतापूर्वक transgenically चालाकी माउस मॉडल में फार्माकोकाइनेटिक्स का पालन करने के लिए, FVB और मिश्रित उपभेदों सहित चूहों के कई उपभेदों, में Paclitaxel तर करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है सेलुलर ट्रांसपोर्टर कार्यों नीचे विनियमित करने के लिए. रक्त और ऊतकों के नमूनों paclitax की उम्मीद स्तर से पता चला एकत्रएल, कंठ लेनी 1 के बाद देखा के स्तर की रेंज में. इस तकनीक को अन्य माउस मॉडल में और अन्य आसव समाधान के साथ समान रूप से अच्छी तरह से काम करने की उम्मीद की जा सकती है.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल फॉक्स चेज़ कैंसर केंद्र संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा और प्रयोगशाला के जानवरों की सुविधा ने मंजूरी दे दी, और पशुओं के मानवीय उपचार के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार होना पाया गया है.
1. प्रारंभिक तैयारी
- कैथेटर की तैयारी: एक पतला, पा अंत (चित्रा 3 ए) फार्म को संशोधित पॉलीथीन टयूबिंग की एक छोटी लंबाई, से एक कैथेटर तैयार करें. अग्रिम में कई कैथेटर बनाओ और अनिश्चित काल के लिए बचाने के लिए.
- एक लेम्प बर्नर प्रकाश, और एक कम स्थिर लौ स्थापित करने के लिए समायोजित. पॉलीथीन नरम करने के लिए लौ के करीब ट्यूबिंग पकड़ो. ट्यूबिंग पिघल शुरू होता है, धीरे धीरे ट्यूबिंग का एक पतला अनुभाग, लगभग 0.25 मिमी आयुध डिपो बनाने के लिए दोनों सिरों के अलावा खींच.
- एक beveled अंत पतली धारा के साथ लगभग 0.75 सेमी काटें. यह पर्याप्त ट्यूबिंग एक पीढ़ी तक कैथेटर बनाने के बिना, धमनी में सुरक्षित किया जा करने के लिए सुनिश्चित करता है.
नोट: वें पर एक लंबी पतली अंतई कैथेटर रोकना एक प्रवृत्ति है. एक पीढ़ी लंबे अंत भी काफी कैथेटर के तरल मात्रा क्षमता बदलने के लिए पर्याप्त तरल पकड़ सकता है. - ठीक से गरम, अंत थोड़ा गोल और बढ़े हो जाता है जब - लौ के माध्यम से जल्दी से गुजर रहा beveled अंत कुंद. धमनी में डालने, जबकि मदद करता है जो वापस थोड़ा टिप हुक, ट्यूबिंग लंगर.
- यह पतली करने के लिए शुरू होता है इस मुद्दे पर जहां से टयूबिंग 6.0 सेमी काटें. यह एक बहुत प्रबंधनीय कैथेटर, कि अतिरिक्त ट्यूबिंग पर gnawing या प्रारंभिक खारा खाली करने के लिए बहुत ज्यादा अतिरिक्त अर्क मात्रा की आवश्यकता से माउस को रोकने के लिए गर्दन से बाहर निकलने के लिए के माध्यम से धागा करने के लिए और पकड़ लिए और आराम से साथ काम काफी लंबे समय से है, लेकिन काफी कम है बनाता है .
- लगभग 0.2 मिलीलीटर हेपरिन समाधान की एक सिरिंज तैयार, एक पा सुई के साथ अव्वल रहा. कैथेटर (3B चित्रा) की व्यापक अंत में सुई डालें. कोई बुलबुले में कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधान किया जा रहा है, हेपरिन के साथ कैथेटर भरेंट्यूबिंग. एक बाँझ क्षेत्र पर अलग हेपरिन सिरिंज और कैथेटर सेट करें. एक पेट्री डिश में कैथेटर (ओं) रखने, और गामा विकिरण का 20 Gy के लिए उजागर करके, गामा विकिरण से कैथेटर जीवाणुरहित. आप एक गामा विकिरण स्रोत के लिए उपयोग नहीं करते हैं, तो इस तरह के गैस या रासायनिक बंध्याकरण के रूप में नसबंदी के अन्य साधन, जांच करने के लिए अपने जानवरों की सुविधा के साथ की जाँच करें. पॉलीथीन गर्मी निष्फल नहीं किया जा सकता है, आटोक्लेव न करें.
- एक खारा नेतृत्व (3B चित्रा) का निर्माण.
- एक बुलबुला मुक्त लाइन सुनिश्चित करने के लिए सावधान किया जा रहा है, लगभग 0.5 मिलीलीटर की एक दूसरी सिरिंज बाँझ खारा तैयार करें.
- ट्यूबिंग का एक दूसरा टुकड़ा, लगभग 15 सेमी कट, और पा सिरिंज सुई पर पर्ची. ट्यूबिंग के मुक्त अंत करने के लिए एक संबंधक बंदरगाह संलग्न.
- खारा की कि प्रवाह सुचारू रूप से नेतृत्व के माध्यम से खारा की एक छोटी मात्रा से आगे बढ़ कर अबाधित है टेस्ट. के माध्यम से प्रवाह की जांच करने के लिए, कैथेटर प्रविष्टि के बाद इस खारा नेतृत्व का प्रयोग करेंकैथेटर, और खून की लाइन फ्लश करने के लिए. एक बाँझ क्षेत्र पर अलग खारा सिरिंज सेट करें.
- सर्जरी से पहले, गैस नसबंदी या कांच मनका नसबंदी द्वारा वैकल्पिक रूप से autoclaving द्वारा उपकरण बाँझ, या.
- बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें.
- कीटाणुनाशक जैसे 70% इथेनॉल या क्लोरीन डाइऑक्साइड के साथ बेंच और माइक्रोस्कोप सतहों साफ कर लें. एक स्वच्छ डिस्पोजेबल, शोषक पैड के साथ बेंच और माइक्रोस्कोप बेस कवर.
- सुरक्षित रूप से चिपकने वाला टेप के साथ संलग्न स्वच्छ, शोषक कागज की दो परतों के साथ कवर द्वारा एक शल्य चिकित्सा बोर्ड तैयार करें.
- वे आसानी से सुलभ हैं कि इतना (माल की सूची में सूचीबद्ध के रूप में) सभी शल्य चिकित्सा की आपूर्ति करना.
- बाँझ सीवन के तीन लंबाई, 8 सेमी प्रत्येक, और अन्य सामग्री के साथ अलग सेट काटें. यह आसानी से उपलब्ध हो जाएगा, जहां एक बंदरगाह (3B चित्रा) रखें.
2. सर्जरी
- पशु की तैयारी
- Anesthसटीक vaporizer से जुड़े संज्ञाहरण चैम्बर में 2-3 isoflurane% के लिए जोखिम के etize माउस. कक्ष से माउस को वापस लेने, और माउस की गर्दन / ऊपरी धड़ से बाल दाढ़ी, और सही कान के नीचे (कैथेटर बाहर निकलने की साइट). संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों को पशु चिकित्सा वेसिलीन नेत्र मरहम प्रशासन. प्रस्तुत करने का (कम से कम दो मिनट) से पहले, या प्रस्तुत करने के दौरान एक नाक शंकु के माध्यम से माउस को isoflurane प्रशासन द्वारा साँस लेना कक्ष में माउस पर्याप्त समय की अनुमति देकर शल्य चिकित्सा की तैयारी के दौरान जगाने नहीं करता पशु सुनिश्चित करें. संज्ञाहरण चैम्बर के लिए माउस लौटें.
- माउस पर्याप्त निष्क्रिय है जब, बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र के लिए कदम माउस के नाक और मुंह पर संज्ञाहरण नाक शंकु जगह है, और नाक शंकु के लिए isoflurane के प्रवाह हटाने की. संदंश के साथ पंजा pinching द्वारा उचित anesthetization की पुष्टि करें; माउस कोई प्रतिक्रिया से पता चलता है, अगले चरण के लिए आगे बढ़ना.
- सिर की ओर का सामना करना पड़ के साथ, अपनी पीठ पर माउस स्थितिअन्वेषक. कान, पहले से पंजे को सुरक्षित और हिंद पंजे चिपकने वाला टेप या अन्य निरोधक डिवाइस के साथ शल्य चिकित्सा बोर्ड को स्थिर माउस रखने के लिए. Povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल के साथ चीरा क्षेत्र को साफ.
- कैरोटिड धमनी का अलगाव
- अनुदैर्ध्य गर्दन के midline के अधिकार के लिए थोड़ा कटौती एक 1 सेमी बनाओ. श्वासनली (चित्रा -4 ए) का पर्दाफाश करने के लिए वसा और मांसपेशियों को अलग करने के संदंश का प्रयोग करें. श्वासनली (चित्रा 4 बी) को मन्या धमनी समानांतर चल लगाएँ.
- ध्यान से धमनी (चित्रा 4C) overlying अलग प्रावरणी संदंश का उपयोग करें. हल्के मन्या से अलग वेगस तंत्रिका खींच, और बीच की जगह में संदंश डालें. धीरे खुला संदंश (जहाँ तक (कम से कम 3 मिमी) संभव के रूप में (पीछे), प्रावरणी में एक अंतर बनाने के लिए, और ध्यान से गला (पूर्वकाल अंत) के पास धमनी में कांटा से, धमनी से तंत्रिका दूर करना चित्रा 4D).
- किसी भी पुनः स्पष्ट दूरधमनी में अच्छी तरह से अलग है जब तक maining प्रावरणी (चित्रा 4E). नम है, और इस प्रकार कम भंगुर और बेतरतीब ढंग से फाड़ कम होने का खतरा ऊतक रखने के लिए कभी-कभी सर्जरी क्षेत्र में खारा की एक बूंद जोड़ें.
- सिवनी नियुक्ति और कैथेटर प्रविष्टि के लिए धमनी तैयारी (आंकड़े 4, 5).
- धमनी के तहत एक रेशम सिवनी धागा आकर्षित करने के लिए संदंश का प्रयोग करें. संभव (चित्रा 4F) के रूप में पूर्वकाल की ओर जहाँ तक धमनी बंद बंद करने के लिए एक सुरक्षित गाँठ बाँध.
- धमनी के तहत एक दूसरे धागा ड्रा. अस्थायी रूप से संभव (चित्रा 4F) के रूप में पीछे की ओर जहाँ तक धमनी बंद बंद करने के लिए एक त्यागने योग्य गाँठ बाँध.
- धमनी के तहत एक तिहाई धागा ड्रा. पहले दो टांके के बीच एक बहुत ढीला गाँठ बाँध जल्दी प्लेसमेंट (चित्रा 4 जी) के बाद कैथेटर सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- 70% इथेनॉल के एक बिट के साथ उन्हें गीला करके रास्ते से बाहर सभी टांके के सिरों को पकड़ो.
- सीवन के साथ, धमनी थोड़ा तना हुआ खींच लिए कम गाँठ हड़पने. निक ऊपर धमनी, लेकिन पूर्वकाल सिवनी (चित्रा 4H), के बहुत करीब. बहुत गहराई से कटौती करने के लिए नहीं सावधान रहो, लेकिन उद्घाटन अबाधित है बनाना भट्ठा की जाँच करें.
- या तो अंत में हवा के बड़े जेब बनाने से बचने की कोशिश कर रहा, सिरिंज सुई से हेपरिन-भरा कैथेटर निकालें. (दाएं हाथ के लिए) आम तौर पर नीचे, और थोड़ा सही करने के लिए, एक आरामदायक कोण पर उठाव की स्थिति के लिए कैथेटर हेरफेर.
- सीवन पर पकड़ थोड़ा तना हुआ शेष धमनी रखने के लिए करते हैं, धीरे भट्ठा (चित्रा 4i) में कैथेटर डालने. पूर्वकाल सीवन पकड़ और कैथेटर के ऊपर (धमनी पंचर beveled अंत का कारण हो सकता कैथेटर के साथ जरूरत से ज्यादा धक्का) नीचे धमनी पुल संदंश का प्रयोग करें. ध्यान से कैथेटर और पूर्वकाल सीवन जारी.
- धमनी में कैथेटर के प्रवेश द्वार के करीब मध्य सीवन की गाँठ, कस द्वारा कैथेटर सुरक्षित. एक तंग ट्रिपल गाँठ बना है, लेकिन कैथेटर के माध्यम से प्रवाह में बाधा डालती रूप में इतनी तंग खींच नहीं करना सुनिश्चित करें. इसके अलावा धमनी के लिए प्रवेश द्वार के नीचे, पूर्वकाल सीवन के साथ नीचे बांधने से कैथेटर सुरक्षित.
- फिर लाइन में हवा के बुलबुले शुरू करने से बचने की कोशिश कर रहा, कनेक्टर प्लग के माध्यम से कैथेटर को खारा नेतृत्व संलग्न.
- पीछे सीवन की छोर समझ और धीरे गाँठ जारी करने के लिए खींच. धमनी नीचे सीवन पैंतरेबाजी, कैथेटर के अंत पर (धागा दूर नहीं है). रक्त कैथेटर में बहना चाहिए; कोई रक्त प्रवाह है, तो धीरे कसना दूर करने के लिए प्रयास करने के लिए कैथेटर wiggle.
- प्रवाह अबाधित प्रकट होता है, थोड़ा बीच सिवनी से ऊपर, एक अतिरिक्त गाँठ बाँध (पीछे सिवनी से) पिछले धागे का उपयोग करें.
- प्रत्येक हाथ में संदंश के साथ, बस पूर्वकाल सीवन नीचे कैथेटर पर पकड़ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें, और यह आसानी से पक्ष को झुकना होगा तो दूसरे के साथ, कैथेटर में एक गांठ दबाएँ. एक दूसरे गुत्थी बनाने के लिए दोहराएँ. इस कैथेटर के मुक्त अंत धमनी की दीवार के खिलाफ पार्श्व बारी करने के लिए कैथेटर की नोक मजबूर बिना माउस के सिर के पीछे की ओर खींचा जा सकता है.
- मुंह और नाक पर तैनात नाक शंकु रखते हुए अपनी (बाएं) की ओर पर माउस मुड़ें, और 70% इथेनॉल और povidone आयोडीन के साथ चीरा क्षेत्र को साफ. एक छोटा सा चीरा नीचे और दाएं कान के पीछे (लगभग 4 मिमी) बनाते हैं. गाल के माध्यम से एक चैनल बनाने के लिए त्वचा के नीचे कुंद खोखले जांच कार्य करते समय गर्दन पर गुहा को, त्वचा के खुले फ्लैप पकड़ संदंश का प्रयोग करें. यह बजाय ग्रंथि और त्वचा के बीच जाने की कोशिश की, लार ग्रंथि के आसपास जांच लाने की सलाह दी जाती है. ध्यान से जांच बाहर निकलने के लिए के लिए एक स्थान मुक्त संदंश का प्रयोग करें.
- रेशम या स्टेपल के साथ सीने में चीरा को सामयिक एनाल्जेसिक, और करीब घाव प्रशासन.
- संज्ञाहरण से माउस निकालें, और जानवर एक स्वच्छ में ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं, एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर अंतरिक्ष (जगह पिंजरे गरमया एक गर्मी दीपक के नीचे), कम से कम 30 मिनट के लिए.
3. आसव
- 5 मिलीग्राम / Paclitaxel / मेथनॉल के मिलीलीटर समाधान की aliquots तैयार करें.
- एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में Paclitaxel की 50 मिलीग्राम उपाय. बाँझ मेथनॉल के 10 मिलीलीटर जोड़ें. कैप ट्यूब. पाउडर भंग कर रहा है जब तक हाथ से या कमरे के तापमान पर एक घूर्णन प्रकार के बरतन पर घुमाएं.
- विभाज्य -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 20 छोटे, फ्रीजर सुरक्षित ट्यूबों में समाधान के μl, और दुकान.
- तुरंत निषेचन से पहले कमरे के तापमान पर या 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गल व्यक्ति विभाज्य,.
- आसव पंप (चित्रा 6) तैयार करें.
- लगभग 40 सेमी की पॉलीथीन टयूबिंग की एक लंबी लंबाई में कटौती. एक छोर से एक पा सुई, और अन्य के लिए एक संबंधक बंदरगाह संलग्न.
- वें की गति की गणना करने के क्रम में, सबसे प्रोग्राम पंप सिरिंज प्रति बैरल के व्यास की आवश्यकता होगी (एक ज्ञात भीतरी व्यास के साथ एक सिरिंज में दवा ड्राई पंप एआरएम). सिरिंज से सुई देते हैं और सुई और ट्यूबिंग के माध्यम से दवा लोड.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार पंप में सिरिंज बैठाना. प्रधानमंत्री पंप इतना है कि दवा कनेक्टर प्लग बाहर सुचारू रूप से बह रहा है, और यह निषेचन के लिए तैयार है.
- पंप करने के लिए माउस संलग्न.
- स्थिर माउस पकड़ और बंदरगाह प्लग के करीब कैथेटर, दबाना hemostat का उपयोग करें. प्लग निकालें और सिरिंज और टयूबिंग से जुड़ी कनेक्टर के साथ बदलें.
नोट: रक्त ट्यूबिंग के माध्यम से वापस प्रवाह करने के लिए शुरू हो सकता है. - जल्दी कैथेटर की मात्रा खाली करने के लिए एक तेजी से पंप प्रशासन (ट्यूबिंग के 6 सेमी की मात्रा देख के माध्यम से अनुभव से गणना), तो तुरंत वांछित निषेचन दर करने के लिए स्विच.
- स्थिर माउस पकड़ और बंदरगाह प्लग के करीब कैथेटर, दबाना hemostat का उपयोग करें. प्लग निकालें और सिरिंज और टयूबिंग से जुड़ी कनेक्टर के साथ बदलें.
- तीन घंटे का समय पाठ्यक्रम के लिए पैक्लिटैक्सेल अर्क जारी रखें.
- इस बार माउस को प्रवाह में रुकावट की निशानी के रूप में जंक्शनों पर लीक के लिए जाँच करने के लिए कभी कभी ट्यूबिंग मॉनिटर.निषेचन (सुस्ती या सक्रियता, बेचैनी के लक्षण) की उम्मीद या अप्रत्याशित प्रतिक्रियाओं के लिए माउस देखो.
- निषेचन की लंबाई और प्रकृति पर निर्भर करता है, माउस खाने या पीने, लेकिन संस्था की स्थापना की नीति के अनुसार भोजन और पानी के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए यकीन नहीं किया जा सकता है. रक्त की एक बड़ी मात्रा का संग्रह के माध्यम से माउस dehydrating के लिए संभावित से अवगत रहें.
- माउस दूर गर्मी से दूर रहने की इच्छा प्रकट होता है, जब तक एक हीटिंग पैड या दीपक के साथ पिंजरे गर्म रखने के लिए आगे बढ़ें. पशु शल्य चिकित्सा के बाद कई घंटे के भीतर euthanized नहीं है, शल्य चिकित्सा के बाद दर्द के लिए बाँझ आवास की स्थिति और उपचार सहित पशु की शल्य चिकित्सा के बाद उपचार के लिए योजना को लागू.
- (एक गरीब प्रविष्टि का संकेत हो सकता है) ट्यूबिंग से सक्रियता के माध्यम से ट्यूबिंग, या जलन बाहर खींच नहीं करता है सुनिश्चित करने के लिए, विशेष रूप से पहले कुछ मिनट में, माउस पर कड़ी नजर रखें. माउस से अधिक सक्रिय नहीं है, तो लगातार monitoअंगूठी आवश्यक हो, लेकिन पशु ट्यूबिंग में उलझ नहीं करता है सुनिश्चित करने की नियमित माउस की जाँच नहीं कर सकते हैं. दोहन और तार प्रणाली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन उनके उपयोग इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है.
- नमूने का संग्रह.
- (अपने प्रोटोकॉल, स्तन ट्यूमर मॉडल का उपयोग कर मन्या कैथेटर के रूप में एक ही समय में डाला कंठ कैथेटर के माध्यम से रक्त का संग्रह पर विचार नहीं करता है) अवअधोहनुज या रेट्रो कक्षीय bleeds द्वारा नियमित अंतराल पर रक्त के नमूने ले लीजिए. आसव लाइन पर खींचने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. रेट्रो कक्षीय bleeds द्वारा एकत्रित करते हैं, तो हल्के से एक inhalational संवेदनाहारी के साथ माउस anesthetize (जैसे methoxyflurane) तो एक माउस सुरक्षित करने के लिए कूड़ा द्वारा हड़पने की जरूरत नहीं है.
- प्लाज्मा से रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए hemocrit अपकेंद्रित्र में रक्त स्पिन. चरण जुदाई के चेहरे पर ट्यूब स्कोर करने के लिए एक फ़ाइल या हीरे की नोक कलम का उपयोग करें. ट्यूब तोड़ और छोटे, फ्रीजर सुरक्षित ट्यूब में, केवल प्लाज्मा इकट्ठा. पर स्टोर -विश्लेषण जब तक 80 डिग्री सेल्सियस.
नोट: एक hemocrit अपकेंद्रित्र उपलब्ध नहीं है, तो प्लाज्मा से रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए उच्च गति पर एक माइक्रो अपकेंद्रित्र में रक्त सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में नमूना, और स्पिन हस्तांतरण. एक दूसरा ट्यूब में प्लाज्मा लीजिए, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर. - सीओ 2 asphyxiation द्वारा माउस euthanize. तरल नाइट्रोजन में ब्याज और फ्लैश फ्रीज के अंगों से - (50 मिलीग्राम के बारे में 20) ऊतक लीजिए. विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
4. नमूना विश्लेषण
नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए सभी नमूनों तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एक बाहर प्रयोगशाला के माध्यम से विश्लेषण किया गया - निम्नानुसार Paclitaxel सांद्रता गणना की जो (नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस),:
- नमूनों से Paclitaxel निकालें. 0.1% एसिटिक एसिड में ऊतक नमूना, निकासी के लिए पहले 50% मेथनॉल homogenize. (मिथाइल tert-butyl ईथर का उपयोग, तरल / तरल निष्कर्षण द्वारा Paclitaxel निकालेंएक आंतरिक अनुरूप (docetaxel) मानक के साथ दृढ़ एमटीबीई). एमटीबीई और सूखी नमूने निकालें. 50% acetonitrile, 0.1% एसिटिक एसिड के घोल में Resuspend.
- अंशांकन मानकों तैयार करें. (ऊतकों के नमूनों के लिए 0.1 5,000 एनजी / एमएल से, प्लाज्मा के नमूने के लिए 1 से 20,000 एनजी / एमएल से) मानकों की एक अंतिम सीमा प्राप्त करने के लिए C57BL 6 / मैट्रिक्स उपयुक्त Paclitaxel की एक ज्ञात एकाग्रता जोड़ें. उपरोक्त अध्ययन के नमूने के लिए के रूप में एक ही विधि का उपयोग, दो प्रतियों में मानकों निकालें. Electrospray आयनीकरण उपयोग एचपीएलसी / एमएस / एमएस द्वारा नमूनों में Paclitaxel शिखर उपाय.
- आंतरिक मानक के Paclitaxel के क्षेत्र अनुपात का उपयोग एकाग्रता की गणना. वक्र पर फिट द्वारा एक मानक वक्र, और interpolated अध्ययन नमूने बनाने के लिए अंशांकन मानकों का प्रयोग करें. Homogenization के पहले नमूने के शुरू करने के लिए वजन द्वारा अध्ययन के नमूनों की एकाग्रता सामान्यकरें.
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Representative Results
Paclitaxel वितरण एक 165 मिनट कम गति निषेचन के बाद 15 मिनट के लिए उच्च गति लगाने की एक 3 घंटा खुराक आहार के दौरान उम्मीद के मुताबिक पैटर्न, इस प्रकार है.
चित्रा 1 गले नस-अर्क प्लाज्मा Paclitaxel सांद्रता और मन्या धमनी-सुई लेनी की तुलना से पता चलता है. Paclitaxel सांद्रता एक प्रारंभिक उच्च मात्रा निषेचन के बाद पहले 15 मिनट में जल्दी से ड्रॉप, और फिर अगले 150 मिनट से अधिक बंद स्तर. तुलना करके, एक गरीब निषेचन में Paclitaxel का स्तर नीचे परख भर में बंद अपेक्षाकृत कम शुरू, और ऊपर मंडराना और. यह सबसे अधिक संभावना जल्दी निषेचन में लाइन में एक रुकावट की वजह से हुई. परख का रिकार्ड माउस दवा के एक अवर प्रशासन के विचार की पुष्टि, संचार के लिए कोई बाहरी प्रतिक्रिया के लिए बहुत कम था दिखा. के अंत में, 2 जिगर और मस्तिष्क के ऊतकों, साथ ही रक्त प्लाज्मा में Paclitaxel के रिश्तेदार के स्तर से पता चलता है 3 घंटा आसव.
हमेशा ">:" रख-together.within पृष्ठ = के लिए "jove_contentचित्रा 1:. मन्या और कंठ लेनी दौरान प्लाज्मा Paclitaxel का स्तर घटता व्यक्तिगत चूहों में प्लाज्मा Paclitaxel सांद्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रत्येक माउस एक प्रारंभिक उच्च गति से मिलकर, एक Biphasic अर्क प्राप्त, तुरंत एक कम गति से पीछा 0.42 मिलीग्राम / किग्रा / मिनट के 15 मिनट के अर्क, 0.021mg / किग्रा / मिनट की 165 मिनट आसव. मन्या निषेचन के लिए वक्र (नीलामी) के तहत क्षेत्र / एमएल लगभग 37 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / ∙ मिनट के गले का निषेचन के लिए एक नीलामी बनाम ∙ मिनट लगभग 59 माइक्रोग्राम प्रति था. मन्या निषेचन के लिए उत्पन्न घटता से गणना की Paclitaxel का आधा जीवन 10 मिनट था और गले का निषेचन के लिए 11 मिनट का था. मन्या अर्क कंठ निषेचन की तुलना में दवा एकाग्रता के लगभग बराबर के स्तर से पता चलता है. चक्र के ऊपर और नीचे, अक्सर r कि सतत कम सांद्रता, या सांद्रताएक गरीब अर्क epresent.
चित्रा 2:. ऊतक से पैक्लिटैक्सेल एकाग्रता तुरंत पिछले रक्त के नमूने की 3 घंटा Paclitaxel अर्क और संग्रह के बाद, माउस euthanized किया गया था, और जिगर और मस्तिष्क के ऊतकों के नमूने एकत्र किए गए थे. Paclitaxel एकाग्रता प्लाज्मा में स्तर और ऊतकों जन-कल्पना विश्लेषण द्वारा हासिल किया गया. इस डेटा चित्रा 1 में मन्या आसव-माउस से एकत्र नमूनों का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3: सर्जिकल सामग्री. (ए) कैथेटर उत्पादन पुन: की अनुमति है, जबकि सामग्री के खर्च वाले खुद कैथेटर नीचे रहता पुलिंगखोजकर्ता आकार और माउस उम्र और आकार के लिए कैथेटर का आकार दर्जी के लिए (बी) सर्जरी से पहले तैयार:. तीन (3) रेशम टांके, लगभग 8 सेमी प्रत्येक; बाँझ बंदरगाह प्लग; खारा सिरिंज और नेतृत्व; कैथेटर, हेपरिन सिरिंज से जुड़ी.
चित्रा 4: मन्या धमनी और कैथेटर प्रविष्टि की तैयारी. त्वचा के माध्यम से कट (ए), ग्रंथियों तरफ ले जाने और निहायत अलग वसा मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए संदंश का उपयोग करें. (बी) धीरे अलग मांसपेशी ट्रेकिआ के दाईं ओर का पर्दाफाश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें. कैरोटिड धमनी (ई). (डी). धमनी के आसपास (सी) तोड़ प्रावरणी. ट्रेकिआ के समानांतर चल रहे हैं, मन्या धमनी से अलग वेगस तंत्रिका, सबसे बड़ी मोटी दीवारों जहाजों के रूप में दृष्टिगोचर हो caroti तक प्रावरणी को हटाने के लिए जारी रहेगाडी पूरी तरह से गुहा के साथ अलग है. पीछे छोर पर (एफ) सिवनी स्थायी पूर्वकाल छोर पर गाँठ, और पर्ची गाँठ. (जी) तीसरे सिवनी मन्या के तहत पिरोया और बहुत शिथिल knotted है. (एच) धमनी बस पूर्वकाल सीवन ऊपर nicked है. ( मैं) धमनी में निक में कैथेटर डालें. कैथेटर से अधिक नीचे धमनी खींचने के लिए संदंश के साथ पूर्वकाल सीवन पकड़ो. (जे) सुरक्षित कैथेटर सभी तीन टांके के साथ मन्या धमनी में.
चित्रा 5:.. सिवनी नियुक्ति शल्य साइट की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पहले और बाद में कैथेटर स्थापना एक आंकड़ा 4H में के रूप में, धमनी में एक निक के अलावा के साथ, तस्वीर चित्रा 4 जी के साथ मेल खाती है.
चित्रा 6:. संचार सेट-अप सिरिंज के योजनाबद्ध दवा से भरा है, और एक कुंद सुई के साथ छाया हुआ है. पॉलीथीन लाइन मन्या कैथेटर के लिए सिरिंज देता है. पम्प धीरे धीरे खून में सीधे वर्दी खुराक देने के लिए, सिरिंज compresses.
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Discussion
कैरोटिड धमनी अर्क Paclitaxel फार्माकोकाइनेटिक्स के इस अध्ययन में एक महत्वपूर्ण तकनीक है. कैरोटिड धमनी अर्क जल्दी से संचार प्रणाली 14 भर में दवा वितरित करने के लिए एक विधि है. 3 घंटा अर्क ऐसे सांस में इंजेक्शन से taxanes के रूप में दवाओं के क्लिनिकल प्रशासन के करीब नकल है. सर्जरी मज़बूती से एक ही व्यक्ति द्वारा किया जा सकता है, सर्जरी के समय अपेक्षाकृत कम है, और सफलता दर> 75% हैं. नमूने एकत्र करने के बाद, वे उचित तरीके से विश्लेषण किया जाना चाहिए. हम प्लाज्मा और ऊतकों के नमूनों में Paclitaxel एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री इस्तेमाल किया. आगे इस तकनीक को मान्य करने के लिए, हम विश्लेषण के लिए एक स्वतंत्र प्रयोगशाला में रक्त और ऊतकों के नमूनों भेजा. इस डेटा प्रत्येक जानवर का परीक्षण (चित्रा 1) के लिए अलग-अलग प्लाज्मा Paclitaxel एकाग्रता घटता प्लॉट के रूप में किया गया था, और Paclitaxel का वितरण विभिन्न ऊतकों (चित्रा 2) में तुलना की गई थी. प्रत्येक मामले में, यह आईएम हैदवा और ब्याज के सिस्टम के आधार पर दवा वितरण और / या चयापचय का विश्लेषण करने के लिए सबसे अच्छा तरीका विचार करने के लिए अहम. विभिन्न दवाओं की माप के लिए अन्य विकल्पों एचपीएलसी यूवी या immunoassays 2 शामिल हो सकते हैं.
सफल मन्या कैथीटेराइजेशन के लिए आवश्यक दो प्राथमिक कारकों अच्छी तरह जमाने कैथेटर और बेहतर धमनी अलगाव हैं. माउस मॉडल के आकार के अनुसार कैथेटर fashioning सर्वोपरि है. कैथेटर व्यास भी मोटी है एक बहुत पतली कैथेटर सुरक्षित करने के लिए कठिन है और पहले या निषेचन के दौरान रोकना संभावना होगी, जबकि धमनी में प्रविष्टि, पीढ़ी मुश्किल हो जाएगा. कैथेटर टिप के कोण और तीखेपन भी एक मध्यम रेंज में होना चाहिए; मुश्किल होगा भी सुस्त है कि एक टिप धमनी में सम्मिलित करने के लिए है, जबकि धमनी दीवार पंचर हो सकता है बहुत तेज है कि एक टिप. यहां दिए गए माप एक मॉडल टेम्पलेट के रूप में, दस सप्ताह पुरानी C57BL / 6J चूहों, लगभग 20 ग्राम का उपयोग कर प्राप्त किए गए. माप बढ़ाया जाना चाहिएऊपर या नीचे अनुभव से अलग-अलग मॉडल फिट करने के लिए.
कैरोटिड धमनी के अलगाव एक नाजुक, जानबूझकर प्रक्रिया ऊतक को अनावश्यक नुकसान से बचने के लिए और बड़े पैमाने पर खून बह रहा रोकने के लिए होना चाहिए. चमड़े के नीचे वसा आम तौर पर आसानी से मध्यम तेज संदंश के लिए कम से अलग किया जा सकता. मन्या अधिक मांसपेशियों के ऊतकों मांसपेशी फाइबर के पूर्वाग्रह के साथ इत्तला दे दी संदंश ठीक करने के लिए मध्यम से अलग किया जाना चाहिए. एक अधिक व्यापक अंतराल आवश्यक है, तकनीशियन छोटे रक्त वाहिकाओं rupturing से बचने के लिए अत्यंत सावधान रहना चाहिए. मन्या दिख रहा है एक बार, अभी भी ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ धमनी से दूर tweezed होने की जरूरत है कि प्रावरणी का एक उचित मात्रा में हो जाएगा. अंत में, वेगस तंत्रिका या तो क्षति के बिना मन्या धमनी से अलग किया जाना चाहिए. मन्या ठीक से पृथक किया जाता है, यह धमनी के दोनों तरफ एक खाली जगह के साथ, नीचे संदंश डालने के लिए संभव होना चाहिए (चित्रा 4E देखें).
जब Trouble शूटिंग गरीब सुई लेनी, अन्वेषक उम्मीद की खुराक देने के लिए पंप क्रमादेशित ठीक से किया है कि यह सुनिश्चित हो पंप पर निर्देश की समीक्षा द्वारा शुरू करते हैं. फिर, ध्यान से परीक्षण जानवर में शुरू हो जाएगा कि मात्रा बदलने पर विचार. दवा के कमजोर पड़ने खुराक की मात्रा उचित है कि इतनी गणना की जानी चाहिए: मात्रा पशु सहन करने के लिए, और आदर्श काफी रक्तचाप को प्रभावित नहीं करेगा लिए बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए; पंप मज़बूती देने के लिए, और जंक्शनों पर मोज़री से बचने के लिए एक सतत प्रवाह पैदा करेगा के लिए अभी तक मात्रा काफी बड़े होने चाहिए. मोज़री एक नियमित घटना बन गया, एक छोटे गेज (बड़ा व्यास) सुई और ट्यूबिंग को बदलने पर विचार. प्लाज्मा दवा सामग्री की उम्मीद के स्तर तक पहुँच नहीं है अगर इसके अलावा, शोधकर्ता चूहों कैथेटर अच्छी तरह से धमनी में रखा और मुक्त बह रहता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए पोस्टमार्टम पोस्ट की जांच, और आवश्यक के रूप में कैथेटर का आकार / आकार को संशोधित करना चाहिए.
usefulnइस विधि का ईएसएस आकार और विषय के सामान्य स्वास्थ्य, और निषेचन के समय का इरादा लंबाई जैसे कारकों द्वारा सीमित किया जा सकता है. सर्जरी और अर्क एक पहले से ही व्यथित विषय overtax कर सकते हैं. यहां तक कि एक स्वस्थ पशु में, मन्या धमनी कैथेटर अल्पावधि सुई लेनी, कई दिनों के लिए आम तौर पर कई घंटे के लिए ही उपयुक्त है. चूहों ऐसी साइटों घाव को सामयिक संज्ञाहरण के दोहराया अनुप्रयोगों, या अग्रकय प्रणालीगत दर्दनाशक दवाओं के रूप में, दवा निषेचन के जवाब में तकलीफ के लक्षण दिखाने अगर उपयोग किया जाएगा क्या दर्द से राहत के तरीकों पर विचार करें. स्थानीय पशु नियामक संगठन या IACUC द्वारा अनुमोदित सभी जानवर काम है करने के लिए इस प्रक्रिया को करने के लिए उचित अनुमति प्राप्त करने के लिए यह आवश्यक हो जाएगा. यह एक लंबे समय तक जान फूंकना है करने के लिए, या माउस समय की एक विस्तारित अवधि के लिए अर्क जीवित रहने के लिए आवश्यक है, तो वैकल्पिक अर्क तरीकों का पता लगाया जाना चाहिए.
अध्ययन में महारत हासिल मन्या धमनी perfusions होने के बादPaclitaxel की फार्माकोकाइनेटिक्स की, हम C57BL / 6J और FVB चूहे, और अन्य माउस मॉडल में अन्य औषधियों के प्रभाव, और Abcc10 modulators जांच करने के लिए भविष्य में इस तकनीक का उपयोग करने की योजना है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम इस परियोजना में उनके समर्थन के लिए FCCC प्रयोगशाला जानवरों की सुविधा स्वीकार करना चाहते हैं. हम प्लाज्मा और ऊतकों में Paclitaxel के स्तर का विश्लेषण करने में उनकी सहायता के लिए वोल्फ प्रयोगशालाओं, Inc धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान EHB को K01CA120091 अनुदान, और CA06927 फॉक्स के लिए चेस कैंसर केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
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