Summary
Nematodi entomopatogeni sono nematodi del suolo abitare che parassitano una vasta gamma di insetti. Dimostriamo metodi di campionamento utilizzati per l'isolamento di questi nematodi dal terreno utilizzando due tecniche: l'adescamento insetto e la trappola bianco modificato, per il recupero dei nematodi dai campioni di suolo e cadaveri insetti infetti, rispettivamente.
Abstract
Nematodi entomopatogeni (aka EPN) rappresentano un gruppo di nematodi del suolo abitare che parassitano una vasta gamma di insetti. Questi nematodi appartengono a due famiglie: Steinernematidae e Heterorhabditidae. Fino ad oggi, più di 70 specie sono state descritte nel Steinernematidae e ci sono circa 20 specie in Heterorhabditidae. I nematodi hanno una collaborazione mutualistica con i batteri Enterobacteriaceae e insieme agiscono come un complesso potente insetticida che uccide una vasta gamma di specie di insetti.
Qui, ci concentriamo sulle tecniche più comuni considerati per la raccolta EPN dal suolo. La seconda parte di questa presentazione si concentra sulla tecnica insetti adescamento, un approccio ampiamente utilizzato per l'isolamento di EPN dai campioni di suolo, e la tecnica trappola bianco modificato che viene utilizzato per il recupero di questi nematodi da insetti infetti. Questi metodi e le tecniche sono passaggi fondamentali per la creazione di successo di culto EPNUres in laboratorio e anche la base per altri testi biologici che considerano questi nematodi come organismi modello per la ricerca in altre discipline biologiche. Le tecniche mostrate in questa presentazione corrispondono a quelle eseguite e / o creazione di membri della SP Archivio laboratorio così come quelli descritti da vari autori.
Introduction
Molti nematodi sono associati con gli insetti, e le loro interazioni ospite variano da vantaggioso per dannosa. Qui, ci concentriamo su un gruppo di nematodi che sono patogeni di insetti, noto anche come nematodi entomopatogeni (o EPN). Due famiglie di nematodi appartengono a questo gruppo di nematodi: Steinernematidae e Heterorhabditidae 11,13. Il loro effetto patogeno è infatti conferita dalla loro interazione con anaerobi facoltativi batteri enterici (batteri Xenorhabdus associano con steinernematids e batteri Photorhabdus associare a heterorhabditids) 2. I batteri sono vectored da un host ad un altro insetto da parte l'unica tappa libero nematode vita, il giovane infettivo terzo stadio (noto anche come dauer giovanile, giovanile infettiva o IJ), che vive nel terreno. Una volta dentro l'insetto, i nematodi rilasciano i batteri nella emolinfa dell'insetto, che uccidono l'insetto ospite da una massiccia setticemia. I batteri anchedegradare i tessuti dell'insetto e diventano fonte di cibo dei nematodi ', consentendo loro di maturare e moltiplicarsi. Di solito, una o due generazioni di nematodi adulti sono prodotte all'interno del cadavere insetto. La progenie degli ultimi riassocia generazione adulta con poche cellule batteriche in più specializzarsi modo che il loro precedente rapporto nutrizionale, e coltivare queste cellule nei loro intestini mentre si muovono fuori dalla carcassa insetti nel terreno dove potranno attendere un altro insetto di parassitare 6,11,14 (Figura 1).
Sin dalla loro scoperta nel 1927, EPN sono stati considerati importanti alternative ai pesticidi chimici in quanto possono parassitare una vasta gamma di insetti che sono parassiti agricoli 3,4,5. Tuttavia, negli ultimi due decenni, questi nematodi e dei loro batteri simbionti sono stati riconosciuti come sistema modello malleabile per studiare aspetti biologici, ecologici ed evolutivi di ospite-microbo interactions 14.
L'obiettivo di questa presentazione è quello di mostrare i metodi e le tecniche più comunemente utilizzate per il campionamento del suolo e l'isolamento di EPN. Una varietà di strumenti è disponibile e può essere utilizzato per raccogliere campioni di terreno, tra cui: defittonatrici suolo, cazzuole, trivelle, trivelle, tubi di campionamento, pale a mano, tra gli altri (Figura 2).
A seconda dello scopo dello studio, due strategie di campionamento possono essere considerati: a) stratificato, b) campionamento casuale (Figura 3). Il campionamento stratificato è solitamente utilizzato come parte di uno studio intensivo in una zona specifica o demarked in un determinato periodo di tempo. In generale, un transetto è demarked e campioni di suolo sono presi a intervalli stabiliti nel transetto per un periodo di tempo (Figura 3A) 15. Il campionamento casuale viene generalmente impiegato quando concentrandosi su una vasta area. Questa strategia di campionamento è stato utilizzato per studiare la diversità di EPN fROM una vasta area geografica o regione (Figura 3B) 12. Una serie di fattori può essere considerato in funzione del focus dello studio tra cui una vasta gamma di altezze, texture del suolo e degli habitat (ad es., Campi coltivati, boschi, pascoli, parchi, spiagge, aree ripariali, ecc.)
Mostriamo la tecnica dell'insetto adescamento, che è stato originariamente descritto da biancheria da letto e Akhurst 1 e rappresenta un semplice e selettivo alternativa per il recupero EPN da campioni di suolo. Questa è una procedura selettiva che si basa sul presupposto che i nematodi (fase IJ) saranno attratti a un host insetto e parassitano esso. Questa tecnica può anche essere considerato per l'isolamento di altri patogeni insetti quali funghi e batteri 8,10.
Abbiamo anche dimostrare la tecnica trappola bianco modificato, che viene utilizzato per il recupero nematode progenie di insetti infetti padroni di casa 7,14. Si tratta di un sforzo incontratohod che offre il vantaggio di recuperare un 'clean' nematode progenie priva di detriti dai cadaveri di insetti degradanti.
Infine, le tecniche descritte ed illustrate in questo articolo corrispondono a quelli concepiti e / o eseguite nel nostro laboratorio così come quelli descritti da vari colleghi e collaboratori.
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Protocol
1. Soil Sample Collection
- Si consideri che copre una superficie minima di 2-4 m 2 per ogni sito di campionamento.
- Raccogliere campioni di terreno a una profondità di almeno 15 cm (Figura 4).
- Prendere almeno 5 campioni casuali all'interno di questa area.
- Prendere 3 sottocampioni per campione. Seconda dell'obiettivo dello studio, sia combinare sottocampioni o mantenerli separati.
- Collocare ogni campione in un sacchetto di plastica. Considerare doppio insaccamento per evitare perdite di campioni (Figura 4).
- Campioni etichetta con un pennarello indelebile. Includere le seguenti informazioni da ogni sito di campionamento: Informazioni sul sito (compresi località / zona / nome e GPS informazioni coordinare posto), la data, l'habitat, la vegetazione associata, temperatura, altitudine, ecc
NOTA: Se necessario, raccogliere e / o registrare la presenza di insetti o altri invertebrati raccolti con il campione per la successiva identificazione. Essi possono rappresentare potenziali naturpadroni di casa al EPN. - Strumenti di raccolta Pulire accuratamente tra i campioni di lavaggio con acqua e / o disinfezione con il 70% di etanolo o soluzione di candeggina allo 0,5%.
- I campioni in un dispositivo di raffreddamento (8 - 15 ° C) durante il trasporto al laboratorio.
- Prendete una porzione del campione di suolo per l'analisi per ottenere informazioni sulla composizione del suolo, tessitura, umidità, conducibilità elettrica o di altri parametri pedologici desiderati.
. 2 Isolamento Nematode da campioni di suolo: Tecnica Insect-baiting
- Rimuovere eventuali detriti (per esempio., Pietre, pezzi di legno o di corteccia, foglie, ecc.) Raccolti con i vostri campioni per evitare la contaminazione con microrganismi saprobico.
- Aggiungere acqua per inumidire il terreno e agevolare la circolazione dei nematodi.
NOTA: Utilizzare un flacone spray per aumentare lentamente il livello di umidità del suolo. - Posizionare circa 200 a 250 ml di terreno umido in un contenitore di plastica pulito con un coperchio.
- Aggiungi esche insetti. Considerare 5 a 10 insetti alla superficie del suolo di ciascun campione (Figura 5).
- Coprire il contenitore con un coperchio e girare contenitori a testa in giù.
- Mantenere contenitori in un luogo buio a RT (solito, la 22 - 25 ° C).
- Controllare contenitori ogni 2-3 giorni, e rimuovere gli insetti morti.
NOTA: aggiungere altri insetti sani per ogni contenitore per un ulteriore adescamento del campione di terreno. - Rimuovere gli insetti morti dai contenitori. NOTA: Cadavers con un marrone o ocra colorazione di solito sono parassitati da steinernematids, mentre il rosso di cadaveri viola scuro mattoni sono parassitato da heterorhabditids.
- Sciacquare cadaveri in acqua sterile.
- Mettere cadaveri in una trappola bianco modificato per il recupero del nematode progenie (vedi procedura riportata di seguito).
3. Nematode Recovery da cadaveri infetti: Modificato Trappola bianca
- Posizionare la parte superiore di un diametro di 50 (o 60) mm. Capsula Petri all'interno di una parabola più grande (100 mm).
- Impostare un peccatocarta da filtro circolare gle (Whatman # 1) all'interno del piatto più piccolo.
- Posizionare cadaveri sulla carta da filtro del piatto più piccolo assicurandosi cadaveri non si toccano a vicenda per evitare qualsiasi contaminazione.
- Riempire l'esterno (grande) Scatola di Petri con ca. 20 ml di acqua distillata sterile. Non aggiungere acqua nel piatto che contiene i cadaveri.
- Coprire il grande piatto Petri e il suo contenuto con il coperchio (Figura 6).
- Etichettare i piatti di conseguenza. Aggiungere le seguenti informazioni: nome Nematode (specie / isolato), la data di infezione (infezione data è stata fissata) e quella trappola (questa è la data della trappola è impostato).
- Tenere trappola a RT finché non si verifica emergere di stadi giovanili infettive (IJ). Questo processo può richiedere tra i 10 - 25 giorni a seconda delle specie e / o varietà considerata nematodi.
- Acqua raccolta con IJs rimuovendo il più grande piatto della trappola e versando acqua con nematodi in un bicchiere.
- Consentire nematodi decantare sul fondo della bEaker. Questo processo può richiedere alcuni minuti.
- Versare acqua accuratamente, assicurandosi nematodi rimangono nel fondo del bicchiere.
- Risciacquare nematodi con l'aggiunta di più acqua e permettendo nematodi a decantare. Questa fase può essere ripetuta 2 - 3 volte finché l'acqua è pulita.
- Posizionare sospensione nematode in un pallone di coltura tissutale (250 ml). Mantenere la concentrazione della sospensione di 1.000 - 3.000 nematodi / ml.
- Boccetta Store con sospensione nematode in una stanza fredda o in incubatrice tra i 10 - 20 ° C.
NOTA: controllare boccette memorizzati periodicamente durata di EPN è variabile. Di solito steinernematids possono essere conservati per 6-12 mesi senza il bisogno di subcoltura, che heterorhabditids possono richiedere più controlli periodici.
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Representative Results
Soil Sample Collection
Terza fase larve infettive di EPN sono le uniche fasi di vita liberi nel ciclo di vita di questi nematodi ', che risiedono nel terreno (Figura 1). Pertanto, la raccolta di campioni di suolo è un metodo molto efficace per il recupero di questi nematodi. Figura 4 mostra un profilo del terreno che indica la profondità alla quale devono essere prelevati campioni. Preservare l'umidità di un campione è un fattore chiave per la sopravvivenza dei nematodi. Di conseguenza, è importante mantenere campioni di terreno in sacchetti di plastica e mantenerli a basse temperature durante il trasporto al laboratorio (Figura 4).
Nematode Recovery
In natura, possibilità di trovare insetti naturalmente parassitato da EPN sono meno del 3%, a meno che non ci sia un'epidemia e un campione più ampio di insetti con EPN infestazione si trova. Pertanto, adescamento dei campioni di terreno con insetti è un appr convenienteoach per migliorare il recupero di EPN dal loro habitat naturale. figura 5 illustra la tecnica pasturazione suolo. In questo caso, è stato utilizzato un contenitore di plastica da 250 ml con tappo a vite. Circa 250 g di terreno sono stati collocati nel contenitore e di 5 - 10 G. mellonella larve sono stati aggiunti sulla superficie del suolo (Figura 5 a destra). Dopo 5 giorni, il contenitore è stato aperto per recuperare gli insetti morti con segni di infezione EPN. Avviso larve di nematodi-infettati con colorazione rossa (Figura 5 a sinistra).
Figura 6A mostra una rappresentazione schematica della trappola bianco modificato. Figura 6B illustra il set-up della trappola. Si noti che EPN cadaveri infetti non si toccano l'un l'altro e che carta da filtro nella piccola capsula di Petri rimane asciutto. Figura 6C mostra IJs emerge da cadaveri. Nota: le «tracce» di nematodi (IJ) che si formano sulla piastra di Petri che si muovono aWards l'acqua. Il tempo per IJ emergere da cadaveri è variabile a seconda della specie di nematodi e dipende anche dalla temperatura e umidità a cui la trappola bianco viene mantenuta. Figura 6D mostra IJs già in acqua del grande piatto di questa trappola. Osservare che i nematodi in acqua look pulito e privo di tessuti di insetti.
Figura 1. Ciclo di vita dei nematodi entomopatogeni.
Figura 2. Pale e altri dispositivi utilizzati per la raccolta di campioni di suolo. (A) punto-pala Classic. (B) la pala di mano. (C) Da sinistra a destra: tubo Viehmeyer, cazzuola, tubi Oakfield, defittonatrici suolo.
Strategie di campionamento Figura 3. Suolo. (A) stratificata. (B) casuale.
Figura 4. Rappresentazione schematica della strategia di campionamento del suolo. Immagine a sinistra mostra un profilo del suolo indica profondità desiderata alla quale devono essere prelevati campioni. Immagine di destra mostra un campione di suolo in un sacchetto di plastica con un'etichettatura appropriata.
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Figura 5. Macerazione dei campioni di terreno con larve di insetti. Immagine a destra mostra larve sane, mentre l'immagine a sinistra mostra larve morte dopo un periodo di adescamento 5 giorni.
Figura 6. Rappresentazione schematica (A) e fotografie (BD) di una trappola bianco modificato. (B) Trappola costituita; (C) stretta di cadavere infetto mostra IJ emergere, (D) close-up che mostra massiccia comparsa di IJs da cadaveri in acqua.
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Discussion
Questa manifestazione è la prima delle due presentazioni che descrivono una serie di tecniche che sono comunemente usati per lo studio EPN e dei loro batteri simbionti. Queste tecniche rappresentano passaggi fondamentali per la creazione di successo delle culture EPN in laboratorio e costituiscono anche la base per altri biotest che impiegano EPN come organismi modello per la ricerca.
Vari sondaggi del terreno di EPN hanno dimostrato che la loro abbondanza e la distribuzione può variare tra le stagioni, gli habitat e le regioni geografiche 4, 5,9,15. Fattori come la tessitura del suolo, contenuto di umidità e temperatura così come la disponibilità ospitante possono svolgere un ruolo chiave nella loro distribuzione. Pertanto, è fondamentale che a dati preliminari sulla rilevazione. Una volta prelievo, è importante che vengono elaborati il più presto possibile. Tuttavia, se questa non è una possibilità, essi devono essere conservati in una stanza fredda o altra unità appropriata temperatura controllata. Temperature diverse possono essereconsiderato per il deposito dei recipienti adescamento insetti seconda della provenienza dei campioni. Di solito, le temperature più fredde (ad es., 15 ° C) sono considerati per i campioni temperate e per i campioni provenienti dalle regioni tropicali, le temperature più calde (ad es., 30 ° C) sono per contemplato.
La tecnica insetto adescamento è il metodo più comunemente utilizzato per il recupero di EPN dai campioni di suolo. Si tratta di una strategia conveniente che consente il recupero di EPN in laboratorio. Ultimo instar larve del lepidottero maggiore cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) sono di solito considerati; Tuttavia, altri host insetti (ad esempio, grilli, vermi, larve di scarabeo, ecc) e / o fasi opportune possono essere considerati e si consiglia di usare. Alcuni studi hanno dimostrato che un singolo ciclo di estrazione del metodo Galleria-esca è spesso insufficiente per determinare la presenza di EPN in un particolare campione o per estrarre tutto il EPN dal campione di terrenos 15. Di solito, i tassi di recupero variano tra i 20 - 40% 12,15.
Un'alternativa al adescamento di campioni di terreno in laboratorio è la considerazione di adescamento in situ. Questo è il posizionamento di esche insetti nel sito di campionamento. In questo caso, gli insetti sono collocati in gabbie (di solito di un metallo o rete plastica) e sono lasciate in siti demarked nell'area di studio per un determinato periodo di tempo. Le gabbie con gli insetti vengono poi recuperati ed esaminati per l'infezione da EPN. Tuttavia, questo approccio è laborioso e richiede tempo 15.
La tecnica di intrappolamento nematode è stato originariamente progettato da White 10 e successivamente modificato da Kaya e della 6. La tecnica utilizza l'attrazione di nematodi per l'acqua (cioè, hygrotropism positivo) e recupera con successo stadi infettivi di EPN gratuitamente tessuti e / o residui di insetti.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri passati della Fotografico laboratorio: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta e Victoria Miranda-Thompson per il loro contributo al miglioramento di molti di questi protocolli. Noi riconosciamo il sostegno della National Science Foundation (sovvenzioni IOS-0840932 e IOS-0.724.978) a SP Fotografici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
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