Summary
Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.
Introduction
Büyük Drosophila Diskler (DLG), plazma membranının belirli bölgelerde büyük protein komplekslerinin montaj orkestra yardımcı proteinleri iskele ve zara bağlı guanilat kinaz ailesinin bir korunmuş üyesidir. Bir tümör baskılayıcı protein, Dlg epitel apicobasal polarite 1,2,3 önemli bir belirleyicisi olarak hizmet gibi Başlangıçta belirledi. Dlg da larva gelişimi 4 sırasında glutamaterjik motor nöron nöromüsküler bileşke (NMJ) bir ana iskele modülü olarak hizmet vermektedir. Dlg larva NMJ farklı roller oynar ve onun pleyotropizm birden proteinler 5,6 ile ilişkilendirmek için kendi yeteneklerine bağlıdır. Böyle bir protein, Hu-Li Tai shao (HTS), esas olarak, 7 hücre iskeleti aktin-spektrin düzenlemedeki rolleri ile ilgili olarak tarif edilmiştir, memeli adducins bir homologudur. Daha önce Dlg ve Hts, in vitro göre birbirleri ile bir kompleks meydana getirebilir gösterilmiştir 8 içeren ko-immünopresipitasyon deneyleri. Bu sonuçların bir eksiklik, ancak, bu karmaşık formlar göstermemektedir olmasıdır. Immünhistokimyasal kullanımı ile, Dlg ve Hts dağılımları larva NMJs postsinaptik membran üst üste görülmektedir, ancak bu bölgede 8 bir kompleks vardır? Son zamanlarda gösterilen ve daha burada ayrıntılı olarak, Proximity ligasyon Testi (PLA) larva NMJ 27 de özellikle Dlg ve Hts arasındaki in situ dernek bir bakmak için kullanılır.
PLA çok yerinde 9, protein-protein etkileşimlerini tespit edebilir, hücre ve doku kültürü içinde kullanılan nispeten yeni bir tekniktir. Bu deneyde, ilgi konusu iki protein karşı birincil antikor türe spesifik antikorlarla bir çift tespit edilir, oligonükleotidlere konjüge olduğu PLA problar olarak adlandırılan (Şekil 1A, B). İki protein halindes, bağlı PLA sondaları arasındaki mesafe iki ek bağlayıcı oligonükleotidler (Şekil 1C) melezlenmesi ile köprülenebilir (nanometre bir kaç on içindeki) birbirine yakın temas içindedir. Bu uyum, bağlayıcı oligonükleotidler serbest uçları, her biri bir diğeri ile temas için yeterince yakın olan ve bir kapalı dairesel bir DNA molekülü, in situ ligasyon (Şekil 1D) üzerine oluşturulabilir. dairesel bir DNA molekülü PLA probları (Şekil 1E) konjüge edilmiş oligonükleotidlerin bir kişi tarafından hazırlanmış olan yerinde yuvarlanan çember amplifikasyonu için bir şablon olarak hizmet vermektedir. Elde edilen çoğaltılmış, concatemeric DNA ürününün içinde sekanslar daha sonra floresan etiketli tamamlayıcı oligonükleotid prob (Şekil 1F) ile görselleştirilebilir. Yükseltilmiş DNA PLA problarının bir protein-protein etkileşimi withi hücre içi lokalizasyonu bağlı kalır yanana doku kolayca tespit edilebilir.
Çeşitli yöntemler yaygın olarak, ko-immünopresipitasyon olarak in vitro teknikler de dahil olmak üzere protein-protein etkileşimlerini tespit (-aşağı çekme deneyleri ve maya iki-hibrid eleme ve bu Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) ve Biyomoleküller Floresan tamamlama gibi in vivo teknikler kullanılır BiFC). In vitro teknikler hatadır etkileşimi endojen nerede oluştuğunu Anılan in vivo teknikleri kendi endojen meslektaşları yerli davranışını yansıtmıyor olabilir füzyon proteinlerinin yapay ifadesini içerir iken onlar, tespit kalmamasıdır. PLA bir avantaj da FR karşılaştırılabilir olan bir sinyal üretmek için gerekli olan yakınlık derecesine sahip, bir doku içinde, birbirine çok yakın olan ve büyük olasılıkla bir kompleks oluşturan endojen protein uygulayıcı hücre içi lokalizasyonu belirleme kapasitesine sahip olmasıdırET ve BiFC. PLA nedeniyle antikor tanıma ve DNA amplifikasyonu bağlanması yüksek özgüllük ve duyarlılık ile etkileşimleri algılayabilir. Böylece, tahlil etkileşim kesin konumunu ortaya puncta şeklinde ayrık, parlak sinyaller üretebilir. Buna ek olarak, zor görülen antijenler tespit edilebilir. Son olarak, PLA gerçekleştirmek için nispeten basit bir tekniktir ve tamamlamak için standart bir immünohistokimyasal prosedürde daha uzun sürer. Bu nedenle, PLA genellikle uzun hazırlık süreleri ve kapsamlı sorun giderme ile boğulmuş diğer protein-protein etkileşimleri deneyleri üzerinde bir teknik avantaj sağlar.
Bu protokol, PLA yerinde endojen protein-protein etkileşimlerini tespit etmek amacıyla, Drosophila larva NMJ uygulanabilir gösterilmiştir. Burada, PLA Dlg ve Hts gerçekten NMJs postsinaptik bölgede bir kompleks var olduğu gösterilmiştir larva vücut duvarı kas hazırlıkları yapılır. PLA önce larva NMJ incelemek için kullanılan olmamıştır, ve Drosophila dokusunda bu testte kullandık yayınlanan bildiri sadece bir avuç şu anda vardır. Bu Drosophila topluma PLA daha pozlama başka, daha yaygın olarak kullanılan protein-protein etkileşimleri deneyleri tamamlamak için ek bir araç olarak artan kullanımı neden olacağı ümit edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vücut Duvar Hazırlık
. NOT: Daha önce Brent ve arkadaşları 10, ya da Ramachandran ve Budnik ağacının 11,12 tarif edildiği gibi (vücut duvarı kasları innerve NMJs bir çalışma için), üçüncü evre larvaların gövde duvarları hazırlanması ancak bazı tadilatlar ile, gerçekleştirildi.
- Teşrih
- Standart prosedürler kullanılarak 13 beş-altı gün boyunca 25 ° C'de sinek stokları ve haçlar kaldırın.
- İnce forseps kullanarak şişeleri ya da şişe Üçüncü dönem larva tarama seçin.
- Herhangi bir gıda parçacıkları çıkarmak için fosfat tamponlu salin (PBS) ihtiva eden küçük bir Petri kabındaki larvaları yıkayın.
- Sylgard diske tek larva yerleştirilir ve buz soğukluğunda PBS birkaç damla içinde bırakın. Buz gibi soğuk PBS işlemek için daha kolay hale larva stun yardımcı olacaktır kullanma. Diseksiyon boyunca, hazırlık her zaman kurumasını önlemek için PBS batmış olduğundan emin olun.
- La yerleştirindorsal tarafı, iki trakea yolları bir mikroskop (Şekil 2A) altında görünür şekilde yukarı bakacak şekilde RVA. Forseps kullanarak, bir minutien pimi kavramak spiracles (Şekil 2B) yakınında arka ucunda larva aşağı pin. Başka bir iğne ile, ağız kanca yakın ön ucundaki manikür delip. Yavaşça, sonra boyuna larva germek (Şekil 2B) aşağı pin.
- Mikrodissek- makas kullanarak, küçük bir açıklık oluşturmak için pin yakın arka ucunu çimdik. kesi sadece manikür geçmesine yeterli yüzeysel olmalıdır.
- İki trakea yolları (Şekil 2C) arasındaki dorsal orta hat uzunluğu boyunca kesilmiş, kesi içine makas alt bıçak ucu yerleştirilmesi. Ventral vücut duvarı kasları zarar vermemek için keserken hafifçe yukarı doğru makas bıçakları yöneltin.
- Biraz mesaja ön bir küçük yatay kesi yapmakeriorly yerleştirilmiş pim (Şekil 2C). Benzer başka bir kesi biraz öne yerleştirilmiş pim (Şekil 2C) posterior olun. kesiler sadece manikür geçmelidir.
NOT: Bir benzemelidir kombine adımlar 1.1.7 ve 1.1.8 üç kesiler "
Tamamlandığında ", yani, larva vücudunun sırt tarafında bir sol ve sağ kanat imal edilmelidir. - Dikkatle forseps ile iç organları dışarı temizleyin. PBS birkaç damla kuvvetli ekleme, larva vücut dışına organları yerinden böylece daha kolay bunları kaldırmak için yapım yardımcı olacaktır. Vücut duvarı kasları zarar verir gibi larva vücudu alay kaçının.
- Açık larva vücudu fora ve aşağı köşeleri (Şekil 2B) pin. Iğneleme zaman eşit olarak gerilmiş bir dikdörtgen oluşturmak üzere yatay ve dikey olarak gövde duvarını streç (see Şekil şekil için 2G), dikkat çekici sürecinde vücut duvarı kasları gözyaşı değil.
- Kalan iç organları (Şekil 2E) kaldırarak bitirin.
- Sabitleme ve Permeabilization
- Bouin Çözüm birkaç damla tutturulmuş beden duvarları daldırın. Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin. Seçenek olarak ise, alternatif bir sabitleyici olarak% 4 paraformaldehit (PFA) kullanır; 30 dakika kuluçkada bırakın.
- Triton Fosfat Tamponu Tuzlu Su (PBT) ile üç kez yıkayın.
- Ince forseps kullanarak, dikkatli işaretçilerine kaldırmak ve bir silikonlu 0.65 ml mikrosantrifüj tüp içine köşesinden beden duvarları aktarın.
- PLA için hazır olana kadar 4 ° C'de PBT gövde duvarı saklayın. En iyi sonuçlar için, bir gün veya diseksiyon iki içinde beden duvarları immün başlar.
NOT: reaktif tasarruf etmek ve tüm vücut duvarları tahlil sırasında eşit muamele sağlamak için, farklı genotip tek yerleştirilebilirtüp. Genotipleri (örnekler için Şekil 2F bakınız) farklı beden duvarları köşelerini keserek ayırt edilebilir.
Tamamlandığında ", yani, larva vücudunun sırt tarafında bir sol ve sağ kanat imal edilmelidir. 2. İmmünohistokimya
Not:. Üçüncü instar larva gövde duvarlarının immün önce Brent ve diğerleri, 14 ve Ramachandran ve Budnik ağacının 11'de tarif edildiği gibi gerçekleştirildi, ancak bazı değişiklikler 11,14 ile yapıldı.
NOT: Aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında ve yumuşak çalkalama ile tüm adımları.
- Bloke etme
- 10 dakika her PBT ile üç kez vücut duvarları yıkayın.
- 1 saat süre ile% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloke edin.
- Immün
- İlgili iki proteinlere karşı fare, tavşan, birincil antikorlar ile gövde duvarı inkübe, oda sıcaklığında 2 saat, ya da gece boyunca 4 ° C'de (% 1 BSA içinde seyreltilmiş). 250 tavşan a: Bu durumda, 01:10 Fare anti-Dlg 1 kullanımınti-HtsM 15,16. Olmayan fare ya da tavşan yapılır markerlere karşı antikorlar da dahil edilebilir - örneğin 1 kullanın: 200 keçi anti-HRP nöronal membranları araştırmak.
- 10 dakika her PBT ile üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 2 saat, ya da gece boyunca 4 ° C'de (% 1 BSA içinde seyreltilmiş) ile markalama maddeleri tespit etmek için florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. Keçi anti-HRP antikoru saptamak için 200, FITC-konjuge anti-keçi, örn: 1 kullanmak - PLA sinyali, daha sonra kırmızı bir florofor ile görüntülenmiştir, başka bir flüorofor işaretleyici tespit etmek için kullanılmalıdır. Nedeniyle ışığa duyarlı reaktiflerin kullanılması ile, Bu noktadan itibaren karanlıkta tüpleri tutun.
NOT: PLA konfokal mikroskobu altında kırmızı kanalda görsel sinyal ile, fare ve tavşan büyüdü primer antikorlar arasında gerçekleştirilecek için kullanılan kiti izin verir. Arzu edildiği takdirde, diğer kitleri deney primadonnanın ile yapılması için izin vardırry antikorlar diğer türlerde kaldırdı, ve sinyal diğer kanallar görsel.
3. Proximity ligasyon Testi
NOT: Aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında ve yumuşak çalkalama ile tüm adımları.
- PLA Sondalar
- 10 dakika her PBT ile üç kez vücut duvarları yıkayın.
- 37 ° C'de 2 saat süre ile (5 seyrelti,% 1 BSA içinde, her biri 1) PLA probları ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için PLA sistemi anti-fare eksi 40 ul, PLA sistemi anti-tavşan PLUS 40 ul% 1 BSA, 120 ul kullanın. PLA bir prob 1:25 seyreltme kadar devam (bu deney için, yani,) uygun bir sinyal-gürültü oranı elde edilmesine neden olabilir.
- Ligasyon
- 5 dakika her biri için iki kez Yıkama Tampon A ile gövde duvarı yıkanır.
- 1 saat için a bağlama çözeltisi (bağlama tamponu içinde Ligase 1:40 seyreltme) ile inkübeT, 37 ° C'dir. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için Ligase 5 ul, 5 ligasyonu tampon maddesi 40 ul ve yüksek saflıkta su 155 ul kullanın.
- Amplifikasyon
- 2 dakika her iki Yıkama Tampon A ile beden duvarları yıkayın.
- 37 ° C'de 2 saat boyunca amplifikasyon solüsyonu (Amplifikasyon tamponu Polimeraz 1:80 seyreltme) ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için Polimeraz 2.5 ul 5 Amplifikasyon tamponu 40 ul ve yüksek saflıkta su 157,5 ul kullanın.
- Görüntüleme için hazırlık
- 10 dakika her biri için iki kez Yıkama Tampon B ile gövde duvarı yıkanır.
- 1 dakika boyunca bir kez 0.01x Yıkama Tampon B ile yıkayın.
- Montaj önce en az 30 dakika boyunca monte çözeltisinin bir kaç damlası dengeye ya da 4 ° C'de bir gece boyunca muhafaza ediniz.
- Ince forseps kullanarak, dikkatli bir platformu slayt w üzerine beden duvarları aktarmaki kendi tırnak etlerini aşağı bakacak. Satır ve mountant bir damla ya da iki içinde aynı yönde beden duvarları yerleştirin. Daha sonra şeffaf tırnak cilası ile slayt mühür, hava kabarcıkları üretmek için değil hazırlık alarak bakım üzerinde 22 mm x 40 mm lamel yerleştirin.
- Konfokal görüntüleme için hazır olana kadar -20 ° C'de karanlıkta slaytlar saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yabani tip Üçüncü dönem larva NMJs ise, Dlg ağırlıklı tipi boutons mı daha Dlg immünoreaktivite düzeyleri tip Ib boutons daha belirgin olmak, tip I glutamaterjik boutons postsinaptik membranda bulunan (Şekil 3A) 4. Hts kas boyunca mevcut ama Hts immünoreaktivite düzeyleri hem tip I boutons eşit görünen ile postsinaptik bölgede yoğunlaşır ve aynı zamanda (Şekil 3A ') 8,17 presynaptically bulunur. Dlg ve Hts dağılımları ölçüde postsinaptik bölgede (Şekil 3A '') 8 üst üste unutmayın.
Dlg ve Hts NMJ bir kompleks var olup olmadığını belirlemek için, PLA iki protein arasındaki larva vücut duvarı kas hazırlıkları yapıldı. Bu deneyde, N-terminalinde ve bir tavşan anti-HtsM antikoru ikinci PDZ alanı tespit eden bir fare anti-Dlg antikoru içinC-terminalinde myristoylated-homoloji alanı 15,16 kullanılmıştır tespit eder. Yabani-tip, Dlg ve Hts arasında PLA sinyali özellikle NMJ (Şekil 3C-C "') de gözlendi. Sinyal daha çok böylece Dlg ve Hts birbirine yakın olan ve büyük olasılıkla postsinaptik bölge bir kompleks meydana belirten HRP ile demarked edildi tip I boutons, presinaptik zar çevresel olarak lokalize. Sonuç HTS immünoreaktivite eksikliği HTS 01103 mutant NMJs içeren Negatif kontrol olarak spesifik olarak tespit edilmiştir (Şekil 3B-B "'), gözle görülebilir bir PLA sinyali (Şekil 3D), 8,17,18 göstermiştir. Buna ek olarak, PLA (veriler gösterilmemiştir) sinyal elde tavşan anti-HtsM antikor eklenmeden gerçekleştirilmiştir. Boutons Yüksek büyütme manzarası Dlg ve Hts immünoreaktivite fena halde postsinaptik bölgede üst üste ortaya (Şekil 3E)İki protein arasındaki PLA ise toplam Dlg ve Hts proteinin sadece bir alt kümesi kompleks (Şekil 3F) olduğuna işaret gizli puncta sonuçlandı.
Daha larva NMJ çalışma için bir araç olarak PLA güvenilirliğini test etmek için, biz de serin / treonin p21-aktive kinaz, Pak ve diğer sinaptik proteinlerin 19 arasındaki etkileşimleri değerlendirilmiştir. Önceki ko-immünopresipitasyon deneyleri Pak Dlg de üye 20 olduğu Çiziktir kompleksinin bir üyesi olduğunu göstermiştir. Vahşi tip NMJs olarak Pak Dlg lokalizasyonu 15,21 için gerekli olan sinaptik sonrası yoğunluğuna (Şekil 4A, C) olarak lokalize eder. Pak ve Dlg immünoreaktif dağılımları özellikle NMJ (Şekil 4B) ile pozitif bir sinyal ile sonuçlanırken, iki protein arasındaki postsinaptik bölgede bulundu (Şekil 4A '') üst üste ve PLA. Bu sonuçlar, iki proteinin C olduğunu göstermektedir birbirlerine yakınlığı kaybeder ve muhtemelen bu bölgede bir kompleks oluşturmaktadır. Biz bağlama Pak kompleksi için test başka sinaptik proteini Kanatsız (WG), NMJ 22 çok sayıda rol oynar Drosophila Wnt ligand olmuştur. Yabani-tip, ig bir BOUTONS Çeşidi presinaptik ve postsinaptik taraftan zenginleştirilmiş, aynı zamanda kas sitoplazma (Şekil 4C '), 23 boyunca puncta olarak mevcut olmaktadır. Pak ve WG immünoreaktif dağılımları kısmen postsinaptik bölgede bulundu (Şekil 4C '') üst üste katlandı, İlginçtir, PLA iki protein arasında gözlenebilir bir sinyal (Şekil 4D) üretilmiştir. Bu nedenle, Pak ve ig NMJ birbirine yakın değildir. Bu sonuç, geleneksel yardımcı belirleme deneyleri ile çakışan immunoreaktivite gösteren tüm proteinlerin bir PLA bir sinyal üretir göstermektedir ve ek bir negatif kontrol olarak hizmet etmektedir.
Her zaman ">:" tutmak-together.within-sayfa = fo "ent
Şekil 1: Proximity ligasyon Testi şematik diyagramı. (A) Temel antikorlar, standart prosedürler kullanılarak immünohistokimyasal ilgi iki proteinlerine bağlanır. (B) primer antikorlar daha sonra türe spesifik antikorlarla bir çift tespit edilir, oligonükleotidlere konjüge olduğu PLA problar olarak adlandırılan. (C) iki protein birbirine yakın olan, ekli PLA sondaları arasındaki mesafe iki ek bağlantı oligonükleotid hibridizasyonu ile köprülenebilir. (D), uyum, bağlayıcı oligonükleotidler in situ ligasyon üzerine bir kapalı dairesel DNA molekülü oluşturabilmektedir . (E) dairesel bir DNA molekülü oli biri ile hazırlanmış bir halka çoğalışı, haddeleme yerinde için bir şablon olarak hizmetYükseltilmiş DNA ürünü içinde PLA probları konjüge gonucleotides. (F) sekanslar, daha sonra, flüoresan-işaretli tamamlayıcı bir oligonükleotid prob ile tespit edilir. Şekil Weibrecht ark., 24 dayandığını unutmayın. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 2: Üçüncü dönem larva beden duvarları hazırlanması. Anterior ve posterior uçlarında (AF), bir vücut duvarı diseksiyonu temsil şematik çizimler. (A), sırt tarafı, iki trakea yolları görünür şekilde yukarı bakacak şekilde bir sylgard diske tek bir larva yerleştirin. (B) Pim larva aşağı sürecinde boyuna larva dışarı uzanan minutien pimleri ile. (C) (D) bir eşit gerilimli dikdörtgen oluşturacak şekilde sürecinde hem yatay hem de dikey olarak vücut duvarı germe, açık larva vücudu fora ve aşağı köşeleri pin. (E) benzemelidir dışarı kalan iç organları. (F) Gösterildi farklı genotipleri ayırt etmek için beden duvarları köşe kesmek için farklı şekillerde örnekleridir. gerilmiş vücut duvarı hazırlık (G) Görünüm tamamlandı. resim mikroskop üzerine monte edilmiş bir dijital kamera ile çekilen edilmiştir. Panel F Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder. Şekil Ramachandran ve Budnik ağacının, 2010 12 dayandığını unutmayın. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3:. Dlg ve Hts 'mutant NMJs vahşi-tip Dlg (kırmızı) ve Hts (yeşil) dağılımları ve hts (AA. Larva NMJs postsinaptik bölgede bir kompleks (AB') 'mevcut') wild NMJs tipi, Dlg ağırlıklı Dlg düzeyleri boutons mı daha tip Ib daha belirgin olmak, tip I boutons postsinaptik membran bulunur. Hts kas boyunca mevcut değil, aynı zamanda Hts düzeyleri hem tip I boutons benzer olmak, postsinaptik bölgenin çevresinde yoğunlaşmaktadır. Dlg ve Hts dağılımları postsinaptik bölgede. (BB '') HTS için NMJs mutant Hts immünoreaktivite eksikliği de örtüşüyor. Hts 01103 mutasyon etkileri NMJ 8 dallanma unutmayın. (CD ') Dlg ve Hts arasında PLA (kırmızı) Vahşi-tipi üzerinde gerçekleştirildi ve mutant NMJs hts. Hrp nöronal membranı (yeşil) belirtmek için kullanılmıştır. Birkaç boutons. (CC ''), vahşi tip daha yüksek büyütülmüş görüntüleri gösterilmiştir PLA sinyali NMJ özellikle gözlenir. Sinyal daha çok Dlg ve Hts birbirine yakın olan ve postsinaptik bölgede bir kompleks içinde yer aldığını göstermektedir, tip I boutons presinaptik zar çevresel olarak lokalize olur. HTS için (D) NMJs mutant gözlemlenebilir PLA sinyal gösterdi. proteinlerin sadece bir alt kümesi bir kompleks olduğunu belirten (EF) tek boutons yüksek büyütme görünümleri gösterilmiştir. (E) postsinaptik bölgede Hts ve Dlg immünoreaktivitesinin ağır örtüşme. ayrı puncta içinde Dlg ve Hts sonuçlar arasındaki (F) PLA . 'Paneli B Ölçek çubuğu' ('40 mikron AB) temsil'; 'Paneli D ölçek çubuğu' ('10 mikron CD) temsil'; scalPanel F e çubuğu 5 mikron (EF) temsil eder. Gösterilen tüm NMJs 4. Görüntüler NIS-Elements yazılımı ile Nikon A1R lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak birleştirilmiş yığınlar olarak alınır, ve Adobe Photoshop ile işlendi karın segmentinde kasların 6/7 vardır. büyük halini görmek için buraya tıklayınız rakam.
Şekil 4: Pak larva NMJs postsinaptik bölgede, WG Dlg ile bir kompleks var, ancak gösterilen (AD) bir kaç boutons yüksek büyütme görünümleridir (AA '') Pak (yeşil) ve Dlg ve dağılımları (.. yabani tip NMJs kırmızı). Pak postsinaptik yoğunluğa lokalize eder. Pak ve Dlg ve immünoreaktif dağılımları postsinaptik bölgede üst üste unutmayın. (B) PLA between Pak üzerine yüklenebilir ve Dlg (kırmızı), vahşi tip NMJs gerçekleştirilir. PLA sinyali, iki proteinin bu bölgesinde birbirlerine yakın olduğunu gösteren NMJ özellikle gözlenir. (CC ') vahşi-tür NMJs olarak Pak (yeşil) ve Wg (kırmızı) için. Ig NMJ presinaptik ve postsinaptik yanların her ikisinden de zenginleştirilmiş, aynı zamanda kas boyunca puncta olarak mevcut olmaktadır. Pak immünoreaktif dağılımı da kısmen postsinaptik bölgede Wg ile üst üste görülmektedir unutmayın. Pak ve Wg (kırmızı) arasındaki (D) PLA yabani tip NMJs üzerinde gerçekleştirdi. Belirli bir PLA sinyali, iki proteinin örtüşmesi rağmen NMJ birbirine yakın olmadıklarını gösteren gözlenir. Panel D Ölçek çubuğu 5 mikron (AD) temsil eder. Karın segmentinde innerve tüm NMJs kasları 6/7 4. Görüntüler NIS-Elements yazılımı ile Nikon A1R lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak birleştirilmiş yığınlar olarak alınır, ve pro edildiAdobe Photoshop ile işlenir. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu rapor PLA Drosophila larva NMJ uygulanabilir gösterilmiştir. Deney NMJ endojen protein-protein etkileşimlerini tespit etmek amacıyla larva vücut duvarı kaslarında gerçekleştirilir. Bu teknik ile, Dlg ve Hts birbirine yakın olması ve bu nedenle, özellikle postsinaptik bölge 27'de, bir kompleks içinde bulunması gösterilmektedir. Bu sonucun desteklemek, bir önceki çalışmada aşağıdaki verileri ile dernek kanıtlar sunmuştur: Dlg ve Hts immünoreaktif dağılımları larva NMJs postsinaptik bölgede üst üste 1), 2) Dlg ve Hts ko- dayalı bir kompleks oluşturur immunoprecipitation tüm yetişkin lizatlarını uçmak içeren deneyleri, ve 3) Dlg ve Hts epitel ve sinaptik kavşaklarda 8 hem de etkileşim. Postsinaptik bölgede PLA sinyali de Dlg ve Pak, daha önce başka çalışmalarda belirlenen bir etkileşim arasında gözlenmiştir, böylece daha crede sağlayanNMJ 15,20,21 bu tahlili kullanarak ım. İlginçtir, Pak ve Wg arasında PLA kendi İmmünoreaktif dağılımları NMJ üst üste olsa, hiçbir gözlemlenebilir sinyal sonuçlandı. Bu sonuç, immünoreaktif birbirine çok göstermektedir tüm proteinleri dolayısıyla PLA geleneksel ko-lokalizasyon çalışmaları dışındaki protein-protein etkileşimlerinin saptanmasında daha yüksek bir çözünürlük sağlayan belirten bir PLA bir sinyal üretir göstermektedir.
Birden çok değişiklik larva NMJ için tahlil optimize etmek için orijinal PLA protokole yapılan 9,25 (veriler gösterilmemiştir). İlk olarak,% 1 BSA gövde duvarlarının yerine Resim bloklama çözeltisi için daha iyi bir bloke edici madde olduğu tespit edilmiştir. İkinci olarak, reaksiyon çözeltilerinde gövde duvarlarının güçlü bir sinyal-gürültü oranı, uygun bir daldırma ve karıştırma elde etmek için kritiktir. 0.65 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 5-10 gövde duvarları 200 ul en az için müsait görüldüDaha fazla beden duvarları işlerken hacimleri buna göre artmış olabilir ama le, PLA sondalar, ligaz veya polimeraz ile inkübe zaman. Sinyal gücü de tavsiye kere 30 dakika reaksiyon sürelerini artırarak tarafından geliştirilmiştir. Üçüncü olarak, PLA probları bir seri seyreltme testi reaktif korunması ve sinyal kuvveti arasındaki dengeyi optimize etmek için yapıldı. Tavsiye 1 - kadar 1:25 seyreltme, bu raporda yapılan deneyler için: 5 dilüsyon - yine de makul bir sinyal-gürültü oranı üretebilir. Ligasyon ve amplifikasyon reaksiyonları elverişli hale getirilmesinin dikkat yapılmamıştır. PLA dakika değişikliklerine duyarlı olabilir Son olarak, bu güçlü kontroller ve deneyler sırasında tahlil eşit muamele böylece tek bir deney farklı genotip tek bir tüp yerleştirilir önerilir. Genotipler farklı beden duvarları köşelerini keserek ayırt edilebilir.
Several yöntemler maya iki-hibrid eleme, ko-immünopresipitasyon ve FRET de dahil olmak üzere, Drosophila, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılır. Ancak bu yöntemler PLA ve yerinde protein-protein etkileşimleri görselleştirmek için yeteneği karşı nasıl karşılaştırılır? Maya iki-hibrit maya içinde ifade edilen Drosophila proteinleri arasındaki bağlanma doğrudan tespit edebilir ve bu, yüksek verimli genom ekranlarında kullanılmıştır. Belirlenen etkileşimlerin birçok biyolojik ilgili olmasına rağmen, tahlil genellikle yanlış pozitif üretir. Buna ek olarak, yanlış negatif çok nedenlerle oluşabilir: proteinler bağlanmasına müdahale edebilir transkripsiyon faktör etki ile birleştirildiği, bir çok etkileşim translasyon sonrası mayada oluşmaz değişiklikler ve (deney yapılır) çekirdeği gerekli olabilir Bazı etkileşimler düzgün oluşturmak için uygun bir ortam değildir. Onların yerli Envir endojen proteinler ile fırsatlar gibi konular PLA ile karşılaştı değilonment. Endojen proteinleri arasındaki etkileşimi saptamak için kullanılabilir bir yöntem, ko-immünopresipitasyon olup. Drosophila lizatlarını içeren deneyler bir etkileşim meydana geldiği yaşam döngüsü içinde doku ve sahne ortaya çıkarabilir. Lizat oluşumu proteinleri çıkarmak için hücrelerin parçalanmasıyla kapsadığından, etkileşim meydana geldiği doku içindeki hücrelerinin yanı sıra hücre-altı lokalizasyonu, değerlendirilemeyen - PLA aksine. İlave olarak, ortak-immüno bağlayıcı protein kompleksi tespit eder ve kompleks içindeki proteinler, birbirine çok yakın olan ayırt edemez. Hücre içinde, protein-protein etkileşimleri görüntülenmesine olanak vermek Drosophilists kullanılabilir örneğin FRET gibi yöntemler bulunmaktadır. Ancak, FRET floresan etiketleri kaynaşmış transgenik proteinlerin aşın içerir ve PLA gibi endojen protein davranışını yansıtmayabilir.
Kendi avantajlarına rağmen, bazı limitat vardıriyonları PLA kullanırken. Böyle bir sınırlama, farklı türlerde yapılan faiz proteinlere karşı birincil antikor bulunmasıdır. Onlar endojen etkileşim gerçekten temsil olmayabilir ama bu sorun kolayca, etiketli transgenik proteinlerin kullanımı ile atlatılabilir. Başka bir sorun, iki primer antikorlar sterik birbirine veya birincil antikor bir epitop, protein-protein etkileşimi sitesi içerdiğinde engel zaman PLA, örneğin negatif bir tepki üreten olmasıdır. PLA birbirine yakın olan proteinleri tespit olsalar da, bu açılan tahlilleri ve maya iki-hibrid eleme farklı olarak, doğrudan veya dolaylı olarak protein-protein etkileşimleri arasında ayırım yapmaz. Ayrıca, endojen proteinler arasında PLA etkileşim için sorumlu olduğu alanlar tespit olmayacaktır. Bu nedenle, diğer protein-protein etkileşimi tahlilleri hala tam olarak etkileşime karakterize etmek için gerekli olacaktır molecularly.
Araştırmacılar nanometre onlarca 26 elde edilme kararları ile, Drosophila larva NMJ mekansal mimarisini haritaya süper çözünürlük mikroskopi kullanılarak başlamıştır. PLA, onun karşılaştırılabilir moleküler çözünürlüğe sahip, düşük maliyetli, NMJ sayısız proteinlerin örgütün ayrıntılı bir görünüm kadar bina yardımcı olacak bu çalışmalara teknik olarak basit bir tamamlayıcı sağlamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz sinek stokları sağlamak için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ederiz. Biz de antikorlar sağlamak için Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası ve Dr. Lynn Cooley (Yale Üniversitesi) teşekkür ederim. Özel bir teşekkür yazının üzerine ona yardım için AhHyun Yoo gider. Bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (Krieger), William ve Ada Isabelle Çelik Fonu (Krieger) ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (Harden) hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
- Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
- Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
- Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
- Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
- Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
- Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
- Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D.
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
- Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
- Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
- Bokoch, G. M.
- Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
- Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
- Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
- Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).
