Lokalisering, Identifiering och Excision av murina Fett Depåer

Summary

På grund av den drastiska och negativa samband mellan fetma och andra sjukdomstillstånd, forskning om vilken roll fett spelar i sjukdom och hälsa är motiverad. Vi presenterar ett protokoll för isolering och excision av fettdepåer som möjliggör studier av fett med in situ och in vitrometoder.

Abstract

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Introduction

Fett gjorde en anmärkningsvärd utseende i media, på grund av fetma dramatiska ökning under de senaste decennierna av 20-talet. Fetma drabbar idag mer än en tredjedel av de vuxna och 17% av barn och ungdomar i USA (US) ^1. Spänner alla etniska grupper, har statistisk forskning kring fetmaepidemin visat att icke-spansktalande svarta har den högsta åldersjusterade fetman (49,5%) jämfört med mexikanska amerikaner (40,4%), alla Hispanics (39,1%) och icke- Hispanic vita (34,3%) ^2. Den ekonomiska effekten av fetma är också ett växande problem för sjukvården. År 2012 uppskattades det att den årliga medicinska kostnaderna för vård för fetma i USA under 2005 var $ 190.200.000.000, nästan 21% av den totala budgeten medicinska utgifter. Tyvärr var barnfetma uppskattas vara ansvarig för 14 miljarder dollar i direkta sjukvårdskostnader ensam. Statist, bestämdes det att den genomsnittliga medicinska kostnaderna förindivider med fetma var $ 2741 högre per år än de utan denna sjuklighet ^3-5.

Fetma är en stor riskfaktor för en rad olika tillstånd såsom: typ 2-diabetes, höga blodfetter, hjärt-kärlsjukdomar, cancer, muskel- och skelettsjukdomar och kronisk inflammation. Fetma är djupt knuten till patogenesen av metabola syndromet och andra kroniska sjukdomar ^6-8. Med sådana drastiska och negativa kopplingar mellan fetma och andra sjukdomstillstånd, har vetenskaplig forskning fokuserad uppmärksamhet för att bättre förstå den pågående epidemin och de olika och avgörande roller spelas av fett.

Historiskt var fettvävnad anses oviktiga och sågs bara som en enkel fyllning vävnad. För närvarande har fett visats spela många viktiga roller i kroppens funktion i: ämnesomsättning, hormonreglering, inflammation, skydd och isolering ^9. Fettvävnad består främst avadipocyter men innehåller också pericyter, endotelceller, monocyter, makrofager och pluripotenta stamceller ^8. Fettvävnad distribueras i hela kroppen i olika depåer. De huvudsakliga depåer kan hittas subdermalt, subkutant, intramuskulärt, och viscerally ^10. Fett depåer har visats ha depå specifika metaboliska profiler, som har visat en depå specifik känslighet för fetma och relaterade sjukdomar ^8.

Traditionellt har fettvävnad klassificerats i två huvudtyper: vit fettvävnad (WAT) och brun fettvävnad (BAT); även nyare litteratur indikerar närvaro av en tredje grupp döpte brite eller beige fett ^11. Fettvävnad har visat sig ha olika färger, morfologier, metaboliska funktioner, biokemiska egenskaper och genetiska uttrycksmönster ^10. Adipocyter i WAT har en enda, stor lipiddroppe och varierande mängder mitokondrier. WATär dominant finns i subkutana och viscerala orter i kroppen. WAT fungerar främst som ett område av energilagring och skyddsorgan. Adipocyter i BAT har en multilocular morfologi och rikliga mitokondrier. BAT ligger främst i nacken och stora blodkärlen i bröstkorgen, liksom scapulae ^12. BAT fungerar främst inom energi spilla beteenden som reglerar thermogenesis ^7. Brite eller beige fett har visat sig dela en analog morfologi och uttryck till BAT men har visat sig vara härstammar från vita adipocyter ^11.

Den beskrivna kirurgisk metod i detta manuskript ger forskarna med kapacitet att analysera olika effekter att faktorer som: miljö, läkemedel och genetik, har på fett; samt den gynnsamma eller skadliga roll adipose spelar i sjukdom och hälsa. Dessutom, för att tillhandahålla ett sätt att identifiera och isolera olika typer av fettvävnad tillmöjliggöra bättre förstå de biokemiska relationer och skillnader mellan depåer. Detta kan hjälpa till att bestämma sambandet mellan plats, funktion, och olika typer av fett i kroppen. Denna beskrivna metod åstadkommer detta genom att tillhandahålla organ för grov visualisering, genuttrycksanalys, proteinexpressionsanalys, histologisk undersökning, och isolering av primära celllinjer för in vitro-studier. För närvarande finns det många artiklar som ger insikt i det metabola beteende olika fettdepåer, samt deras anatomiska platser; men ger inte en djupgående metod för att specifikt lokalisera, identifiera och isolera dessa depåer. Denna kirurgisk metod ger en exakt teknik som möjliggör isolering av flera depåer med en minimal mängd dissekering och föroreningar jämfört med andra metoder avsedda för isolat av en eller två depåer ^13-14.

Målet med detta protokoll är att geen exakt metod för identifiering och isolering av olika typer av fettdepåer från flera anatomiska ställen.

Protocol

OBS: Alla djurförsök utfördes med godkännande av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Cincinnati och i enlighet med vägledningen för vård och användning av försöksdjur från National Institutes of Health (NIH publikation Inga . 85-23, reviderad 1996). 1. Euthanize och Sterilisera Mouse Placera musen i en fördelningsväxellåda innehållande en supratheraputic dos av isofluran och tillåta att inhalera till verkan. När musen avl…

Representative Results

Identifiering och lokalisering av inguinal subkutan fettvävnad, interscapular brunt fett, visceral epididymal fett (figur 1), samt aortabågen perivaskulära fett, bröstkorg aorta fett, suprarenala aorta fett och infrarenala aortafett (Figur 2) uppnåddes framgångsrikt använder den beskrivna kirurgiska metoden. Histologisk undersökning och differentiering mellan BAT och WAT prover bedömdes positivt med hjälp hematoxylin och eosin (H & E) färgning (Figur 3). …

Discussion

Fetma kan leda till en stor mängd morbiditeter och full förståelse för den roll som fett spelar är inte helt klar; därför fortsatt forskning inom området fett är nödvändigt. Djurmodeller, speciellt musmodeller är idealiska för inledande forskning i utvecklingen av sjukdomar och testning av potentiella läkemedelsbehandlingar. Vid användning av dessa modeller är exakt isolering och excision av fettdepåer ett oerhört viktigt och nödvändigt verktyg i studiet av patologi adipösa drabbade sjukdomar.

<…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	Warm in waterbath before putting on tissue
2 mL microcentrifuge tubes	Midsci	MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK